Esercitazione di

Biotecnologie Genetiche Agrarie

“Mappe genetiche”

Mappa con marcatori morfologici (sinistra) e mappa con marcatori

molecolari RFLP e SSR (destra) del cromosoma 1 di mais

Produzione di una mappa genetica

La produzione di un mappa genetica passa

attraverso tre fasi:

1. Calcolo della distanza tra tutte le coppie

di loci (geni o marcatori) e valutazione

della presenza di associazione.della presenza di associazione.

2. Suddivisione dei loci in gruppi di

associazione (anche detti di

concatenazione).

3. Ordinamento dei loci all’interno di

ciascun gruppo di associazione.

Calcolo delle distanze tra coppie di loci

La determinazione della distanza di mappa tra due lociinizia con il calcolo della frequenza di ricombinazione(FR) tra i loci stessi.

FR = proporzione di gameti ricombinanti sul totale deigameti analizzati

0 ≤ FR ≤ 0,5

In semplici popolazioni sperimentali (prima generazione direincrocio o “BC1” ed aploidi raddoppiati) i gametiricombinanti sono riconoscibili dal genotipo degli individui.In altre situazioni (es. popolazioni F2) la proporzione deigameti ricombinanti deve essere stimata con metodi piùcomplessi.

associazione indipendenza

individui totale n.

aB/ab Ab/abindividui

gameti totale n.

aB Ab

gameti totale n.

tiricombinan gameti di n.FR

+=

+

==

Esempio di calcolo della FR tra due loci, A e B,

nella prima generazione di reincrocio

Parentali

ParentaleF1

x

Meiosi e

crossing-over

a

b

A

B

ab

AB AaBb

Ab Aabb

aB aaBb

ab aabb

Gameti dall’F1 Gameti dal parentale

BC1

2 x individui totalen.

ti?ricombinan

gameti totalen.

aB Ab

gameti totalen.

tiricombinan gameti di n.FR

=+

==

Esempio di calcolo della FR tra due loci, A e B,

in una F2

Parentali

F1

Gameti dall’F1

x

Meiosi e

crossing-over

a

b

A

B

AB Ab aB ab

AB AABB AABb AaBB AaBb

Ab AABb AAbb AaBb Aabb

aB AaBB AaBb aaBB aaBb

ab AaBb Aabb aaBb aabb

Individui con due cromosomi

ricombinanti non distinguibili

da non-ricombinanti

Gameti dall’F1

Valutazione della presenza di associazione:

1. Metodo del test del χ2

Es.: popolazione BC1

Classe fenotipica N. osservati N. attesi (E-O)2/E

AaBb 47 25 19,36AaBb 47 25 19,36

Aabb 4 25 17,64

aaBb 6 25 17,64

aabb 43 25 12,96

Totali 100 67,60

Il valore calcolato del χ2, 67,6 è molto maggiore del valore critico della distribuzione

per 3 gradi di libertà (7,81 per P = 0.05), quindi possiamo rigettare l’ipotesi di non

associazione: i loci A e B sono associati, ad una FR di 0,1 (10%).

Funzione di mappa

Le distanze tra loci espresse sulla base della FR non sono addittive, in quanto non

sono in grado di tenere conto dei doppi crossover.

Una funzione di mappa è una funzione matematica che tenta di predire il numero

effettivo di crossover tra due loci a partire dal valore di FR.

Alcune possibili progenie di

popolazione BC1 (solo un

cromosoma)

Questi ricombinanti sfuggono al

conteggio quando si considera la

distanza A-B, ma vengono

considerati per A-D e B-D.

A

D

B

effettivo di crossover tra due loci a partire dal valore di FR.

Per una previsione del numero effettivo dei crossover tra due loci occorre fare delle

assunzioni sul livello di interferenza (= i = misura dell’indipendenza di un crossing-over

rispetto ad un altro). La funzione di Haldane assume totale indipendenza degli eventi di

crossover (i = 0), la funzione di Kosambi assume un livello di interferenza intermedio, (i =

1- 2FR), proporzionale ad FR.

Le distanze tra loci basate sul numero di crossover sono maggiormente addittive e

sono riportate sulla mappa come unità di mappa o centimorgan (cM).

