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UNIVERSITDEGLISTUDIDIROMA
TORVERGATA
FACOLTADIMEDICINAECHIRURGIA
DOTTORATODIRICERCAINNEUROSCIENZE
XXIICICLO
Effettidegliamminoacidiacatenaramificata(BCAA)
sulleccitabilitdineuronicorticaliincolturaprimariae
confrontoconilmodellomurinodiSclerosiLaterale
Amiotrofica,G93A.
LiviaCurcio
A.A.2009/2010
DocenteProf.CristinaZona
Coordinatore:Prof.GiorgioBernardi
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
2
Indice
INDICE 2
INTRODUZIONE 4
1 LASCLEROSILATERALEAMIOTROFICA 4
1.1 IpotesipatogenetichediSLA 71.1.1 SOD1(Cu/ZnSuperossidodismutasi) 81.1.2 Alterazionimitocondriali,vacuolizzazioneestressossidativo 121.1.3 Anormalitcitoscheletricheeaggregazioneproteica 131.1.4 MeccanismiintercellularinellapatogenesidellaSLA 141.1.5 Dannoeccitossico 151.1.6 IcanaliionicinellaSLA 181.1.7 Fattoridirischioambientali 22
1.2 AttivitfisicaeinsorgenzadiSLA 25
1.3 IpotesidiSLAneicalciatoriinItalia 27
1.4 Integrazionealimentaredurantelattivitsportiva 30
1.5 Amminoacidiacatenaramificata 30
1.6 MetabolismoefabbisognoumanodiBCAA 32
1.7 GliamminoacidiacatenaramificatanelSNCedeffettosuimeccanismidifaticacentrale 35
1.8 PossibileimplicazionedeiBCAAnellaSLA 39
2 ILCOMPLESSOMTOR(MAMMALIANTARGETOFRAPAMYCIN) 42
3 ICANALIIONICIVOLTAGGIODIPENDENTIELATRASMISSIONESINAPTICA 50
3.1 Genesiionicadeipotenzialidazione 51
3.2 Icanaliionicidelsodiovoltaggiodipendenti 51
3.3 IcanaliionicidelcalcioVoltaggiodipendenti 56
SCOPODELLOSTUDIO 60
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4 MATERIALIEMETODI 63
4.1 Colturecellulari 63
4.2 Trattamentodellecellulecorticali 67
4.3 Registrazioneelettrofisiologiche 684.3.1 LatecnicadelPatchClamp 684.3.2 Configurazioni 704.3.3 CurrentclampeVoltageclamp 714.3.4 Leproprietelettrichedellamembranacellulare 734.3.5 Elettrodiesoluzioni 744.3.6 Apparatosperimentale 78
4.4 Analisideidati 79
5 RISULTATI 81
5.1 EffettodeiBCAAsulleproprietpassiveeattivedineuronicorticali 81
5.2 SpecificitdelleffettodiBCAA 84
5.3 EffettodellaRapamicina 87
5.4 ConfrontoconilmodelloG93A 90
5.5 EffettodellesposizionediBCAAsullafunzionalitdeicanaliionicivoltaggiodipendenti 925.5.1 StudiodeicanaliionicivoltaggiodipendentidelSodio:correntetransienteepersistente 925.5.2 Caratterizzazionefarmacologicadeicanaliionicidelcalciovoltaggiodipendenti 96
6 DISCUSSIONE 100
7 BIBLIOGRAFIA 106
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Introduzione
1 LaSclerosiLateraleAmiotroficaLaSclerosiLateraleAmiotrofica(SLA)unamalattiaprogressivachecolpisce
imotoneuroni,cio lecellulenervosesiaa livellocorticale (Imotoneurone)
chedelmidollospinale (IImotoneurone)checomandano ilmovimentodei
muscoli. La morte dei motoneuroni altera la funzionalit del muscolo
scheletrico, causando paralisi e atrofia muscolare. I disturbi variano a
secondadellapartedelcorpocolpita.Spessolamancanzadiforzailprimo
sintomochepumanifestarsiconaffaticamento,debolezzadiunamano,di
una gamba (ipostenia) o come debolezza deimuscoli che permettono di
parlare(disartria)odideglutire(disfagia).
Lesistenzadiunasindromecaratterizzatadaundeficitmotorioprogressivo
degliartiassociatoadatrofiamuscolarefuconfermatanellacomunitmedica
nella met del diciannovesimo secolo. Il Dr. Franois Aran pubblic la
descrizionedellasindromenel1848eipotizzcheavesseradicineurologiche.
Dopodiluiparecchimedicicontinuaronolostudiodellamalattiaconosciuta
ormai comeatrofiamuscolareprogressiva. IlDr. JeanMartinCharcotnel
1874evidenzidelledifferenzerispettoallamalattiastudiatadaAran,siaper
laprecocecompromissionebulbarecheperlapresenzadispasticit.
TalequadroclinicovennedenominatoSclerosiLateraleAmiotrofica(SLA).
LaSLAancheconosciutacon ilnomedimalattiadiLouGehrig.Questo
personaggiofuungrandecampionedibaseballdeiNewYorkYankeeschesi
ammaldiquestamalattianel1939(Brown,1997).
Il termine di sclerosi laterale si riferisce alla consistenza dura delmidollo
spinale che si riscontra allesame autopticodeipazienti e che dovuta alla
proliferazione di astrociti ed alla presenza di cicatrici fibrose nelle colonne
laterali del midollo spinale. Queste fibrosit sono lespressione
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dellalterazione dei tratti corticospinali in cui decorrono gli assoni dei
motoneuroni superiori cheprovengonodalla cortecciamotoria edal tronco
dellencefalo e che terminano nelle corna anteriori del midollo spinale, a
ridossodeimotoneuroni inferiori.Iltermineamiotroficasinonimodiatrofia
muscolareneurogenica,asottolineare lorigineneurologicadellaparalisiche
caratterizzalamalattia(Fig.1).
Fig.1VienervosecherisultanodanneggiatenellaSLA(daRowland,2001)
Sebbene la degenerazione dei motoneuroni (Fig. 2) sia progressiva dalla
corteccia, al tronco encefalico ed alle corna anteriori, alcuni motoneuroni
restano indenni, inparticolarequellideimuscolioculariequellideputatial
controllovolontariodeglisfinterivescicali(Kandeletal.,1991).
Iprimisintomivarianodaun individuoallaltroma ingenereconsistono in
alterazionimotorie, affaticamentodellebraccia edellegambe,difficoltnel
parlare, crampimuscolari. Lemani sono colpite per prime rendendo cos
difficili le normali attivit quotidiane e, soprattutto, lesecuzione dei
movimentifinicomescrivereamacchina,afferrareunapalla,contaremonete.
Con ilprogrediredellamalattia sihaparalisi completadegli arti ediventa
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difficile deglutire, masticare e parlare. La paralisi dei muscoli respiratori
rende infinenecessaria laventilazioneassistita ed una causa frequentedi
morte.Lanotevoleselettivitdellamorteneuronalefainmodochevengano
risparmiate le componenti sensitive e cerebrali necessarie alle funzioni
cognitive.
Fig.2Differenzatrailmuscoloeilneuronespinaleincondizioninormaliedurantelapatologia.Progressivamentelafibranervosadegeneraeiltonomuscolarediminuisce.
Questo comporta che il malato assista in piena lucidit alla perdita
progressiva delle proprie capacit motorie (Harrison et al., 1995). E stata
tuttavia riscontrata demenza frontotemporale, in circa il 23% dei pazienti,
caratterizzata da profondi cambi della personalit.Questo fenomeno pi
comune traquelli conuna storia familiaredidemenza e sembra esserepi
comunediquantopensatoinprecedenza(Brown,1997).
LaSLAunapatologiachecolpiscepifrequentementegliindividuidisesso
maschileecheinsorgeabitualmentetrai50ei60anni.Lincidenzaannuale
di 1,7 casi per 100.000 abitanti (Worms, 2001). Lesito della SLA sempre
fatale, in un periodomedio di 23 anni. Il 90% dei casi appartengono alla
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formasporadicadellamalattia(sSLA).Ilrestante10%deicasiappartengono
alla forma familiare (fSLA) che si trasmette con modalit autosomica
dominante ad alta penetranza o con penetranza ed espressivit variabili.
Clinicamente la fSLA simile alla forma sporadicama il debutto agli arti
inferioripi frequentee ildeterioramentomentalepresentenel15%dei
casi (Fazio e Loeb, 1999). Esiste anche una rara forma giovanile che si
trasmette con modalit autosomica recessiva. Lesordio della malattia si
manifestainetinfantile(etmedia35anni)esembraessereprovocatadalla
mutazione del gene ALS2 che codifica per una porteina importante nella
formazionedelcitoscheletro.Lasopravvivenzadicirca15anni(Rabinetal.,
1999).
1.1 IpotesipatogenetichediSLA
Leziologia e la patogenesi della SLA sono attualmente in gran parte
sconosciute.Essavieneconsiderataunamalattiadegenerativamultifattoriale,
nella quale lamorte cellulare conseguente alla complessa interazione di
diversecomponenti, lacui importanzapuvariareneidifferentisottogruppi
dipazienti (Shaw andEggett, 2000).Gli attuali studimolecolari sulla SLA,
infatti, focalizzano limportanzadei fattori genetici (MajoorKrakauer et al.,
2003), in associazione con fattori ambientali (traumi, attivit fisica intensa,
agenti chimici, shock elettrici, metalli pesanti, agenti infettivi etc.)
nellattivazionedelprocessopatologico(Cozzolinoetal.,2008).
Inparticolaretra ifattorigenetici,sonostate identificatecirca135mutazioni
del gene che codifica per lenzima rame/zinco superossido dismutasi (SOD1),
(SorianiandDesnuelle,2009),lequalipotrebberoinnescarediversifenomeni
osservati nella patologia come: stress ossidativo, tossicit da glutammato,
autoimmunit,aggregatiproteici(inclusioni),disorganizzazionedeifilamenti
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intermedi, modificazioni del sistema di trasporto assonale anterogrado e
retrogrado,attivazionedellamicrogliae interazionecon lecelluleneuronali,
infiammazione e deregolazione dei fattori di crescita. Infine sono stati
riscontratiaumentidelcalciointracellulareeattivazionedellevieapoptotiche
comeulteriorimeccanismi coinvoltinellaneurodegenerazioneosservatanei
pazientiSLA.
