Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Listeria monocytogenes e delle tossine botuliniche

Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Listeria monocytogenesListeria monocytogenes e delle tossine botulinichee delle tossine botuliniche

Giovanna Giovanna FranciosaFranciosafrancios@iss.itfrancios@iss.it

Workshop: Workshop: Workshop: FocusFocusFocus su Sicurezza d’Uso su Sicurezza d’Uso su Sicurezza d’Uso e Nutrizionale degli Alimentie Nutrizionale degli Alimentie Nutrizionale degli Alimenti

Roma 21Roma 21Roma 21---22 novembre 2005, ISS22 novembre 2005, ISS22 novembre 2005, ISS

Listeria monocytogenesListeria monocytogenesAsporigenoAsporigeno

MicroaerofiloMicroaerofiloProduce fattori di virulenzaProduce fattori di virulenza

ClostridiumClostridium botulinumbotulinumSporigenoSporigeno

Anaerobio obbligatoAnaerobio obbligatoNeurotossigenoNeurotossigeno

Patogenesi della listeriosi umanaPatogenesi della listeriosi umanaPatogenesi della listeriosi umana

Meccanismo infettivo di L. monocytogenesMeccanismo infettivo di Meccanismo infettivo di L.L. monocytogenesmonocytogenes

Principali fattori di virulenza che governano il meccanismo infettivo di L. monocytogenes

Principali fattori di virulenza che governano il Principali fattori di virulenza che governano il meccanismo infettivo dimeccanismo infettivo di L. monocytogenesL. monocytogenes

Regolatore positivo trascrizioneRegolatore positivo trascrizionePrfAPrfAFattore accessorio lisi vacuolo IIFattore accessorio lisi vacuolo IIPCPC--PLCPLCAttivazione PCAttivazione PC--PLCPLCMplMplMovimento Movimento intraintra-- ed intered inter--cellularecellulareActAActAFattore accessorio lisi vacuolo IFattore accessorio lisi vacuolo IPIPI--PLCPLCCitolisinaCitolisina; lisi vacuolo; lisi vacuoloHlyHlyAdesione Adesione epatocitiepatociti ed altre celluleed altre celluleInlBInlB

Adesione epitelio GI e placentareAdesione epitelio GI e placentareInlAInlA

RuoloRuoloFattoreFattore

GENI VIRULENZAGENI VIRULENZAGENI VIRULENZA

GastroentericaGastroenterica

Tratto GastrointestinaleTratto Gastrointestinale

Persone che non presentano Persone che non presentano fattori di predisposizionefattori di predisposizione

Dose infettiva: altaDose infettiva: alta

Tempo medio d’incubazioneTempo medio d’incubazione1212--24 ore24 ore

InvasivaInvasiva

SNC e placentaSNC e placenta

Popolazione ad alto rischio Popolazione ad alto rischio ((immunoimmuno--compromessicompromessi, anziani, , anziani, donne in gravidanza, neonati)donne in gravidanza, neonati)

Dose infettiva: bassaDose infettiva: bassa

Tempo medio d’incubazione Tempo medio d’incubazione 22--3 settimane3 settimane

Listeriosi invasiva e gastroentericaListeriosi invasiva e gastroentericaListeriosi invasiva e gastroenterica

Episodi di gastroenterite associati aL. monocytogenes

EpisodiEpisodi di di gastroenteritegastroenterite associatiassociati aaL. monocytogenesL. monocytogenes

Luogo Anno Numero di casi Veicolo Rif.

Giappone 2001 38 Formaggio Kawamoto et al., 2004

Svezia 2001 48 Latticini Carrique-Mas et al., 2003

USA 2001 16 Sandwich tacchino Frye et al., 2002

Australia 2000 31 Carni ready-to-eat Sim et al., 2002

Finlandia 1999 5 Trota Miettinen, 1999

Italia 1997 1566 Insalata di mais Aureli et al., 2000

Canada 1996 1 Polpa di granchio Farber et al., 2000

Danimarca 1996 3 Sconosciuto Heitmann et al., 1997

USA 1994 45 Latte al cioccolato Dalton et al., 1997

Italia 1993 18 Insalata di riso Salamina et al., 1996

USA 1989 10 Gamberi Riedo et al., 1994

Ceppi di L. monocytogenes paragonati per caratteristiche di virulenza

Ceppi di Ceppi di L. monocytogenesL. monocytogenes paragonati paragonati per caratteristiche di virulenzaper caratteristiche di virulenza

6 INVASIVI1 da un outbreak

5 da casi sporadici

C1340 (Canada)

G6006 (USA)

L 254 (Italia)

3 GASTROENTERICI

9 di sierotipo 1/2b

16 INVASIVICeppo ScottA

15 da casi sporadici

F60594 (Danimarca)

L 90 (Italia)

2 GASTROENTERICI

18 di sierotipo 4b

27 CLINICI

L 285, n.s.

