BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHEAA 2011-12

LEZIONE 18

Acidi nucleici e nuovi farmaci III

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Valeria Benedusi

ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI

1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-

RNA

2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA

3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a

RNA

4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una

sequenza aminoacidica (competono

con l’RNA nella interazione tra RNA e

proteina)

5. DECOY: DNA complementare a sequenze

aminoacidiche (competono con

sequenze di DNA nell’interazione DNA-

proteina)

6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica:sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzioneE’ un fenomeno comune in natura volto a proteggere l’ospite da dsRNAs estranei (virus) o endogeni (retrotrasposoni)

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

Silenziamento Post-trascrizionale (1990)Jorgensen 1990:

Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure

pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche

ridotta espressione sia del gene endogeno che del transgene (cosoppressione)

A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

1993: Vengono identificati i primi miRNA nel C. elegans (lin-4 e let-7)

1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA interference nel C. elegans

1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato dall’accumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt) complementari al gene silenziato. dsRNAs vengono ridotti a piccoli frammenti di 21-23 Nt

2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico con la trascrizione

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

                        

Andrew Z. Fire Craig C. MelloStanford University University

of Massachusetts b. 1959 b. 1960

Small RNAs

miRNA siRNA

Prodotti in modo endogeno

Funzione: regolazione dell’espressione genica

sopprimendo la traduzione o la trascrizione di geni

target

Exo-siRNA:Introdotti in modo esogeno (virus a dsRNA, transposoni,

transgeni)

Endo-siRNA: derivati da loci genomici endogeni

Funzione principale: rispondere alle minacce esterne sopprimendo la

trascrizione genica dell’”invasore”

Interferenza basata su RNA (RNA interference)

Sono coinvolti nel processo:

Micro RNA (miRNA) precursori a forcina

Small interfering RNA (siRNA) (2 nt 3’ protrundenti)

Ribonucleasi DICER

RISC (RNA driven interference silencing complex) che comprende: Argonauta, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a 10-11 nt dal terminale 5’.

Mammalian RNAi biogenesis

Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.

siRNA sinteticoa doppio filamento

shRNA plasmidico

RNA lungo a doppio filamento

miRNA endogeno

20-25 NT

funzionemiRNA

Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex)

Complesso RISC attivato

Blocco traduzione

funzionesiRNA

Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi

Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi

                                

                                     

Risc unwinds dsRNA,the ribonuclease in the Ribonuclease complex hydrolizesnew targets

Nature Reviews Genetics 2007, 8:884

LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA

Attività di siRNA a livello del nucleo

Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali)

Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazione di eterocromatina)

Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)

RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)

RNA interference-mediated heterochromatin assembly

siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group.

Marjori A. Matzke & James A. BirchlerNature Reviews Genetics 6, 24-35 (January 2005

si RNA – caratteristiche

RNA a doppia elica di 21-23 ntPresenza di terminale 3’ più lungo di 2ntPresenza di gruppi OH in 3’Presenza 5’ fosfatoAlta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche

Non deve essere complementare a zone intronicheComplementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

si RNA – caratteristiche

siRNA possono diffondere per brevi e lunghe distanze

Piante: siRNAs prodotti da Dicer-like 4 nel floema raggiungono 10-15 cellule fuori dal floema dove possono originare dsRNA (attraverso una RNA Pol RNA dip) che vengono processati in siRNAs secondari che propagano il silenziamento con un processo di amplificazione

Animali: trasporto attraverso vescicole secretorie (esosomi)

In rosso: siRNA marcatoIn blu: nucleiIn verde la proteina GAPDH

CELLULE HeLa

si RNA non specifico si RNA contro GAPDH

Trattamento: 48h

siRNA come agenti terapeutici

LA DISTRIBUZIONE

Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari

Difficoltà ad ottenere distribuzione tessuto specifica

Degradazione dovuta a RNasi circolanti

Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale

2. Somministrazione sistemica: a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le

membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier)

b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica

c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA

della cellula bersaglio

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente

modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso)

fosforotionati per bloccare esonucleasi

coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG

Metodi di somministrazione:

FISICI

Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva

Elettroporazione: campo elettrico che facilita la transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel muscolo, retina, giunture artritiche e tumori

DI CONIUGAZIONE

Carrier mediated methods

Stable nucleic acid lipid particle

BIODISTRIBUZIONE

Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*,

Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin†,

Gregory J. Hannon†, Mark A. Kay*

Nature, 2002

siRNA IN STUDI CLINICI

Potenziali effetti collaterali della terapia con siRNA:

1. Attivazione del sistema immunitario

2. Effetti off-target

3. Saturazione di vie di silenziamento endogene (miRNA)

Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso

Similarità: - lunghezza- metodologia di delivery comune- induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale- digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi- possibilità di stabilizzazione con basi

modificate- similarità nella biodistribuzione

Differenze: - doppio filamento contro singolo filamento- maggiore stabilità della molecola naturale- maggiore efficacia in cellule in coltura- meccanismo di azione mediato da RISC

Mantenimento dell’identità cellulare (es. pluripotenza) L’identità cellulare viene mantenuta silenziando mRNAs che non appartengono allo specifico repertorio della cellula

Network di miRNA che controllano specifici pathway (miR-21 regola miRNA che controllano apoptosi: disregolazione di miR-21 cancro. miRNA che controllano la via di segnale dell’insulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di questo network di miRNA è regolato a seconda della tipologia cellulare)

FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI miRNA

Tumori: pattern specifico di espressione dei miRNA che permettono di discriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di origine delle metastasi

miRNA e cancro

Network trascrittoma-microRNA nel cancro

miRNA e cancromiRNA oncogeni: miRNA overespressi nei tumori (es. miR-155 è upregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella, del polmone e del pancreas, miR-380-5p reprime p53 nel neuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonista migliora la prognosi) blocco dei miRNA con oligonucleotidi antisenso

miRNA oncosoppressori: miRNA ridotti o mancanti nei tumori. La loro overespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. miR-15a-16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfocitica cronica, adenoma della prostata e dell’ipofisi) miRNA mimics o vettori virali

Strategie per terapie anti-cancro basate su miRNA:

1. Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi antisenso

2. Ripristinare l’espressione di miRNA oncosoppressori

3. Riprogrammare le cellule cancerogene

Limiti e vantaggi della terapia con miRNA

Riferimenti bibliografici

Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884

Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556

Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic administration.Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142

Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery 8, 129-138 (February 2009)

Carthew et al., Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell vol 136, Feb 2009

Garzon et al., Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nat reviews vol 9 (2010)

Semple et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotech vol 28 Feb. 2010Kosik et al., MicroRNAs and cellular Phenotipy, Cell vol 143, 2010