1.1.1 SOD1(Cu/ZnSuperossidodismutasi)
Gli studi sulletiologia della SLA hanno portato negli anni novanta
allidentificazionediunamutazionegeneticaacaricodellenzima rame/zinco
superossidodismutasi,riscontratanel20%deipazientiaffettidafSLA(Rosen
etal.,1993)eoccasionalmentedapazientisSLA (Orrell,2000).La rame/zinco
superossido dismutasi, prodotto del gene sod1, il principale enzima
antiossidante localizzato prevalentemente nel citosol, nel nucleo, nella
membrana mitocondriale degli eucarioti e nello spazio periplasmatico dei
procarioti. Negli eucarioti esiste anche unaltra superossido dismutasi,
caratterizzata da un atomo di manganese, localizzata nei mitocondri e
prodottadalgenesod2.
Ilgenesod1localizzatosulcromosoma21,consistedi5esoniecodificaper
unacatenapeptidicadi153amminoacidi(16KDa).Lenzimaeucarioticoun
omodimero di 32 kDa, con una sequenza altamente conservata e
caratterizzato da siti di legame per rame e zinco e da ponti disolfuro in
ognunadelleduesubunit(ValentineandHart,2003)(Fig.3).
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Fig.3StrutturacristallinadellegamedimericodiSOD1umano.Gliionidirameezincosonomostratirispettivamentecomesferebluearancione.Illoopdizincocoloratoinarancione.Illoopelettrostatico
inverde(daValentineS.etal,2005)
Questo enzima catalizza la dismutazione del superossido (O2), prodotto
principalmentepererroridurantelafosforilazioneossidativamitocondriale,e
produce perossido didrogeno (H2O2) e acqua (H2O) riducendo i livelli di
superossidoelimitando,quindi,lostressossidativo.Lareazionecatalizzata
induepassaggiasimmetricitramiteunatomodiramechealternativamente
ridottoeossidatodalsuperossido.
LaSOD1largamenteespressanelsistemanervosocentraledeimammiferie
rappresentacirca l1%di tutte leproteinedelcervello.Edifficilericondurre
lespressione ubiquitaria di questo enzima alla degenerazione selettiva dei
motoneuroni. Questi ultimi, normalmente, presentano un contenuto
notevolmente elevato di proteina SOD1 rispetto a tutte le altre cellule del
sistema nervoso (Shaw and Eggett, 2000). La localizzazione
immunoistochimicadella SOD1 neimotoneuroni rivela la suapresenzanel
corpo cellulare e nei processi assonali che si estendono verso la giunzione
neuromuscolare (Pardoetal.,1995).Leprime ricercheeffettuate sul sangue
deipazientiSLAsuggerivanounariduzionedellattivitdiquestoenzimaesi
ritenevaquindi chequesta fosse la causadellamalattia (Rosenetal.,1993).
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Successivi studi hanno per smentito questa ipotesi. Lemutazioni a carico
della SOD1 determinerebbero lacquisizione di una o pi funzioni tossiche
(gainoffunction)acaricodellenzima,piuttostocheunasemplicediminuzione
della capacit di scavenging dello ione superossido (Cudkowicz et al.,
1997). Infatti, tuttora ilmodello sperimentaledi SLApi simile alla forma
umana familiare epiutilizzato il topo transgenicoG93A (Fig. 4), in cui
lenzimaSOD1presentaunamutazionepuntiformeGlicina93Alaninapurmantenendo elevati i livelli di attivit enzimatica (Gurney et al., 1994). In
questomodellosiriscontraunaumentodella funzioneperossidasicaconun
conseguenteaumentodellaformazionediradicali liberirapidamenerispetto
allaproteinawildtype.
Fig.4FenotipodelmodelloanimaledifSLA,G93A(destra)allafinedellamalattia(circa4mesiemezzo),rispettoaltoponontransgenicowildtype(sinistra).Siosservanoevidentisegniallezampe
posteriori(frecciarossa)eperditadeltonomuscolare(frecciabianca).
Questo dato stato confermato anche da altri studi condotti su topi
transgenicichesviluppavanolaSLA.Questitopiesprimevanoaltredifferenti
mutazioni del gene sod1 le quali causavano unattivit enzimatica SOD1
uguale o superiore alla condizione wildtype (Wong et al., 1995) o non
producevano alcuna attivit enzimatica (Bruijn et al., 1997). Infine stato
dimostrato che topi privi dellenzima SOD1 non presentavano la
degenerazionedeimotoneuroni(Reaumeetal.,1996).Daquestidiversilavori
risultaquindichediversemutazioniacaricodellenzimaSOD1determinano
lacquisizioneda partedi questo enzima dipropriet tossiche, responsabili
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dellinsorgenza della SLA, indipendenti dal livello di attivit dellenzima
stesso (Fig.5) (Cleveland,1999).Lemutazionia caricodiquestogene sono
principalmentesostituzionidiamminoacidi.Inizialmentesieraipotizzatoche
tutte le mutazioni fossero localizzate sullasse principale del dimero della
SOD1ma gli studi successivi hanno evidenziato una distribuzione casuale
dellemutazioninellastrutturaprimariaeterziariadellenzima.Tremutazioni
alterano uno dei quattro residui che coordinano il rame, e almeno sette
causano modificazioni dello schema di lettura degli esoni (splicing),
determinandoiltagliodegliultimiventiotrentaamminoacidi(Clevelandand
Rothstein,2001).La relazione tra lemutazionidelgeneSOD1e laSLAnon
sonoancorachiare.
NormalActivityofSuperoxideDismutase1SOD1Cu2++O2(SOD1Cu++O2
SOD1Cu++O2(SOD1Cu2++H2O2
GenerationofHydroxylRadicalsSOD1Cu2++H2O2(SOD1Cu++O2+2H+SOD1Cu++H2O2(SOD1Cu2++OH+OH
NitrationofTyrosine
SOD1Cu2++ONOOSOD1CuO....NO2+SOD1CuO....NO2++TyrSOD1Cu2++OH+NO2Tyr
Fig.5Reazioniossidativemediatedallasuperossidodismutase(SOD1).LaSOD1normalmentecatalizzalaconversiondianionisuperossido(O2)tossiciperlacellulainperossidodidrogenoH2O2(inalto).LemutazioniacaricodelgenechecodificalaSOD1possonorevertirequestareazioneportandoallaformazionedelradicaletossicoidrossileOH(alcentro)o
utilizzarealtrisubstratireattivicomeilperossinitritoONOO,causandocoslanitrazioneanomaladeiresiduiditirosinanelleproteine(inbasso).
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DiversesonoleipotesichepossonocausarelaSLA,alcunediquestesaranno
diseguitoanalizzate.
1.1.2 Alterazionimitocondriali,vacuolizzazioneestressossidativo
Studi recenti hanno evidenziato che i mitocondri, che sono la centrale
energeticadellacellula,sianofraibersagliprecocideldannoaimotoneuroni.
NeipazientieneimodellisperimentalidiSLA, ladisfunzionemitocondriale
siosservaprecocemente epotrebbe essere la causadelladegenerazionedei
motoneuroni, e quindi della paralisi dei pazienti (Beal, 2005). Imitocondri
alterati e i vacuoli sono stati per lo pi osservati nei dendriti di diverso
calibro,neicorpicellularieinalcuniassonideineuronidellecornaanteriori
(Bendottietal.,2001).Imitocondripotrebberoessereiprimisitidanneggiati
nei topi G93A. Lalterata capacit metalbinding porta allaccumulo nello
spaziointermembranadiionirame(OkadoMatsumotoandFridovich,2002),
oppureprovoca lacatalisidireazionicon laproduzionedimolecolereattive
chedanneggianoimitocondri.Alternativamente,lealterazionimitocondriali
potrebbero essere il risultato di cambiamenti nella permeabilit
mitocondriale, risultanti da uno scorretto funzionamento di un canale
voltaggiodipendente permeabile ai cationi, il MPTP (Mitochondrial
PermeabilityTransitionPore).Ilmalfunzionamentodiquestocanalepotrebbe
essere indotto da un eccessivo aumento intracellulare di calcio o di agenti
ossidanticomeiROS(ReactiveOxygenSpecies)(Carrietal.,1997,Liuetal.,
1999) ediglutammato.LaSOD1mutata infatti, agendo comeperossidasi e
convertendoilperossidodidrogenoinradicalitossicidiverrebbeunafontedi
radicali liberi. Il danno ossidativopotrebbe essere lultima via comune che
determina la morte del motoneurone come conseguenza di diversi
meccanismieziopatogenetici.
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1.1.3 Anormalitcitoscheletricheeaggregazioneproteica
I neurofilamenti sono proteine composte da tre monomeri: la subunit
leggera(NFL),lasubunitmedia(NFM)equellapesante(NFH)(Julien,1999).
Nei topiG93A ineurofilamenti fosforilati si localizzanoneicorpicellularie
negli assoni prossimali dei motoneuroni (Tortarolo et al., 2003) e quando
diventano iperfosforilati, il loro trasporto pu non essere funzionale, e ci
portaal loroaccumulo (Shibataetal.,2001).Si ritiene chequestoaccumulo
possa essere originato dallalterata fosforilazione proteica prodotta dalle
chinasi. Nel midollo spinale di topi G93A, infatti, stato rilevato un
progressivo accumulo di p38MAPK (un componente della famiglia serin
treonin chinasiMAPK), che procede parallelamente alla degenerazione dei
motoneuroni. p38MAPK attivato sia da un aumento del livello di
glutammatoextracellulare,siadallapresenzadicitochinepro infiammatorie
(Tortaroloetal.,2003).
Nella fase dimalattia conclamata, imotoneuroni delle corna anteriori del
midolloappaionoatroficieridottidinumero(Woodetal.,2003).Leinclusioni
citoplasmaticheubiquitinate risultano esserepositiveallimmunoistochimica
perglianticorpiantiSOD1,localizzatenelcorpocellulareenegliassoni,che
appaiono rigonfi. Studi ultrastrutturali mostrano la presenza in esse di
neurofilamentiassociatiafibrilledimaggiorspessoreeappaionomoltosimili
aicorpidiLewy,ritrovatiinpazientiSLA.Latossicitassociataallaccumulo
di aggregati proteici intracellulari sta emergendo come una dellemaggiori
ipotesipatogenetichenellemalattiedeimotoneuroniepi ingeneralenella
neurodegenerazione(ClevelandandRothstein,2001).
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1.1.4 MeccanismiintercellularinellapatogenesidellaSLA
Crescentievidenze indicanoche lamortedeineuroninonunprocessoche
coinvolgeesclusivamentequestecellule,macontuttaprobabilitilrisultato
di una complessa interazione con le cellule ad essi adiacenti, per lo pi
astrocitiemicroglia.Asostegnodiquestipotesiilfattocheitopitransgenici
cheesprimonolaSOD1mutataesclusivamenteneimotoneuroni,osolonegli
astrociti,nonsonoingradodiinnescareunprocessopatologicocomequello
osservatoquandolenzimamutatoespressoinmodoubiquitario(Boilleeet
al.,2006,Raibonetal.,2008).