2

2FR)-ln(1-(Haldane) cM =

+=

2FR-1

2FR 1ln

4

1(Kosambi) cM

Funzioni di mappa

1

1.5

2

2.5

Dis

tan

za

di

ma

pp

a (

Mo

rga

n)

Haldane

Kosambi

FR

0

0.5

1

0

0.0

4

0.0

8

0.1

2

0.1

6

0.2

0.2

4

0.2

8

0.3

2

0.3

6

0.4

0.4

4

0.4

8

Frequenza di ricombinazione

Dis

tan

za

di

ma

pp

a (

Mo

rga

n)

FR

Si noti che per distanze inferiori ai 10 cM le differenze tra i risultati ottenuti con le

diverse funzioni di mappa (o direttamente FR) sono minime.

Aggiungiamo un terzo

locus (D)….

dove mappa?

Parentali

ParentaleF1

xa

b

A

B

Ordinamento di 3 loci (incrocio a tre punti)

Gameti dall’F1 Gameti dal parentale

Meiosi e

crossing-over

Ordinamento di 3 loci (incrocio a tre punti)

Ipotizziamo di seguire la segregazione di tre loci di cui non conosciamo l’ordine,

in un reincrocio di un individuo F1 ABD/abd con l’omozigote recessivo abd/abd.

Genotipo N. oss.

Genotipo

indicato con il

vero ordine

ABD 40

ABd 0

AbD 4

FR (A-B) = (4+7+4+3)/100 = 0.18

FR (A-D) = (0+7+4+1)/100 = 0.12

FR (B-D) = (0+4+3+1)/100 = 0.08

Dato che B e D sono i più vicini e A è più vicino a D,

l’ordine suggerito dai dati delle distanze FR a coppie è: Abd 7

aBD 4

aBd 3

abD 1

abd 41

l’ordine suggerito dai dati delle distanze FR a coppie è:

A – D – B.

Inoltre, l’ordine più probabile è quello che minimizza

il numero di doppi ricombinanti che è necessario

prevedere per spiegare i dati (non mostrato, fare per

esercizio).

0.12 0.08

0.18

A D B

Notare che

A-D + D-B > A-B,

perché?

Ordine e distanze:

Ordinamento dei loci all’interno di un gruppo di associazione

L’ordinamento di molti loci all’interno di un gruppo di

associazione richiede l’utilizzo di procedure ed algoritmi

avanzati. In generale il compito è quello di arrangiare

linearmente i loci in modo che le distanze risultanti sulla

mappa siano il più possibile in accordo con i dati, già a

disposizione, sulle distanze tra le singole coppie di loci.

Le principali strategie utilizzate sono due:Le principali strategie utilizzate sono due:

a) La minimizzazione del numero di crossover che si accettano

definendo uno specifico ordine di loci (strategia utilizzata dal

programma MapMaker)

b) La minimizzazione delle differenze tra le distanze genetiche

calcolate confrontando le singole distanze a coppie con le

distanze misurate, per le stesse coppie, sulla mappa finale

(strategia utilizzata dal programma JoinMap)

Perché costruire una mappa genetica

La disponibilità di una mappa genetica:

1. funge da punto di partenza per l’isolamento di geni

di interesse tramite procedure di clonaggio

posizionale;

2. consente di ottimizzare la scelta di marcatori per lo2. consente di ottimizzare la scelta di marcatori per lo

svolgimento di procedure di selezione assistita da

marcatori molecolari;

3. consente l’identificazione di regioni cromosomiche

sede di loci che controllano i caratteri quantitativi

(QTL: Quantitative Trait Loci);

4. facilita il trasferimento di informazione tra specie

sfruttando le relazioni di sintenia tra le mappe

genetiche.

Esempio di profilo AFLP su

popolazione di mappa in maisPrimer combination: PstGA/MseCGG

Popolazione: F2 (67 piante) dall’incrocio delle linee pure di mais Lo964 (P1) x Lo1016 (P2)

P1

P2

Esempio di file che raccoglie i dati genotipici, da

utilizzarsi per il calcolo di una mappa di linkage tramite

il software JoinMap.