ATCC 43248, 1/2aavirulento

ATCC 15313, n.s., avirulento

3 NON-UMANI

30 CEPPI TOTALI

Valutazione della virulenza dei ceppi di L. monocytogenes

Valutazione della virulenza dei Valutazione della virulenza dei ceppi di ceppi di L. monocytogenesL. monocytogenes

inoculo (i.p.)inoculo (i.p.)inoculo (i.p.)intraintraintra---peritonealeperitonealeperitoneale

inoculo (i.g.)inoculo (i.g.)inoculo (i.g.)intraintraintra---gastricogastricogastrico

PCRPCRPCR---RFLP di 8 principali RFLP di 8 principali RFLP di 8 principali geni associati alla virulenza geni associati alla virulenza geni associati alla virulenza (VAG)(VAG)(VAG)

tipizzazionetipizzazionetipizzazione PFGE PFGE PFGE

Test di virulenza Test di virulenza in vivoin vivo su topinisu topini

Approccio molecolareApproccio molecolare

Prodotti PCR di ActA ristretti con DraIProdotti PCR diProdotti PCR di ActAActA ristretti con ristretti con DraIDraI

700 bp400 bp

M

Scot

tAL4

39L6

6

L67

L335

L337

L339

L340

L344

L349

L448

L599

L645

L864

L958

L959

L90

F605

94

M

Ceppi 4bCeppi 4bCeppi 4bCeppi 4b

800 bp

300 bp

Ceppi 1/2bCeppi 1/2b

500 bp

L281

8

L310

L312

L330

L364

L941

L254

G60

06

C13

40

L285

ATC

C43

248

M

Ceppi 1/2bCeppi 1/2b

Ceppi avirulentiCeppi Ceppi Ceppi avirulentiavirulentiavirulenti

Profili PFGEProfili PFGE concon ApaIApaIM Sc

ottA

L439

L66

L67

L335

L337

L339

L340

L344

L349

L448

L599

L645

L864

L958

L959

L90

F605

94L2

85

ATC

C15

ATC

C43

M

248

313

M L281

8L3

10L3

12L3

30

L364

L941

L254

G60

06C

134

M

0

Ceppi 4b Ceppi Ceppi 1/2b avirulenti

Conte batteriche recuperate negli organi dei topi inoculati i.g.

Conte batteriche recuperate Conte batteriche recuperate negli organi dei topi inoculati negli organi dei topi inoculati i.gi.g..

p < 0.05

Scott A

(4b)

L 90 (4

b)

L 2818

(1/2b

)

L 254 (

1/2b)

Scott A

(4b)

L 90 (4

b)

L 2818

(1/2b

)

L 254 (

1/2b)

Scott A

(4b)

L 90 (4

b)

L 2818

(1/2b

)

L 254 (

1/2b)

0123456789

intestineliverspleen

Log 1

0 C

FU/g

org

an

Listeria monocytogenes sierotipo 4bCLONI EPIDEMICI (EC)

Listeria monocytogenesListeria monocytogenes sierotiposierotipo 4b4bCLONI EPIDEMICI (EC)CLONI EPIDEMICI (EC)

17B

133

85M

ECI + + +Altri 4b - - -ECII - - -

17B

133

85M

ECI + + +Altri 4b - - -ECII - - -

MarkersMarkersper ECIper ECI

MarkersMarkersper ECIIper ECII

MarkersMarkers specifici dei cloni epidemicispecifici dei cloni epidemici

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M bp

20001500

750

250

A ECI-specific markers B ECII-specific markers

Distribuzione dei markers epidemici fra i ceppi diDistribuzione dei L. monocytogenes 4b isolati in Italia

Distribuzione dei markersmarkers epidemici fra i ceppi diepidemici fra i ceppi diL.L. monocytogenesmonocytogenes 4b isolati in Italia4b isolati in Italia

81 ceppi analizzati81 ceppi analizzati

6/32 clinici (18.7%) 7/32 clinici (28%)6/32 clinici (18.7%) 7/32 clinici (28%)7/44 alimentari (15.9%) 6/44 alimentari (13.6%)1/5 ambientale (20%) 1/5 ambientale (20%)