Gliastrocitie lamicroglia,anchesenonmorfologicamentealteratinellafase
precocedellamalattia,sembranoesseringradodiliberarenelmicroambiente
intornoaimotoneuroniunaseriedi fattorineurotossicichecomprendono le
citochine,ilglutammatoelossidonitrico(Raibonetal.,2008).Inparticolare,
lespressione di TNF, una citochina principalmente secreta da astrociti e
microglia nel sistema nervoso centrale (SNC), edel suo recettore, risultano
notevolmenteaumentatinelmidollospinaleditopiG93Aprimadellaperdita
deimotoneuroniedellareattivitgliale(Boilleeetal.,2006).
IlTNFhanelSNCdiversieffetti,quali lalterazionedei livellidi fattoridi
crescita e di altre citochine, del glutammato, dei recettori AMPA, della
periferinaediunampiagammadisecondimessaggeriintracellulariqualila
p38MAPKe lOssidonitrico (NO). IlTNFcontribuisce inoltrealcontrollo
delle risposte immunitarie e recentemente stato riportato che limmunit
indottadaripetute iniezionidi liposaccaridesia lacausadiunasignificativa
anticipazione dellamalattia nei topi G93A (Nguyen et al., 2004). LNO, il
glutammato e i ROS rappresentano dei fattori intercellulari fisiologici
importantinel crosstalk tra cellule glialieneuroni,ma in certe condizioni
possono diventare dannosi per le cellule pi vulnerabili, ad esempio i
motoneuroni.Essi, inoltre,possonocontribuireallapropagazionedeldanno
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neuronale.Un sostegno a questipotesiderivada studi effettuati su culture
miste di motoneuroni e astrociti che dimostrano che i ROS prodotti nei
motoneuroni, in risposta ad un insulto di tipo eccitotossico, inducono un
danno ossidativo del trasportatore del glutammato negli astrociti adiacenti
(Rao and Weiss, 2004). Questo amplificherebbe lo stress eccitotossico dei
motoneuroni risultando in un circolo vizioso, determinante per la
progressione della malattia. Lipotesi di un crosstalk tra cellule gliali e
motoneuroni (VanDenBosch andRobberecht, 2008) emerge anchedauno
studio recente su topi transgenici chimerici tra SOD1mutata e SOD1wild
type,neiqualistatodimostratochelaSOD1mutataincellulenonneuronali
cocoltivate con motoneuroni privi della proteina mutata, in grado di
indurre in questi ultimi un continuo accumulo intracellulare di proteine
aberranti ubiquitinate sino a portare alla formazione delle inclusioni
filamentoseesferoidalitipichedellaSLA(Clementetal.,2003,Jaarsmaetal.,
2008)
1.1.5 Dannoeccitossico
LeccitossicitdovutoadaccumulodiLglutammatoedialtresostanzesimili,
un processo patogenetico in seguito al quale la cellula nervosa risulta
fortementedanneggiata(Struzynska,2009).Negliultimiannistatoproposto
che la SLA non sia una patologia isolata dei motoneuroni ma che sia
conseguenteadalterazionidelleinterazionitraimotoneuronielecircostanti
cellulegliali.Unmeccanismo ritenuto importanteper laSLA sembraessere
leccitotossicit causata da una eccessiva attivazione dei recettori per il
glutammato(Coronaetal.,2007).
Ilconcettodieccitossicitstato introdottoda JohnOlney ilquale ladefin
come un fenomeno in cui lazione eccitatoria del glutammato viene
trasformata inunprocessoneuropatologicochepu rapidamenteuccidere i
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neuroni del SNC (Olney, 1978). Il fenomeno viene di solito attribuito al
glutammatomapuessereindottodamoltialtriamminoacidiendogeniquali
lacidoaspartico, lacidoomocisteico e lacidoquisqualico (Lodge,1988).Le
cause principali di una eccessiva attivazione dei recettori postsinaptici
glutamatergici possono derivare sia da una eccessiva produzione del
glutammato, sia da un suo ridotto assorbimento ma non possono essere
esclusi altri fattori quali la localizzazione e le propriet molecolari dei
recettori, lattivitdi altri recettori canali emeccanismi intracellulariavalle
dellattivazionerecettoriale.
Il glutammato il principale neurotrasmettitore eccitatorio del sistema
nervosocentraledeivertebrati.Agiscesurecettorimetabotropici,accoppiatia
sistemidisecondimessaggeriattraversoproteineG,esurecettoriionotropici,
canali ioniciattivatidallinterazionecon ilglutammatoocon i suoiagonisti
quali lAMPA (acido amino3idrossi5metil4isoxazolepropionico), il
kainatoelNMDA(NmetilDaspartato).
I livelli extracellulari di glutammato sono finemente regolati da proteine
transmembrana che hanno la funzione di trasportatore del glutammato.Ci
sonodiverse classidi trasportatori sia suineuroni, sia sugli astrocitima la
maggior parte del riassorbimento del glutammato sembra essere mediato
dagliastrociti(AndersonandSwanson,2000)(Fig.6).
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Fig.6Neurotrasmissioneglutammatergicaecascataapoptotica.LarrivodiunpotenzialedazioneinduceuninflussodiCalciochecausalafusionedellevescicolerilasciantiglutammatonellafessurasinaptica.SullamembranadellacellulapostsinapticasiattivanoirecettoriAMPAcheinduconouninflussodisodioeladepolarizzazionedellamembrana.IlbloccofisiologicodeirecettoriNMDAdapartedelloioneMagnesiovienerimossoediconseguenzasihaunentratadiCalcioallinternodellacellulapostsinaptica.Ilglutammatoineccessochenormalmentevienerimossodaspecificheproteinelocalizzatesianegliastrociti(GLT1eGLAST)cheneineuroni(EAAC1),vienemetabolizzatoaglutamminanellecelluleglialiperazionedellaglutamminasintetasi(GS)ericaptatodaineuroni.Unalterazionedelturnoverdelglutammatoinduceunaccumulodiquestoneurotrasmettitoreeconseguentementeuneccitotossiciteprobabilemortecellulare.Ilcalciointracellulareineccesso
inducelattivazionedidiversienzimielaproduzionediROScondannoalmitocondrio,ossidazionedilipidi,proteineeDNA.
Il trasportatoreglialemurinoGLT1 (ratglialglutamate transporter)e ilsuo
equivalenteumanoEAAT2 (excitatory amino acid transporter 2) sono stati
ritenuti particolarmente interessanti riguardo la SLA (Rothstein, 1995). Il
trasporto di glutammato pu essere alterato, ad esempio, per una perdita
delle proteine responsabili del trasporto. In pazienti con SLA allo stadio
terminale,coscomeneitopitransgeniciSOD1,sihaunariduzionedellivello
deitrasportatori(Bruijnetal.,1997).Studidiimmunoblottingdimostrano,in
pazientiaffettidaSLA,unasostanzialeperditadeltrasportatoreglialeEAAT
2siaa livellocorticalechemidollare(Linetal.,1998).Contemporaneamente
per,altreindaginibiomolecolari,qualiadesempiolibridazioneinsitu,pur
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confermando la diminuizione di EAAT2 a livello delmidollo, non hanno
riscontrato nessuna variazione a livello della cortecciamotoria (Shaw and
Eggett, 2000). comunque chiaro che il trasporto del glutammato pu
svolgere un ruolo attivo nella morte neuronale, mediando fenomeni di
eccitotossicit diretta. stato anche dimostrato che la sovraespressione di
EAAT2svolgeunruoloneuroprotettivoinunmodellomurinodiSLA.Infatti
topi doppi transgenici EAAT2/G93A, ottenuti incrociando topi che
sovraesprimono EAAT2 con topi che sovraesprimono la SOD1 umana
mutata (G93A), sono caratterizzati da un ritardo nellinizio e nella
progressionedellamalattia(Guoetal.,2003).
Altra possibile disfunzione del trasporto del glutammato pu derivare da
unalterazione funzionale dei trasportatori come diretta conseguenza di un
danno ossidativo, dalmomento che i trasportatori sono sottoposti ad una
regolazione da parte degli ossidanti (Trotti et al., 2001). Rao e Weiss
suggeriscono poi che leccitotossicit provochi nei motoneuroni una
produzionediROS chepotrebbedanneggiare i trasportatoridiglutammato
degli astrociti (Rao and Weiss, 2004). Questa ipotesi si basa, tra laltro,
sullelevataconcentrazionedeltrasportatoreEAAT2,danneggiatoneipazienti
SLA, che si trova nei processi degli astrociti a diretto contatto con i
motoneuroni(Guoetal.,2003).
1.1.6 IcanaliionicinellaSLA
Le alterazionidei trasportatoridelglutammatoportano adun accumulodi
questo neurotrasmettitori nello spazio extracellulare. Questo evento
rappresenta una delle cause del fenomeno delleccitotossicit da
gluatammato (Heath and Shaw, 2002). Durante questo processo si assiste
primadi tuttoadun ingressodi ionisodioecloro,accompagnatidaacqua,
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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come risultato della depolarizzazione e quindi ad un rigonfiamento del
neuronechepuessere interrottocon larimozionedellagonista.Durante la
seconda fase, siverificaun influssodicalcionelneuroneattraverso icanali
voltaggiodipendenti (Choi,1988), idei recettoriNMDAe i recettoriAMPA
(HeathandShaw,2002).
Latossicitpuinoltreessereuneventosecondariochesiverificadopoaltri
eventi patologici. La causa primaria pu essere una compromissione del
bilancioenergeticodelneurone.SihaquindiunaridottaproduzionediATPe
unmalfunzionamentodellapompaNa+/K+ATPasiconconseguenteriduzione
del potenziale di membrana. In seguito a questa riduzione si ha una
iperattivazione dei recettori NMDA che normalmente sono bloccati dal
magnesio.Lecellulerisultanocosdepolarizzateancheabasseconcentrazioni
diglutammato(Ludolphetal.,2000).
