Caratteristiche e chimerismo - OPEN...

Caratteristiche e problematiche dell’analisi del

chimerismo

Daniela Di MartinoU.O.Trapianto di Cellule Staminali EmatopoieticheDipartimento di Ematologia e Oncologia Pediatrica

IRCSS G.Gaslini Genova

7° UKNEKAS Users Meeting Milano 13 novembre 2014


chimerismo


Daniela Di MartinoU.O.S.D.Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche

Dipartimento di Ematologia e Oncologia PediatricaIRCSS G.Gaslini

Genova


chimerismo


Daniela Di MartinoU.O.S.D.Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche

Dipartimento di Ematologia e Oncologia PediatricaIRCCS G.Gaslini

Genova

Chimerismo Post Trapianto

E’ stato introdotto in medicina da Anderson nel 1951;

E’ stato utilizzato per la prima volta riferito al trapianto da Ford nel 1956;

Dopo un trapianto di cellule staminali allogeniche si crea nel paziente una chimera dinamica che coinvolge le cellule del donatore e del ricevente;

Studiare il chimerismo post-trapianto significa analizzare percentualmente il contributo del donatore e del ricevente all’ ematopoiesi e alla linfopoiesi.

Un accurato controllo del chimerismo a diversi tempi post-trapianto, sul sangue periferico e/o sul midollo del paziente:

a) fornisce importanti indicazioni circa il progredire dell’attecchimento

b) rappresenta un elemento chiave nel predire o confermare il rigetto o la ricaduta.

7° UKNEQAS USERS MEETINGMilano 13 novembre 2014 IRCCS Gaslini

Analisi quantitativa del Chimerismo Post Trapianto:

☻ permette una valutazione della percentuale di ematopoiesi del donatore rispetto a quella del ricevente;

☻ è importante nel monitoraggio dei pazienti dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche;

☻ fornisce informazioni sull’attecchimento in tempi molto precoci dopo il trapianto;

☻ la sua dinamica nel tempo permette di ottenere informazioni sull’esito del trapianto stesso;

☻ contribuisce a porre diagnosi precoce di:✔ fallimento dell’attecchimento, ✔ parziale o completo attecchimento, ✔ recidiva della sottostante malattia,✔ incipiente GvHD.


CHIMERISM ANALYSIS

Sensitivity (%) Unfavorable Feature

RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis)

5-10 Long times

Cytogenetics 5 Long times

Red Cell Phenotype 1-5 lineage specific

X/Y FISH 0.1-0.001 sex-mismatched

STR-PCR 1-5 moderated sensitivity

STR subpopulations 0.1-0.001 expensive

Real-Time PCR (SNP) 0.001-0.0001 false +/sex mismatched


DC (Complete Donor Chimerism) = Chimerismo Completopresenza di DNA del donatore ≥ del 99%.

MC (Mixed Chimerism ) = Chimerismo Mistopresenza di DNA del ricevente > dell’ 1%.

►TMC (Transient Mixed Chimerism)Chimerismo Misto Transitorio: Chimerismo Misto che in un

tempo più o meno lungo evolve in chimerismo completo.

►SMC (Stable Mixed Chimerism)Chimerismo Misto Stabile: Profilo misto che si conserva stabile

nel tempo con delle oscillazioni.

►PMC (Progressive Mixed Chimerism )Chimerismo Misto Progressivo: Chimerismo misto che evolve in

una progressiva perdita della quota donatore e aumento della quotaricevente fino al rigetto secondario.

(ESH-EBMT Handbook.2008; E.Ozyurek et al. BoneMarrowTransplant.2008; P.Bader et al. 2005)


LSC (Lineage Specific Chimerism)Chimerismo Specifico di Linea Cellulare

quando il DNA del ricevente può essere presente solo in alcune linee cellulari e/o nelle varie linee cellulari c’è una variabile proporzione delle quote

donatore/ricevente.

RA (Autologous Recovery)Ripresa Autologa

quando il DNA estratto dal sistema linfo-ematopoietico post trapianto è tutto del ricevente.