14 ECI 14 ECII34.6%

Studio del fattore di virulenza Studio del fattore di virulenza InternalinaInternalina((InlAInlA))

Internalin-mediated Listeria invasion

Internalina: forma intera e forma troncataInternalinaInternalina: forma intera e forma troncata: forma intera e forma troncata

InlA intera

InlA troncata

InternalinaInternalina dei ceppi clinici di dei ceppi clinici di L.L. monocytogenesmonocytogenes isolati in Italiaisolati in Italia

65 ceppi analizzati 65 ceppi analizzati mediante Western mediante Western blottingblotting

7 producono 7 producono internalinainternalina troncatatroncata

FARMACO BOTULISMO

TOSSINA BOTULINICATOSSINA BOTULINICATOSSINA BOTULINICABeauty the Beast…

and

ARMA BIOLOGICACOSMETICO

Struttura e meccanismo d’azioneStruttura e meccanismo d’azionedella tossina della tossina botulinicabotulinica

Tossine botuliniche e targetsTossine botuliniche e Tossine botuliniche e targetstargets

Cluster genici codificanti per i “complessi tossici”

ClusterCluster genici codificanti per i genici codificanti per i “complessi tossici”“complessi tossici”

Struttura del cluster genico per la tossina botulinica di tipo A (bont/A)

Struttura del Struttura del clustercluster genico per la tossina genico per la tossina botulinicabotulinica di tipo A (di tipo A (bontbont/A)/A)

ha70ha70 ha17ha17 ha33ha33 botR/A ntnhntnh bontbont/A1/A1Tipo A1

orfX2 orfX1 botR/A p47p47 ntnh bontbont/A2/A2Tipo A2

Prodotti PCR di ha33 e p47da C. botulinum tipo A

Prodotti PCR di ha33 e p47da C. botulinum tipo A

ha33(774 bp)

p47(1236 bp)

16361018506

3054

bp62A

2776 1903 52771882 3517 588

CL91CL130

CL2962A

27761882

19033517

5277588

CL91CL130

CL29

Pattern di restrizione con XbaI dei prodotti PCR di bontbont/A/A

62A 1757 1882 1903 35171839 588 CL91 S1572171 CL130 CL186 CL127 CL29 CL104

1500

Tipo A1 Tipo A2Tipo A1 Tipo A2Tipo A1 Tipo A2

bp bp

25002 000

800

ClusterCluster genico di genico di bontbont/A/A

Strains ha33 gene p47gene bont/A RFLP type

bont/A gene cluster

C. botulinum type A

10 (U.S.) + − A1 1 33 (Italy) − + A2 2 2 (U.S.) − + A1 3

C. botulinum type Ab

4 (Italy) + + A2 2 1 (U.S.) + + A1 3

C. botulinum type A(B)

5 (U.S.) + + A1 3 1 (U.S.) + + A2 2

Strategia di SequenziamentoStrategia di Strategia di SequenziamentoSequenziamentoCluster genico di BoNT/A (CEPPO C. botulinum “MASCARPONE”)

K2Frammento 1: ~ 5Kb

Frammento 2: ~ 5Kb

K33NT1

K6NT1

K2 111

1213

142

34 15

5 166 17

1878 19

920

10 K6K33

OrfsOrfs individuati nella sequenza del ceppo individuati nella sequenza del ceppo “Mascarpone” (10,6 “Mascarpone” (10,6 KbKb))

9489999912963891boNT/A

9592979511593480NTNH

878198954161251p47

98979692178537botR

99999088142429ORFX1

9997100100210631ORFX2(parziale)

% omologia ceppo NCTC2916 (A1)

% identitàceppo NCTC2916 (A1)

% omologia ceppo Kyoto-F (A2)

% identitàceppo Kyoto-F (A2)

AminoacidiNucleotidiORF

Ruoli delle proteine accessorieRuoli delle proteine accessorie

• Protezione della tossina nel tratto gastrointestinale• Legame alle pareti intestinali• Interazione con i residui di carboidrati sui globuli rossi• Ruolo nella stabilità dell’agente terapeutico

Differenze nella sequenza Differenze nella sequenza aminoacidicaaminoacidicadella tossina della tossina botulinicabotulinica tipo Atipo A

• Diverse proprietà antigeniche• Diversità nel riconoscimento del recettore?

RingraziamentiRingraziamenti

Paolo Aureli

Laura Toti

Francesca Floridi

Antonella Maugliani

Concetta Scalfaro