IrecettoriAMPAsonodeicomplessiproteicicostituitidavariecombinazioni
di 4 subunit (GluR14), che vanno a costituire un canale permeabile ai
cationi. La subunitGluR2 legata alla permeabilit di questo recettore al
Ca2+.LamancanzadiGluR2determinainfattilaformazionedirecettoricanali
AMPA con alta permeabilit al calcio.Queste propriet della GluR2 sono
attribuibiliallapresenzadiunaargininaneldominiodellasubunitcoinvolto
nella formazionedelporo ionico,alpostodiunaglutammina, che invece
tipicadellealtresubunitdellAMPA(Humeetal.,1991).statopropostoche
laselettivavulnerabilitdeimotoneuronipotessederivaredallapresenzadi
recettori altamente permeabili al calcio (BarPeled et al., 1999) e, quindi,
dallassenza o dalla diminuzione di espressione della subunit GluR2. A
supporto di queste ipotesi stata dimostrata la presenza di recettori
permeabili al calcio in motoneuroni in coltura (Carriedo et al., 1996).
Applicando tecniche di RTPCR (ReverseTranscriptase Polymerase Chain
Reaction)alcunilavorihannoinveceriportatochenonvialcunaalterazione
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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nellespressione della subunit GluR2 in condizioni di controllo, SOD1 e
G93A (Spallonietal.,2004).Risulta invecesignificativaunavariazionenella
frequenzadiespressionedelle subunitGluR3eGluR4.Queste sono infatti
notevolmente superiori nella popolazione G93A rispetto ai due controlli,
murinoetransgenico(Spallonietal.,2004).
In condizioni normali esiste una fine regolazione della concentrazione
intracellularedicalciolibero,chemantieneisuoilivellialdisottodi0,1M
(CasellaeTaglietti,1996).Come conseguenzadiuna eccessiva stimolazione
deirecettoridelglutammato,siverificaunadestabilizzazionedellaomeostasi
delcalciointracellulare,inseguitoallaqualesideterminalattivazionediuna
cascatadieventibiochimicicitotossicichevedecoinvoltienzimiquali lipasi,
fosfolipasi,endonucleasi,ossidonitricosintetasi,proteinachinasiCexantina
ossidasi.Questiprocessipossonodanneggiareilneuronesiadirettamenteche
attraversolaformazionediradicaliliberi(Rothstein,1995).
Per comprenderemeglio il ruolodei recettoriAMPAnellapatogenesidella
SLAsonostaticondottideglistudielettrofisiologicisumotoneuronispinaliin
colturaprimaria,utilizzandounmodellomurinodifSLA.Questistudihanno
evidenziatoneimotoneuroniG93Adellealterazionidellapermeabilitionica
deirecettoriAMPA(Pierietal.,2003)chepotrebberoessere inrelazionecon
alcunedifferenzea livellobiomolecolaredelle subunitdei recettoriAMPA
(Spallonietal.,2004).ItopitransgeniciG93AesprimonodeicanaliAMPAcon
unapermeabilitalsodioealpotassioalmenotrevoltesuperioreaquelladei
SOD1 mentre la permeabilit al calcio non sembra essere modificata.
Leccitotossicit sembra quindi non essere correlabile ad un aumento della
concentrazionedel calciodirettamentemediatadai recettoriAMPA/KA,ma
potrebbeessereriferitaadunaattivazionedeirecettorivoltaggiodipendenti
delcalcio,attivatiaseguitodelladepolarizzazionemediatadairecettorinon
NMDA(Pierietal.,2003).Laumentointernodicalciopotrebbeancheessere
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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dovutoalmaggioreingressodisodiochesiverificasempreattraversoquesti
recettori. La presenza di unamaggior quantit di questo ione attiverebbe,
infatti,unoscambiatoreNa+/Ca2+lacuiazionedeterminerebbeuningressodi
ioni calcio allinterno del neurone. Questa ipotesi anche avvalorata
dallazione di uno dei pochi farmaci utilizzati nella terapia della SLA, il
riluzolo.Sidimostratoinfattichequestasostanzaingradodiinteragire,in
colture primarie di corteccia di ratto, con le correnti ioniche di sodio, sia
voltaggiodipendentichemediatedallattivazionedeirecettoriAMPA (Zona
et al., 1998 , Zona et al., 2002). Gli stessi studi sono stati poi condotti su
motoneuronimurini confermando che il riluzolo in grado di bloccare le
correnti indotte dal kainato (Albo et al., 2004). A conferma di quanto
dimostrato invitro,statoosservatocheanche invivo leccitotossicithaun
ruolocrucialeneldannoneuronaleindottodaeventicomelischemia(Martin
et al., 1998), e si pensa che possa giocare un ruolo importante nella lenta
degenerazione neuronale che si verifica nella SLA. Questa ipotesi stata
confermata dagli elevati livelli di glutammato registrati nel fluido
cerebrospinale di pazienti SLA (Plaitakis and Caroscio, 1987) e dal deficit
delle capacit di trasporto riscontrata nelmidollo spinale e nella corteccia
motoriadel40%pazienticonsSLA(Rothstein,1995).
Nei motoneuroni di topi G93A, attraverso esperimenti di patch clamp e
calciumimaging,statoriscontrataunalterazionenellomeostasidelcalcioin
seguitoadattivazionedeirecettoriAMPArispettoaicontrolli(Guatteoetal.,
2007).notoche lingressodelcalcioe lasua localizzazione inmicrodomini
intracellulari dia origine allattivazione di diverse vie di trasduzione del
segnalechemedianorisposte fisiologiche indipendenti.Diversi lavorihanno
mostrato che tra queste risposte alcune possono indurre processi di
neurotossicitmediatidalcalcio(GhoshandGreenberg,1995).Ilcalcioentra
nel neurone durante la neurotrasmissione non solo attraverso i recettori
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ionotropici del glutammato ma anche tramite i canali ionici voltaggio
dipendenti (Powers and Binder, 2001). Leccitabilit neuronale potrebbe
essere cos uno dei maggiori contributi alla vulnerabilit eccitotossica. Le
cellule che generano potenziali dazione con frequenzamaggiore risultano
infatti maggiormente vulnerabili alleccitotossicit. Inoltre un aumento
delleccitabilit neuronale potrebbe contribuire a cambiamenti nello stress
ossidativo (Hand and Rouleau, 2002) come anche a cambiamenti
mitocondrialiedelmetabolismoenergetico(Browneetal.,2006).
Recentementestatoosservatochelealterazioninelleproprietdiscaricasia
dimotoneuroni che di cellule corticali nelmodello di SLA,G93A, fossero
dovuteallalterazionedispecificicanaliionicidelsodiovoltaggiodipendenti
(Pieri et al., 2003, Pieri et al., 2009). Queste potrebbero innescare
lipereccitabilit dei neuroni G93A e quindi una maggiore vulnerabilit
allingressodicalcio.
1.1.7 Fattoridirischioambientali
Ilrapportocon lambiente fondamentaleperdeterminare lostatodisalute
della popolazione umana e la relazione tra lindividuo e i diversi fattori
ambientali pu avere risvolti diversi sullequilibrio salute/malattia.
necessario studiare, conoscere e comprendere quali siano gli elementi da
considerare,daunpuntodivistaepidemiologico,pervalutare limpattodei
diversifattorisullostatodisalute(MiglioreandCoppede,2009).
AllinsorgenzadellaSLApossonoconcorrereanchecauseditipoambientale
come lesposizioneadagenti tossici,qualimetallipesanti,pesticidi, solventi
chimicie intossicazioni cronichedapiombo, selenio,mercurioemanganese
(Johnson and Atchison, 2009). Tra gli agenti tossici, quelli maggiormente
chiamatiincausasonoipesticidieifertilizzanti.Ineffetti,secondounostudio
epidemiologico condotto in Sardegna, la prevalenza della malattia tra gli
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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agricoltori doppia rispetto alla popolazione generale (Giagheddu et al.,
1983).Talisostanze,utilizzateancheperlamanutenzionedelcampodagioco,
potrebberoessere responsabilioltremododellinsorgenzadellamalattia tra i
calciatori (FerrazzaandSturchio,2007).Tra i fattoriambientalicorrelaticon
leziologiadellamalattianervosasonostatiidentificatiilfalloutradioattivo
legato alla sperimentazionedi arminucleari inGiapponenegli anni 5060
(Neilson et al., 1995) e le concentrazioni indoor di radon in Inghilterra
determinateneglianni8189(FerrazzaandSturchio,2007).
Tra gli studi epidemiologici sulla SLA, condotti su specifiche categorie di
persone, ipinoti sonoquelli che riguardanogli atleti chepraticanovarie
disciplinesportiveeimilitari.Daquestidatiemersochegiocatoridicalcio
professionisti,maratoneti eveteranidellaGuerradelGolfo sonomoltopi
esposti al rischio di sviluppare questa patologia rispetto alla popolazione
generale(Horneretal.,2003).
Inoltre recentemente sono stati studiati gli effetti molto pericolosi della
diffusione dei cianobatteri.Questimicrorganismi sembrano essere associati
alla produzione di neurotossine e citotossine come il BMAA (N
methylaminoLalanine), lanatossina, la saxitossina, la curacina, la
microcistina e la cilindrospermopsina. Tutte queste molecole si legano a
bersaglipresentinel sistemanervoso centrale eperiferico e sono altamente
diffuse in ambienti terrestri e marini. Recentemente stata riscontrata la
presenzadialcunediquestesostanzetossiche in integratoridietetici(Funari
andTestai,2008).
UnavarianteparticolaredellaSLAilcosiddettocomplessoSLAParkinson
Demenza (SLAPDC) di Guam, unisola dellOceano Pacifico sotto
giurisdizioneUSA.Questamalattiastatamessainrelazioneconilconsumo
da parte dei nativi di due specie di pipistrello (le volpi volanti, Pteropus
tokudaeeP.mariannus)chesialimentanodisemiefogliediCycascircinalisL,
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contenenti un aminoacido neurotossico, la NmetilaminoLalanina
(BMAA). Questultimo un amminoacido del tutto particolare in quanto
appartieneallacategoriadelle fontialimentaridiazotononproteico.noto
infatti che la LBMAA, in analogia con unaltra tossina implicata nel
neurolatirismo (la bNoxalilamminoLalanina, LBOAA) provoca
eccitossicit mediata dallattivazione dei recettori glutamatergici di tipo
AMPA.ImodellisperimentaliapprontatiperriprodurrelaSLAmedianteuso
delleneurotossinenonsisonorivelatiefficaci.Cidamettere inrelazione
allanecessitdialtrifattorichecondizionanopesantementelinstaurarsidella
patologia.