(ESH-EBMT Handbook.2008; E.Ozyurek et al. BoneMarrowTransplant.2008; P.Bader et al. 2005)


Dal 2006:

Valutazione del chimerismo post trapianto su 221 pazienti pediatrici:

106 > Chimerismo Completo

115 > Chimerismo Misto > 68 > Chimerismo Misto Transitorio

19 > Chimerismo Misto Stabile

28 > Chimerismo Misto Progressivo

Chimerismo Completo

Chimerismo Misto

leucemie linfatiche e mieloidi 62 38

patologie ematologiche 28 43

" genetiche 5 8

" metaboliche 5 12

" linfomi 3 8

" neuroblastomi e tumori solidi 3 6

106 115


Osservazioni sulla casistica: Chimerismo Completo

è la regola dopo trapianto per malattia neoplastica. Nelle malattie non neoplastiche si associa ad un aumentato

rischio di GvHD.

Mancato attecchimento/Precoce rigettoè un evento non così raro nelle malattie non neoplastiche.

Solitamente non è recuperabile.

Chimerismo Misto Transitorioin tutti i casi è associato ad un buon esito.

Riduce il rischio di GvHD.

Chimerismo Misto Stabilenon esiste nelle malattie neoplastiche.

Nelle altre malattie è associato ad un buon esito e riduce il rischio di GvHD.

Chimerismo Misto Progressivonella nostra esperienza ha sempre avuto il significato di

recidiva nelle malattie neoplastiche, e di rigetto secondario nelle non neoplastiche.7° UKNEQAS USERS MEETING

Milano 13 novembre 2014 IRCCS Gaslini

PB / BM Estrazione DNA AmpFlSTR® Profiler Plus ® PCR Amplification Kit(Applied Biosystem)

analisi su sequenziatore (ABI Prism 3130 genetic analyzer)

determinazione del chimerismo(Gene Mapper software)

CHIMERISMOMISTO

CHIMERISMOCOMPLETO

Lineage Specific Chimerism

Separazione sottopopolazioni cellulariCD3+; CD56+; CD19+; CD14+ con Macs Separation Columns


Osservazioni sulla casistica Lineage Specific Chimerism:

Una maggiore % di linfociti T (CD3+) del donatore correla con chimerismo misto transitorio.

Una minore % di linfociti T (CD3+) del donatore correla con evoluzione sfavorevole con possibile esito in rigetto.

La % delle cellule NK (CD56+) del donatore è quasi sempre uniformabile alla % dei linfociti T.

Nelle patologie metaboliche la % dei monociti (CD14+) è predittiva di chimerismo misto progressivo e rigetto.


Polimorfismi STR

I microsatelliti o STR (Short Tandem Repeat Markers) sono loci polimorfici di DNA, localizzati sui diversi cromosomi (nel genoma umano se ne conoscono ~106)

Gli STR contengono sequenze nucleotidiche (da 2 a 7 nucleotidi) ripetute n volte es: TCTA (TCTG)1-3 (TCTA)n

Al variare del numero di queste unità ripetute in un locus STR, varia la lunghezza allelica

ETEROZIGOSI —►presenza di 2 alleli con diversa lunghezza

OMOZIGOSI —►presenza di 2 alleli con lunghezza uguale.

Analisi dei Polimorfismi = studio delle sequenze STR


Ampl Fl STR Profiler Plus™ Amplification Kit (Applied Biosystems) permette l’amplificazione contemporanea di 9 loci polimorfici e di un segmento del gene omologo X-Y dell’amelogenina (identificazione maschio-femmina)

Locus Designation

Chromosome Location

Common Sequence Motif

Size Range(bp)

