CongelamentoCongelamento

Banche di cellule per preservare le Banche di cellule per preservare le nostre cellule sia da contaminazioni nostre cellule sia da contaminazioni che dall’invecchiamento della coltura. che dall’invecchiamento della coltura.

Modo di avere stock allo stesso Modo di avere stock allo stesso passaggio.passaggio.

Le cellule si conservano a -196 °C o Le cellule si conservano a -196 °C o per pochi mesi a -80 °C.per pochi mesi a -80 °C.

I crioprotettiviI crioprotettivi

Il congelamento deve essere fatto in Il congelamento deve essere fatto in modo da non danneggiare la cellula. Per modo da non danneggiare la cellula. Per questo si deve formare nella cellula del questo si deve formare nella cellula del ghiaccio amorfo, non cristallino, che può ghiaccio amorfo, non cristallino, che può rompere la membrana. rompere la membrana.

Per fare questo si deve aumentare la Per fare questo si deve aumentare la quantita’ di proteine all’interno della quantita’ di proteine all’interno della cellula e questo si ottiene con DMSO e cellula e questo si ottiene con DMSO e un’alta concentrazione di siero, e un un’alta concentrazione di siero, e un congelamento lento.congelamento lento.

Procedura:Procedura:

Contare le celluleContare le cellule Centrifugarle a 250 g x 10 minCentrifugarle a 250 g x 10 min Eliminare il sopranatante e Eliminare il sopranatante e

risospendere in terreno contenente 10% risospendere in terreno contenente 10% DMSO e 50 % FCS, alla concentrazione DMSO e 50 % FCS, alla concentrazione raccomandata per ogni linea cellulare, raccomandata per ogni linea cellulare, di solito tra 0,8 e 3 milioni di cell/mL.di solito tra 0,8 e 3 milioni di cell/mL.

Mettere in fialine da congelamento Mettere in fialine da congelamento (cryovials) da 2 mL(cryovials) da 2 mL

Congelare lentamente (1 °C al minuto)Congelare lentamente (1 °C al minuto)

Le cellule vengono Le cellule vengono conservate in conservate in dewar di azoto dewar di azoto liquido.liquido.

ScongelamentoScongelamento Le cellule vanno scongelate rapidamente Le cellule vanno scongelate rapidamente

immergendole in un bagno a 37 °C.immergendole in un bagno a 37 °C. Dato che il DMSO puo’ essere un agente Dato che il DMSO puo’ essere un agente

differenziante, e’ bene eliminarlo dal differenziante, e’ bene eliminarlo dal terreno di coltura, diluendo il contenuto terreno di coltura, diluendo il contenuto del cryovials con circa 20 mL di terreno, o del cryovials con circa 20 mL di terreno, o PBS: e’ importante diluire lentamnete, PBS: e’ importante diluire lentamnete, perche’ c’e’ una grossa differenza nella perche’ c’e’ una grossa differenza nella pressione osmotica (oncotica) del terreno pressione osmotica (oncotica) del terreno al 50% di siero e quello al 10 %.al 50% di siero e quello al 10 %.

Procedura di Procedura di scongelamento.scongelamento.

Scongelare le cellule.Scongelare le cellule. Trasferirle in una Falcon da 15 mL Trasferirle in una Falcon da 15 mL

sterile, aggiungere lentamente 10 mL sterile, aggiungere lentamente 10 mL di terreno, risospendere di terreno, risospendere delicatamente.delicatamente.

Centrifugare a 250 g x 10 minCentrifugare a 250 g x 10 min Eliminare il sopranatante e Eliminare il sopranatante e

risospendere in terreno, in alcuni casi risospendere in terreno, in alcuni casi al 20 % di FCS.al 20 % di FCS.