Cox et al., (Cox et al., 2003) hannomesso in evidenza come la BMAA sia
prodotta da qualunque genere di cianobatterio simbionte delle radici
coralloididelleCycas.Daquilatossinaincorporataneisemidellapianta,e
daquiallevolpivolanti,doveraggiungeconcentrazioni10.000voltesuperiori
aquellenellorganismoproduttore (biomagnification).Murchetal. (Murchet
al., 2004)hanno riscontrato laBMAA in cervellidipazienti affettida SLA
PDC e daAlzheimer.Questo dato non stato confermato in altri pazienti
affettidallestessepatologie(sMontineetal.,2005).SebbeneilruolodiBMAA
nellemalattieneurodegenerative sia altamente indiscussione, ci sono studi
che dimostrano che questa sostanza sia in grado dimimare la tossicit da
glutammato e per questo la sporadicit di alcuni casi di SLA. Il BMAA
attraversa la barriera ematoencefalica attraverso il trasportatore ad alta
affinit L1, ma non attivo fino a che non si associa con il bicarbonato
assumendounastrutturechemimaquelladelglutammatoedattivairecettori
glutammatergiciinducendolamorteneuronale(Stipaetal.,2006).
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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1.2 AttivitfisicaeinsorgenzadiSLA
LaSLAnelcorsodiquestiultimiannistatafrequentementeassociatasiaa
lavori fisici particolarmente pesanti che alla pratica di sport di resistenza,
ancheseadogginessunacertezzascientificaemersa,eccettodatidiricerche
epidemiologichecherimangonocontroversi (Kirkinezosetal.,2003,Valenti
etal.,2005,Veldinketal.,2005).Traquesti,idatiraccoltisonoprovenientida
casianeddoticiedastudicasocontrollo.
Tra i casi aneddotici, spesso ampiamente ripresi dai mass media, che
storicamente possono essere fatti risalire al caso del giocatore di baseball
americanoLouGehrig,chevennecolpitodallaSLAnel1939alletdi35anni
edecedettecirca2annidopo.Va inoltrericordato ilpiccoloma interessante
cluster di 3 giocatori di football americano che avevano giocato
contemporaneamente nella squadra dei San Francisco 49ers nel 1964 e che
svilupparonolaSLAquasicontemporaneamenteneglianni80.Questocluster
fu collegato aun fertilizzantediffusamenteusatonei campidi allenamento
dellasquadra, ilmilorganite.Caratteristicadiquesto fertilizzantediessere
costituito,inparte,dascartidilavorazionedellefonderieepertantodiessere
estremamente ricco di residui metallici. Questa osservazione non stata
successivamenteconfermata.
Recentemente, i ricercatori del Dipartimento diNeurologia dellUniversity
MedicalCenterdiUtrecht,hannovalutatoselattivitfisicapraticatanellarco
dellavita,per lavoroenel tempo libero, fosseassociataadunaumentodel
rischiodisvilupparelaSLAesecifosseunassociazionetraattivitfisica,la
suadurataeletdinsorgenzadellamalattia(Veldinketal.,2005).Daquesti
datiemersocheperi219pazientiricoveratipressoilCentro,trail2001edil
2002,condiagnosicerta,probabileopossibiledisclerosi lateraleamiotrofica
non era significativo lo svolgimento di unattivit sportiva rispetto ai 254
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soggettidicontrollo.
Gli studi casocontrollo sono basati sul confronto fra soggetti affetti dalla
malattiaecontrollisani,disolitoappaiatiperetesesso,chepermettonodi
ricercare retrospettivamente differenze di esposizione a presunti fattori
patogenetici. I risultati sullattivit sportiva finora pubblicati non hanno
fornitodatiunivoci,anche sealcunidiessi sembrano indicare lesistenzadi
un rapporto fra SLA e attivit sportiva intensa (Longstreth et al., 1998,
Scarmeas et al., 2002). Uno dei maggiori problemi di questi studi
rappresentato dalle differenti definizioni operative di attivit sportiva
utilizzate e dalluso di questionari retrospettivi, che spesso comportano
rispostescarsamenteaccuratedapartedeicasie/odeicontrolli.Finora,nonsi
chiarito inmodo esaustivo lesistenza di un rapporto fra SLA e attivit
sportivaoattivitfisicaintensa.
Sonostatepropostediverseipotesisulpossibilemeccanismopatogeneticoche
metterebbe incorrelazioneSLAeattivitsportiva,quali:(a)unattivitfisica
intensaeprolungatapotrebbeaumentareleffettodelleccitotossicitalivello
deimotoneuroni spinali; (b) lattivit fisicapotrebbe aumentare il livellodi
stressossidativo,forseattraversolaumentodellaformazionediradicaliliberi;
(c) i traumi correlati alla partecipazione allattivit sportiva potrebbero
danneggiare la funzione dei motoneuroni inducendone la degenerazione.
Anche idati sullattivit fisica nei topi transgenici SOD1,modello genetico
dellaSLA,nonsonodiaiuto,perchilavoripubblicatihannofornitorisultati
contraddittori, rilevando un effetto di tipo protettivo dellattivit fisica di
resistenzaolassenzadiuneffettosignificativo(Kirkinezosetal.,2003).
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1.3 IpotesidiSLAneicalciatoriinItalia
IlgiornalistaTomKington,inunarticolocomparsoil25Febbraio2003sulsito
internet della Uefa, fa riferimento ad inchieste giornalistiche e giudiziarie
italianesullabusodifarmacinellosporteperlaprimavoltaparladiMotor
neuroneMystery.
Recentemente,un aumentodi incidenzadi SLA fra calciatoriprofessionisti
italiani stata riscontrata in studi epidemiologici. Questi studi hanno
dimostrato un aumento di rischio di SLA di 6,510 volte fra i calciatori
professionistirispettoallapopolazionegenerale(Berettaetal.,2003,Piazzaet
al., 2004, Belli andVanacore, 2005,Chio et al., 2005,Vanacore et al., 2006,
Armon,2007,Taioli,2007b,Wicksetal.,2007,Chioetal.,2009) .Lecausedi
tale aumento sono ancora sconosciute ma fattori tossici, insieme a una
predisposizione individuale, sembrano poter avere un ruolo rilevante
(Mitchell,2000).
A seguitodiuninchiesta giudiziariapresso laProcuradellaRepubblicadi
Torino, stato confermato un aumento di rischio nella popolazione di
giocatoridi calcio in Italia.Questo aumento statovalutato induediversi
modaliteinstudiseparati(BelliandVanacore,2005,Vanacoreetal.,2006).
Il primo studio stato effettuato basandosi sui certificati dimorte su una
coorte di circa 24.000 calciatori professionisti e semiprofessionisti. Questo
studioharivelato lapresenzadiunsignificativoeccessodidecessiperSLA
nel periodo 19601996 rispetto a quanto atteso nella popolazione italiana
(trattodaidati ISTAT) (casiosservati8,casiattesi0,69) (BelliandVanacore,
2005, Vanacore et al., 2006). Questo eccesso risultato particolarmente
significativofraisoggettidietinferioreai60anni.Irisultatidiquestostudio
sono estremamente indicatividellesistenzadiun rapportopatogenetico fra
SLAecalcio,mapresentanoalcuniproblemimetodologici,quali:
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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(1)inaccuratezzadellediagnosiriportateneicertificatidimorte;
(2)lincompletezzadellacoortedicalciatoriutilizzatacheincludevagiocatori
siaprofessionistichenonprofessionisti;
(3)ilconfrontononcorrettofralediagnosidiSLAneigiocatoridicalcio,che
includevanolecausedimorteiniziale,intermedia,terminaleeaggiuntiva,ei
datidiriferimentoISTAT,cheincludonolasolacausadimorteiniziale;
(4)ilmancatocontrollodellediagnosidiSLAnellapopolazionedicalciatori.
Perovviareaquestiproblemi si sono impostati studi retrospettividi coorte
basatisuicalciatori tesseratiper lesquadrediserieAeBnelperiodo1970
2001identificatiattraversogliarchividelladittaPaniniegliarchividellEnte
NazionalediPrevidenzaeAssistenzaLavoratoridelloSpettacolo(ENPALS),
cuisonoobbligatoriamente iscritti tutti igiocatoridicalcioprofessionistidal
giugno1973.La coortedello studio comprendeva7325giocatori.Fraquesti
sonostatidiagnosticatidi5casidiSLA,conunetmediadiesordiodi43,4
anni. Il significativo aumentodel rischio di insorgenzadi SLA in giocatori
professionisti(periodidigiocopariosuperiorea6anni)osservatoeradi6,5,
superioresiaalleccessodirischiochesiosservaingeneraledurantelattivit
sportivaesiadastudicasocontrollopubblicatiinletteratura(Chioetal.,2005,
Chio et al., 2009). Ci potrebbe indirettamente indicare che il rischio di
svilupparelaSLAfraicalciatoriprofessionistinonesclusivamenteconnesso
allattivitfisicaintensaoalleffettoditraumiomicrotraumicomeipotizzato
(Piazzaetal.,2004),maapparespecificamentecorrelatoallattivitcalcistica
in s,anche con casi inambitoamatoriale (Wicks etal.,2007).Nello studio
recente di Taioli (Taioli, 2007a), effettuato in gruppi di giocatori
professionisti, sidimostra chementre restabassa lamortalitperpatologie
comecancroemalattiecardiovascolari,rispettoallapopolazionegenerale,alla
stessa etaumenta invecedi circa 18volte lamortalitperSLA e incidenti
dauto.
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Da tutti i lavori epidemiologici che sono statipubblicatinel corsodiquesti
anni,sipossonosollevarealcuneipotesichesembranolegateallaltorischiodi
SLAfraicalciatoriitaliani,quali:
luso di sostanze permigliorare le prestazioni atletiche oppure abuso di
farmaci leciti,adosi superiori eperperiodipiprolungati rispettoaquelli
normalmenteutilizzatidallapopolazionegenerale(BelliandVanacore,2005,
Vanacoreetal.,2006,Taioli,2007b);
il contatto con sostanzeutilizzate comediserbantio conciminei campidi
giocooallenamento;
le alterazioni metaboliche del muscolo o del motoneurone correlate a
specifichemetodichediallenamentoodigioco;
i traumiemicrotraumi ripetuti,specificidelgiocodelcalcio (Piazzaetal.,
2004).
Tenendo inoltre contodella giovane etdi esordio nellamaggiorpartedei
casi di SLA fra i calciatori, si pu inoltre ipotizzare che il fattore tossico
ambientale responsabile dellinsorgenza della SLA induca unanticipazione
delletdi insorgenzadellamalattia in soggettigeneticamentepredisposti
(Chioetal.,2005).
Sebbenegli studiepidemiologici sianomaggiormente concentratiallinterno
del contesto del calcio italiano, numerosi altri giocatori professionisti di
footballamericanohanno sviluppato laSLAnel corsodegliultimianni, e i
datirisultanomoltopreoccupanti (Abel,2007)conunaumentodirischiodi
40 volte rispetto allintera popolazione americana.Non ancora chiaro se
questaassociazionesiasolocasuale.