Dye Label

D3S1358 3p TCTA(TCTG)1-3(TCTA)n 114-142 5-FAM

vWA 12p12-pter TCTA(TCTG)3-4(TCTA)n 157-197 5-FAM

FGA 4q28 (TTTC)3TTTT TTCT(CTTT)nCTCC(TTCC)2

219-267 5-FAM

Amelogenin X:p22.1-22.3

Y: p11.2

-

-

107

113

JOE

D8S1179 8 (TCTR)n 128-168 JOE

D21S11 21 (TCTA)n(TCTG)n[(TCTA)3TA

(TCTA)3TCA(TCTA)2TCCA TA](TCTA)n

189-243 JOE

D18S51 18q21.3 (AGAA)n 273-341 JOE

D5S818 5q21-31 (AGAT)n 135-171 NED

D13S317 13q22-31 (GATA)n 206-234 NED

D7S820 7q11.21-22 (GATA)n 258-294 NED


Post TCSE

Donatore

Pre TCSE

R1 R2

D1-2 D1-2

R1 R2

D1-2

R1-2

H allele D1-2

:H allele D1-2 + H alleli R1 e R2

H allele D1-2

:H allele D1-2 +

H allele R1-2


Marcatore informativo:il marcatore analizzato è:in eterozigosi o in omozigosi sia nel ricevente che nel donatore;non è in “stutter” (dista più di 4 basi nella sequenza nucleotidica);se in eterozigosi, almeno uno dei due alleli del ricevente non corrispondea quello del donatore e viceversa:R1-R2 e D1-D2 H D = H D1-D2 / H D1-D2 + H R1-R2R e D1-D2 H D = H D1-D2 / H D1-D2 + H RR1-R2 e D H D = H D / H D + H R1-R2R e D H D = H D / H D + H R

Marcatore non informativo:il marcatore analizzato o in eterozigosi o in omozigosi nel riceventecorrisponde a quello del donatore o è in posizione di “stutter”:R = DR1-R2 = D1-D2R1 o R2 = D1 o D2 – 4 bp D1 o D2 = R1 o R2 -4 bp

“Stutter” peaks o “4” peaks:si formano perché durante la PCR, la Taq polimerasi “scivola” sulDNA template e genera un prodotto che è di una unità ripetuta (4 bp)più piccola dell’allele vero.


Chimerism Analysis Following Hematopoietic Stem Cell TransplantationKathleen M. Murphy .Methods in Molecular Biology, vol.999.2013

►Marcatore informativo

1. eterozigosi R e D:a) R1-R2 D1-D2b) un allele R corrisponde a un allele D:R1=D2 o R2=D1R1=D1 o R2=D2

2. eterozigosi R e omozigosi D:a) R1-R2 D1-2b) il doppio allele D corrisponde a un allele R:R1=D1-2 o R2=D1-2

3. omozigosi R e eterozigosi D:a) R1-2 D1-D2

4. omozigosi R e omozigosi D:a) R1-2 D1-2

Importante è che:almeno un allele di R non corrisponda a un allele di D e non in posizione di “stutter”


Da giugno2012► Iscrizione Servizi External Quality Assessment

EQA06E-Post-SCT Chimerism Monitoring

Secondo Calendario UK NEQAS for Leucocyte Immunophenotyping (LI)

► 26 settembre 2012 trial n° 121302 green

► 20 febbraio 2013 trial n° 121303 green

► 17 luglio 2013 trial n° 131401 green

► 04 dicembre 2013 trial n° 131402 green

► 05 marzo 2014 trial n° 131403 green

► 31 luglio 2014 trial n° 141501


Programmi futuri

passaggio definitivo ad analisi di un maggior numero di marcatori con altri multiplex PCR KIT

accreditamento EFI: “European Federation for Immunogenetics” ( in Italia facoltativo ma raccomandato dall’ IBMDR “Italian Bone Marrow Donor Registry” e dal Centro Nazionale Trapianti)

Proposta per Servizio UK NEQAS

inserire un controllo per Lineage Specific Chimerism su linfociti T.



chimerismo

Daniela Di MartinoU.O.Trapianto di Cellule Staminali EmatopoieticheDipartimento di Ematologia e Oncologia Pediatrica

IRCSS G.Gaslini Genova


Edoardo LaninoGiuseppe Morreale

Maura FaraciStefano GiardinoPaola Terranova

UOSD Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche

Dipartimento di Ematologia e Oncologia Pediatrica

IRCCS G.Gaslini Genova

Marco Di Duca

UOC Nefrologia Dialisi e Trapianto

IRCCS G GasliniGenova

Grazie!

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