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1.4 Integrazionealimentaredurantelattivitsportiva
Lutilizzodisupplementinonanaboliciafininutrizionaliedimiglioramento
della performance atletica, comune tra gli sportivi. Le diverse sostanze
utilizzatenonsonosupportatedaveriepropristudiscientificisuanimaliche
abbiano testato il vero beneficio, ma soltanto da benefici teorici. Le dosi
raccomandateduranteesercizifisiciintensisonocosmesseindiscussione
poichgli studi a favorediun loro effettivobeneficio risultanopoco chiari
(SchwenkandCostley,2002).Daunostudiocondottonel2007nellambiente
sportivo, pi dell 82% dei giocatori intervistati riportava di fare un uso
costantedisupplementi,il93%usavanofarmaciantifiammatorinonsteroidei
e il28%vitamine (Taioli,2007a).Tuttavia, rimangono fortiperplessit sulla
reale efficacia di questi prodotti anche in considerazione del fatto che i
favorevoliallintegrazioneindicanoquantitativietempidisomministrazione
assaidiversi(SchwenkandCostley,2002,ASSOCIATION,2009).
1.5 Amminoacidiacatenaramificata
Gliamminoacidiacatenaramificata(BranchedChainAminoAcid,BCAA)sono
considerati supplementi nutrizionali e lusodi questi integratori si molto
diffuso soprattutto nellultimo decennio, favorito da una vasta produzione
scientificache avrebbedimostratounaspecificaefficaciadiquestesostanze
nelmigliorarelaprestazionesportiva.
Valina,Leucina e Isoleucina sono treamminoacidi essenziali,dettia catena
ramificata in quanto caratterizzati da una catena di atomi di carbonio che
deviadallacatenaprincipale(Fig.7).Questivengonoutilizzaticomefontedi
energia in modo preferenziale dal muscolo durante lesercizio fisico e
rappresentano il 30% dellamassamuscolare. Inoltre sarebbero in grado di
promuovere lasintesiproteica (effettoanabolizzante)edi favorire iprocessi
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direcuperodopouncaricodilavoromuscolare.Unacorrettaassunzionedei
BCAA necessaria per una normale crescita e sviluppo e quindi sono
importantissiminellalimentazione.
Fig.7Strutturadeitreamminoacidiramificati:Isoleucina,LeucinaeValina,conevidenziatiigruppialifaticichedeterminanolaramificazione.
Gli amminoacidi ramificati sono ampiamente presenti nelle proteine dei
comuni alimenti che, pertanto, se consumati nelle giuste quantit, sono in
gradodi coprire completamente il fabbisognonutrizionalegiornalierodegli
atleti. Nella maggioranza dei casi, luso degli integratori contenenti
amminoacidi (inparticolare ramificati e arginina,ornitina e lisina)daparte
degli atleti e degli sportivi in genere motivato dalla speranza e/o
convinzionedipoterottenereunaumentodiproduzioneerilascio incircolo
dellormonedellacrescita(GrowthHormon,GH,(DePaloetal.,2001).Intal
modo verrebbero potenziati i processimetabolici e in particolare anabolici,
quali aumento delle masse muscolari e della forza, mediati da questo
fondamentale ormone ipofisario. Tuttavia, lanalisi critica e statisticamente
correttadeidatidisponibili in letteraturasembrerebbesmentireuneffettodi
questo tipo di integratori, quando assunti da atleti sani, opportunamente
allenatieconabitudinialimentaricorrette(GiampietroandGambarara,2005).
Infattilallenamentoeilgielevatoapportodiamminoacidiconglialimenti,
tipico degli sportivi in genere, sarebbero sufficienti da soli ad ottenere la
massima stimolazione possibile delGH, sempre entro i limiti fisiologici, e
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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quindilusodiintegratoriproteicieamminoacidicinonprodurrebbeulteriori
aumentidellaconcentrazioneplasmaticadellormone.
Negli sport ad alto impatto quali lamaratona, il ciclismodi resistenza e il
tennis stato dimostrato un miglioramento delle performance mediante
lutilizzodiunintegrazionealimentareabasedileucina,valinaeisoleucina,a
dosidi39,19e19rispettivamente,peruntotaledi77mg/kg/die(MacLeanet
al.,1994,Ohtanietal.,2006).Glistudipirecentiriportanoche lutilizzodi
questa integrazione, ad esempio nel gioco del calcio, pu portare ad un
miglioramento delle performance cognitive nella fase finale delle partite,
senzapermigliorarelaperformancefisica(Meeusenetal.,2006).
1.6 MetabolismoefabbisognoumanodiBCAA
LaregolazionedeglienzimichiavedelcatabolismodeiBCAAessenzialeper
limitare lossidazione irreversibiledeiBCAA quando lassunzionedi questi
amminoacidi insufficiente, e per eliminarli efficientemente quando sono
assuntiineccessorispettoallanormalerichiesta.
IlcatabolismodeiBCAAcoinvolgeinizialmenteduevieenzimatichecomuni,
una transaminazione e una successiva decarbossilazione ossidativa. Di
conseguenza, le quantit relative dei singoli BCAA si influenzano
vicendevolmente.Gli enzimi catabolici dei BCAA, a differenza di quelli di
tuttiglialtriamminoacidiessenziali che sonopresenti solonel fegato, sono
distribuiti ubiquitariamente in tutto il corpo e tutte le trasformazioni
biochimicheavvengononeimitocondri,conlunicaeccezionedelSNCdovele
reazioniavvengononelcitosol(Hutsonetal.,1998,Shimomuraetal.,2004).
IBCAAvengono assorbitinellintestino egiungono al fegatodadove,non
subendo trasformazioni chimiche, vengono immessi nella circolazione
sanguignaper esserepoimetabolizzati in largaparte a livellodelmuscolo
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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scheletrico (Gelfand et al., 1986). Il primo passaggio del metabolismo dei
BCAAneltessutoperiferico ladeaminazionemediante lenzimabranched
chainaminotrasferasi(BCAT)perprodurrechetoacidiacatenaramificata(BCKA). Esistono due diverse isoforme per questo enzima: la prima,
distribuita ubiquitariamente in tutto il corpo, presente nei mitocondri
(BCATm), la seconda, sintetizzata principalmente nel cervello, attiva nel
citosol(BCATc;Fig.8)(Bixeletal.,1997).
Fig.8LocalizzazionedeglienzimidelcatabolismodeiBCAAnelcorpo.Laproduzionedigruppiamminicineidifferentitessutidiversaedipendedallespressionedideterminatienzimi.(DaHutson
etal,2005)
IBCKAvengono incorporatinelleproteine,oppurepossonoessereutilizzati
come substrato energetico non solo nelmuscolo scheletrico,ma anche nel
cervello, nei reni, nel fegato e nel cuore (Abumrad et al., 1982). In questi
organi i BCAA subiscono una decarbossilazione ossidativa, limitante e
irreversibile catalizzata dalla deidrogenasi dei BCKA (BCKD) con la
conseguente generazionedei substratiper il ciclodellacido citrico (Fig. 9;
ciclo di Krebs). Sulla base di studi condotti su modelli animali, stato
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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osservato chenellinsufficienza epatica cronica il catabolismo acceleratodei
BCAA nel cervello pu ridurre la neurotossicit dellammoniaca
promuovendo lasintesidiglutamminaapartiredalglutammato (Watanabe
et al., 1986, Kasinski et al., 2004). Inoltre studi metabolici (Hutson, 2006)
riportanochenelcaso incui laproteinachinasiBCKcheregola lattivazione
del complesso BCKD mutata, la disponibilit dei BCAA per la sintesi
proteicasiannulla.Ilfenotipomurinochenederivasoggettoadisfunzione
muscolareedattacchiepilettici.Questemanifestazionisiosservanoanchenei
pazientiaffettidaMSUD (MapleSyrupUrineDisease), incuialcontrariosi
bloccalossidazionedeiBCAAconconseguenteaccumulotossicodiBCAAe
BCKA(Zhangetal.,1989).
Fig.9ProdottidelcatabolismodeiBCAA.IlprimostepunatransaminazionedeiBCAAedcatalizzatodagliisozimidellaBranchedchainaminotrasferasi.(DaHutsonetal.2005)
Nel 1985 lorganizzazionemondialedella sanit (WorldHealthOrganization,
WHO) in collaborazione con lOrganizzazione per lAlimentazione e
lAgricoltura(FoodandAgricultureOrganization,FAO)elOrganizzazionedelle
NazioniUniti (UnitedNationsOrganization,ONU) stabilirono il fabbisogno
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giornaliero degli amminoacidi essenziali nelle diverse fasce det. Nel
neonato, ad esempio, la quantitdiLeucina (Leu), Isoleucina (Ile) eValina
(Val) necessaria per un corretto sviluppo rispettivamente 161, 70 e 93
mg/Kg/die. Questa quantit va via via diminuendo fino ad arrivare
nelladultoa14,10e10mg/Kg/dierispettivamente(FAO/WHO,1985).Questa
diminuzionedel fabbisognodeiBCAA in funzionedellet si spiega con la
necessit del neonato di aumentare la propria massa muscolare e quindi
laccrescimento durante tutto lo sviluppo. In uno studio successivo
(FAO/WHO, 1991, FAO/WHO, 2007), queste quantit sono state riviste
soprattuttonelladultomodificandolein19,13e13mg/Kg/diedeitreBCAA
(LeuIleVal).Questiamminoacidi,cometuttiquelliessenziali,sonointrodotti
inquantitsufficienteconunadietaequilibrata(Kreideretal.,1993).
1.7 Gli amminoacidi a catena ramificata nel SNC ed effetto sui
meccanismidifaticacentrale
I BCAA svolgono un ruolo importante nel cervello sia nel regolare il
metabolismodellazoto, sianella sintesidellaglutammina. IBCAApassano
rapidamente labarrieraematoencefalicascambiandosicon laglutamminae
sono i maggiori donatori di azoto per la formazione di glutammina e
glutammato nel cervello (Yudkoff et al., 1994, Yudkoff, 1997,Daikhin and
Yudkoff,2000,Hutsonetal.,2001,Yudkoffetal.,2005).Gliastrocitiossidanoi
BCAAperformareiBCKA,inquestomodofornisconoazotoamminicoperil
pooldiglutammatodellecellulegliali (Bixeletal.,1997,Bixeletal.,2001). I
BCKAtraslocanonelcitosoldeineuronidovevengonoriconvertitiinBCAAe
corpi chetonici (Bixel and Hamprecht, 1995). Il neurotrasmettitore
glutammato rimosso dal liquido extracellulare dagli astrociti e
metabolizzato a glutammina mediante lenzina glutammina sintetasi,
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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responsabile della regolazione della concentrazione di questo
neurotrasmettitore. La glutammina quindi rilasciata dagli astrociti e
riassorbitadaineuronineiqualivieneidrolizzataaglutammatoeammoniaca
dallenzima glutaminasi. Lammoniaca cos prodotta viene utilizzata per la
sintesidiBCAAapartiredaiBCKA.IBCAAsonosuccessivamenterilasciati
nello spazio extracellulare e riassorbiti dagli astrociti, completando il ciclo
BCAAGlutammato (BCAA shuttle; Fig. 10). Questo ciclo permette la
regolazionedellaconcentrazionedelglutammato(Platelletal.,2000).stato
osservato che eccessidiBCAAodei loroderivati,quali lammoniaca, sono
tossiciper lo sviluppodel sistemanervoso centrale (Bachmann et al., 2004,
Kasinski et al., 2004). Infatti, questi autori hannodimostrato che in coltura
cellulareunesposizioneallammoniacaprimadelcompletodifferenziamento
induce un alterato sviluppo assonale colinergico accoppiato ad un
decrementodellacreatinaedellafosfocreatina,mentreunesposizionediuna
colturagidifferenziatanonportaaglistessirisultati.
Fig.10RelazionecheintercorretraiBCAA,BCKAelaGlutamminatraivariorgani.(DaHutsonetal.,2001)
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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IBCAA funzionanoda importantesubstratoenergeticonelcervello (Hutson
et al., 2005) e sono rapidamente metabolizzati dalle cellule neuronali in
colturaanchequandoaltrisubstratienergetici,comeadesempio ilglucosio,
sonopresentiinabbondanza.
LintegrazionedeiBCAAstataconsiderata importantesoprattuttoperdue
aspetti:
riduzionedellafaticacentralecausatadaunallenamentointenso; riduzione della degradazione proteica del muscolo in seguito
allallenamento.
Un aspetto sicuramente interessante il ruolo che diversi ricercatori
attribuiscono ai BCAA nel determinare una riduzione della sensazione di
fatica durante un esercizio fisico prolungato (Blomstrand and Saltin, 2001).
Fisiologicamente lafaticapuesseredefinitacome lincapacitdimantenere
uno sforzoprolungato epu essere indicata comeperiferica e centrale.Per
faticaperifericasiintendeladiminuzionedellacapacitdisvolgereunlavoro
muscolare.Questotipodifaticacoinvolgesialatrasmissioneneuromuscolare,
sia linterazione actinamiosina (Green et al., 1995,Davis et al., 1998). Sono
stati identificati diversi fattori responsabili della fatica periferica, come la
diminuzione nelmuscolodel glicogeno edella fosfocreatina, laccumulodi
protoni,ladifficoltditrasmissioneneuromuscolareelaumentodellattatoa
livellomuscolare.
Lecausemolecolaridellafaticacentralenonsonoancorastatechiaritemauna
delle ipotesi sarebbe un incremento nel sangue della concentrazione di
triptofano(TRP)equindidelneurotrasmettitore5idrossitriptamina(5HT),o
serotonina,eche,neineuronicoinvoltinelcontrollodellattivitmotorianel
cervello,puessereresponsabiledellafaticaditipocentrale.Siritienechela
variazionediconcentrazionedellaserotoninacerebralesiadipendentedaun
aumento del triptofano libero plasmatico e sia responsabile dello stato di
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Dottorato di ricerca in Neuroscienze
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fatica centrale che caratterizzato da sonnolenza, malumore, senso di
stanchezzaedifficoltaproseguire limpegno (NewsholmeandBlomstrand,
2006).Poichiltriptofanoilprecursoredellasintesidi5HT,unincremento
della sua quota libera (fTRP), ovvero non legata allalbumina nel sangue,
porta adun suomaggiore trasporto attraverso labarriera ematoencefalica,
mediata dal sistema di trasporto L1 specifico per gli amminoacidi neutri.
Infatti la concentrazionedi serotoninanel cervelloaumentaquandoviun
aumentodelrapportotralaconcentrazionedifTRPelaconcentrazionetotale
dei BCAA nel plasma (Mizuno et al., 2006). stato infatti osservato che
lassunzione di BCAA potrebbe far diminuire il rapporto fTRP/BCAA nel
plasmariducendocoslasintesidi5HT(NewsholmeandBlomstrand,1996).
Lincremento della serotonina si verifica principalmente durante un
allenamentoprolungatoperdueragioni:
i BCAA presenti nel sangue vengono ossidati per produrre energiadurantelacontrazionedelmuscoloscheletrico;
nelplasma la concentrazionedi acidigrassi aumenta,parallelamenteallincrementodelfTRP,poichcompetonoentrambiperillegamecon
lalbumina(Davisetal.,2000).
Poich stato osservato che laumento degli acidi grassi circolanti, che si
verifica durante un esercizio fisico submassimale, pu essere parzialmente
bloccatodaunalimentazionericcadicarboidrati(CHO),sonostatestudiatele
conseguenze dellintegrazionealimentareconBCAAassociatiaicarboidrati
sullafaticacentrale(Davisetal.,1992).
stata posta lattenzione sullintegrazione dei BCAA come mezzo per
prevenire la fatica di tipo centrale durante unattivit prolungate quali ad
esempio loscidi fondo, lemaratoneo lepartitedicalcio (Blomstrandetal.,
1991,Newsholmeetal.,1991).Inunaseriedistudielavorisuccessiviemerge
che:
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somministrazionidiBCAAda7,5a21gprimaedurante lesercizio fisico,
inducono in alcuni soggetti unmiglioramento nelle prestazioni sia fisiche
(Newsholmeetal.,1991)chementali(Blomstrandetal.,1991).
non si evidenziano differenze significative nelle prestazioni fisiche n un
miglioramentodella faticadiun gruppodi volontaridurante attivit fisica
intensaacui,70minutiprimadellesercizio,sonostatisomministrati20gdi
BCAA, rispetto ad un gruppo a cui era stata somministrata una soluzione
zuccherata(Varnieretal.,1994).
inuno studio su ratti sidimostra che la somministrazionedi altedosidi
BCAA causava linsorgenza della fatica precocemente rispetto alla
somministrazionedisolaacquaeglucosio(Vergeretal.,1994).
altedosidiBCAApossonoessere ingradodiridurre lafaticacentrale,ma
determinano un aumento delle concentrazioni di ammoniaca, uno dei
catabolitideiBCAA, che si saessere tossicaper il cervello e imuscoli (van
Halletal.,1995a,vanHalletal.,1995b,Kasinskietal.,2004).
1.8 PossibileimplicazionedeiBCAAnellaSLA
Alcuniricercatorihannoipotizzatochelaneurotossicitcausatadauneccesso
di glutammato extracellulare potesse contribuire alla degenerazione dei
motoneuronibulbarie spinali (Plaitakisetal.,1988). Infatti stato riportato
cheunaparzialeanomaliadellenzimaglutammatodeidrogenasi(GDH)pu
causare un incremento dei livelli del glutammato nel plasma dei pazienti
affettidaSLA(PlaitakisandCaroscio,1987,Plaitakis,1990).Ilglutammato
convertito in chetoglutarato e viceversa dallenzima GDH. Lattivit diquestoenzimastatadimostrataesserenormale(PlaitakisandCaroscio,1987)
oridotta(Hugonetal.,1989)neileucocitideipazientiSLA,mentrerisultava
essereelevatanellecornadorsalienelmidollospinale(Malessaetal.,1991).
Poich laGDHpuessereattivataallostericamentedaiBCAA(Yieldingand
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Tomkins, 1961, Erecinska and Nelson, 1990), stato ipotizzato che la
progressionedellamalattiapotesseesseremodificatadallasomministrazione
diquestiamminoacidi.
Successivamente, in uno studio effettuato su 22 pazienti SLA, 11 dei quali
trattatiperunannoconBCAA(12gdiLLeucina,8gdiLIsoleucina,6,4gdi
LValina)ed11conplacebo,statodimostratoche,nelgruppotrattatoconi
BCAAsinotavaunsignificativomiglioramento in terminidimantenimento
della forzamuscolare edella capacitdi camminare (Plaitakis et al., 1988),
mentre nel gruppo trattato con ilplacebo si notava unadiminuzionedello
stato funzionale, in accordo con la storia naturale dellamalattia.Altri due
studiinvece(Testaetal.,1989,BeghiandMennini,2004)hannoriportatochei
pazienti trattati conBCAAnon riscontravanonessunvantaggio terapeutico
rispettoalgruppodicontrollo.IncontrastoconirisultatidiPlaitakisdel1988,
ungruppoitalianodistudiodellaSLA,nel1989,hainiziatoindiversicentri
specializzatiuna ricercapervalutare lefficaciae la sicurezzadeiBCAAnei
pazientitrattati.
La sperimentazione stata effettuata in nove centri SLA tra ospedali e
universit,peruntotaledi126pazienti.61pazientisonostatitrattaticonun
prodottovendutosulmercatoitaliano,contenente1,2gdiLLeucina,0,6gdi
LIsoleucinae0,6gdiLValinae7,6gdicarboidrati;65pazienti sono stati
trattati conunplacebo, contenente solo i carboidrati.Aipazienti sono stati
somministrati 2 pasticche, contenenti i BCAA o il placebo a secondo del
gruppo,daassumereperviaoraleprimadeipasti5voltealgiornopertuttoil
periodo di studio. Nel 1991 un eccesso di mortalit tra i soggetti a cui
venivano somministrati i BCAA, in assenza quindi di risultati positivi in
favoredeltrattamentoconiBCAA,haportatoilcomitatoperilmonitoraggio
deidatiarichiederelinterruzionediquestostudio(1993).Eranoinfattimorti
24pazientitrattaticon iBCAAe13trattaticon ilplacebo.Lapercentualedi
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sopravvivenzaera,peripazientitrattaticoniBCAA,del92%a3mesi,81%a
seimesi,74%anovemesie59%adodicimesi;mentreper ipazientitrattati
con ilplacebo lacorrispondentepercentualedisopravvivenzaeradel100%,
90%,85%e74%.IlrischiorelativodimorteneipazientitrattaticoniBCAA
risultatoessere2,3voltesuperioreaipazientitrattaticonilplacebo(1993).
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2 IlcomplessomTOR(mammaliantargetofRapamycin)
MoltistudisonostatieseguitiperesaminareilruolodeiBCAAnellinduzione
di modificazioni molecolari che aumentano la sintesi proteica muscolare.
Alcuni hanno riportato che, combinando lintegrazione di BCAA con un
allenamento intenso, siamplificherebberoalcuni segnaligenetici,mentreda
altristudiemergeche,assumendoquestiamminoacidiprimaedopolattivit
fisica, si ridurrebbe la degradazione proteicamuscolare (Blomstrand et al.,
2006).UnsupplementodiBCAAinfatticreaunalterazionedellattivitdella
trasduzione del segnale delle vie che regolano la trascrizione dei geni
coinvoltinellacrescitamuscolare(Blomstrandetal.,2006).Alivellocellulare
coinvoltalaviadellmTOR(mammaliantargetofRapamycin)regolataanche
dallapresenzadinutrienticomeilglucosio,nonchdaormonicomelinsulina
(Fig.11)(Proud,2006,Krebsetal.,2007,Proud,2007).
mTOR,elacascatadireazionichedaessoderivano,vieneattivatoquandola
cellula ha a disposizione alti livelli di nutrienti (Proud, 2002). Con queste
premesse i ricercatori hanno ipotizzato che il ruolo di sensore energetico
cellularesvoltodamTORpotesseessereapplicatoinmodopigeneralealla
regolazione del bilancio energetico del corpo intero. Per verificare
questipotesistatostudiato ilsegnaledimTORe lasuacascatadireazioni
nellipotalamo, unimportante area cerebrale coinvolta nella regolazione
dellappetitoedelpesocorporeo(Cotaetal.,2006,Morietal.,2009).
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Fig.11DestinodeiBCAAnellecelluleestimolazionedellasintesiproteicaedellaccrescimentomuscolare.
LaproteinamTOR(mammaliantargetofRapamycin)(Kubicaetal.,2005)una
molecoladi290KDa,coschiamataperch inibitadalmacrolideRapamicina,
antibioticoprodottodalbatterioStreptomyceshygroscopicus.LaRapamicinaei
suoi derivati presentano un unico meccanismo dazione che comporta
linterazioneconunapiccolamolecolaproteicadalpesodi12KDa,notacome
FKBP12(FK506bindingprotein)aformareuncomplessochesivaalegaread
mTOR, inibendola (Bjornsti andHoughton, 2004). I due complessi in cui
presentelaproteinamTORsono:
il complessomTORC1 responsabile della regolazione della sintesi
proteicaesicomponedimTOR,raptor (regulatoryassociatedprotein
ofmTOR)edGL(Haraetal.,2002).Raptorunagrossamolecoladi
150 KDa, che stabilisce interazioni multiple con mTOR e con suoi
substrati(Kimetal.,2002);GL,invece,unaproteinadi36KDa,che
si lega al dominio chinasico di mTOR, regolandone positivamente
lattivitcatalitica(Wullschlegeretal.,2005).
il complessomTORC2 costituitodamTOR,GL edaunaproteina
dal peso molecolare di circa 200 KDa proteina, nota come rictor
BCAA
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(rapamycininsensitive companion ofmTOR).La funzione fisiologica
dimTORC2nonancoradeltuttochiara,tuttavialipotesiadoggipi
accreditata che tale complessomoduli lorganizzazione dellactina
citoscheletrica(Jacintoetal.,2004).
mTORC1 una serintreonin chinasi costituitadaundominio catalitico,un
sitodilegameperilcomplessoFKBP12Rapamicinaedunprobabiledominio
adazioneautoinibitoria(negativeregulatorydomain)(Sekulicetal.,2000).
Lattivit della proteinamTOR e dei suoi target modulata da numerosi
stimoli, quali fattori di crescita (IGF1), nutrienti (amminoacidi), stress
ambientali (ipossia), ormoni (insulina, T3, GH, testosterone) e secondi
messaggeri(IP3ecalcio)(Inokietal.,2005).
Studi condotti su cellule di mammifero suggeriscono che, il complesso
mTORC1 possa agire da sensore dei livelli intracellulari di nutrienti. In
assenzadiamminoacidieinparticolarelaleucina(Kimetal.,2002,Kimetal.,
2003), tale complessoandrebbe incontroadunavariazione conformazionale
cheprecluderebbelachinasimTORdalfosforilareisuoisubstrati(Kimetal.,
2002,Kimetal.,2003,Wangetal.,2006,Wangetal.,2008).Alcontrario, in
presenza di amminoacidi, lo stesso complesso proteico subirebbe una
modificazione tridimensionale tale da promuovere unefficiente interazione
traraptoredisubstratidimTOR,favorendonelafosforilazioneadoperadella
chinasi(Kimetal.,2002,Kimetal.,2003)(Fig.12).
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Fig.12SchematizzazionedituttiisegnaliesternichegiungonoallacellulaepermettonolattivazionedelcomplessomTORC1edmTORC2eregolazionedidiversimeccanismi.
Dalpuntodivista strutturale, laRapamicina unmacrolidederivatodalla
fermentazionedellactinomiceteStreptomyceshygroscopicus,originariamente
isolatodalterrenonellisoladiRapaNuinel1975(Fig.13).
Fig.13strutturadellaRapamicina
Al farmaco, chiamato appunto Rapamicina dal nome dellisola dove fu
scoperto,statoinseguitoaggiuntoilnomegenericodiSirolimus,mentre
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Rapamuneilnomeregistratodallindustriafarmaceuticacheloproducee
lodistribuisce(Wyeth/PfizerInc).
La Rapamicina venne dapprima studiata come molecola antifungina ed
antitumorale e solo in seguito linteresse per il farmaco si spost sulle sue
potenti propriet immunosoppressive. La Rapamicina infatti, una volta
legatasi al recettore citoplasmatico FKBP12, interagisce con il complesso
proteicomTORbloccandonelesuefunzioni.
Siritienechemoltemalattieneurodegenerativesianogeneratedaalterazioni
dellaconformazionedialcuneproteine,chevannoincontroallaformazionedi
aggregati (Christie et al., 2002). Queste patologie, per le quali stato
appositamenteconiatoilterminediproteinopatie,sonocaratterizzatedalla
presenza, allinterno di aree specifiche del sistema nervoso centrale, di
aggregati proteici che possono variamente localizzarsi in sede intra o
extracellularenellediversemalattie (Christie et al., 2002).Tali cambiamenti
conformazionali, misfolding,possono essere la conseguenzadimutazioni
geniche che alterano la struttura primaria della proteina codificata, di
alterazioni dei sistemi che controllano il corretto processo di ripiegamento
dellacatenapolipeptidicadurantelasintesiproteica,oppurediinsultitossici
chepossonocolpirelacelluladuranteilpropriociclovitaleedanneggiarela
proteinainfaseposttraduzionale.
Studigeneticie limpiegoestensivodianimali transgenicihannodimostrato
che le alterazioni conformazionali possono determinare la totale o parziale
perditadi funzionedellaproteinaalterataoppureconferisconoallaproteina
propriet tossiche per guadagno di funzione, incrementando lattivit
fisiologica o causando la comparsa di nuove propriet (Rubinsztein et al.,
2007).
Dallattivit dei sistemi di degradazione proteica, in grado di regolare i
normalilivellieilturnoverfisiologicodelleproteine,dipendelacapacitdella
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cellula di rimuovere le proteine danneggiate e potenzialmente tossiche.
Lautofagia regola il turnover fisiologico di svariati costituenti cellulari,
inclusi organuli e proteine, solubili o aggregate, mediante un processo
multifasico che coinvolge lattivit degradativa lisosomiale (Klionsky and
Ohsumi, 1999). Sulla base delle diverse modalit con cui i componenti
intracellularivengonoindirizzatiailisosomi,sidistinguonotretipiprincipali
di autofagia, che prendono il nome di macroautofagia, microautofagia e
autofagia mediata da chaperonine (CMA). I diversi tipi di autofagia
differiscono per tipologia di substrato e meccanismo di regolazione
attivazione.
Tra queste la Rapamicina sembra essere un forte induttore della macro
autofagia,unprocessodi autodegradazione che in condizioni fisiologiche
costitutivamenteattivoecausailturnoverbasaledellecomponenticellularie
regola il bilancio di nutrienti negli eucarioti (Fig. 14) (Schmelzle andHall,
2000,YorimitsuandKlionsky,2005).
stato studiato approfonditamente il ruolodegli aggregati citotossici nelle
malattie neurodegenerative, come nellAlzheimer (AD), il Parkinson (PD),
lHuntington (HD) e varie atassie spinocerebellari (SCA), in cuimutationi
nella sequenza primaria amminoacidica causano errori nellassemblaggio
proteicoconlaformazionediaggregati(Bergeretal.,2006).Siritienecheuna
mancanza di autofagia causi la neurodegenerazione (Takada et al., 2005,
Bergeretal.,2006,Haraetal.,2006)echequestomeccanismogiochiunruolo
importantenellaneuroprotezione (Webbetal.,2003,Ravikumaretal.,2004,
Berger et al., 2006,Hornberger andChien, 2006,Kabuta et al., 2006). Inun
articolopubblicatosullarivistaNature,Sarkarecollaboratoriaffermanoche
somministrando dellemolecole denominate smallmolecule enhancers, si
stimola il processo di autofagia attraverso il quale le cellule eliminano le
proteinealterateemalripiegatecomelaproteinahuntingtinamutante(Sarkar
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etal.,2007). I ricercatori ritengono che stimolando lautofagianellepersone
chesoffronodellacoreadiHuntington,oinaltremalattieneurodegenerative,
anche senon si rallenta o arresta laproduzionediproteinahuntingtina, le
celluleeliminanomeglioirestitossiciineccesso,ritardandolapparizionedei
sintomi (Rubinsztein et al., 2007). stato anche dimostrato che sia la
RapamicinacheilsuoanalogoCCI779,sianoprotettivinellaDrosophilaein
modellimurinidiHD(Ravikumaretal.,2004).
Fig.14ViediattivazioneintracellularidellautofagiaadoperadellaRapamicinaedelLitio
La SLA risulta essere una delle patologie in cui unalterata conformazione
proteica (SOD1) induceunaccumulodiaggregatineurotossici eperquesto
lautofagiasembraavereunruoloimportante.
In particolare, diversi lavori hanno riportato che lautofagia riduce i livelli
(Kabuta et al., 2006) di tossicit nella SLAmediata da accumulo di SOD1
mutata inuna lineadineuroblastoma.Gliaggregati tossicidiSOD1mutata,
trovatiinmodellianimalidifSLAeinpazientiaffetti,potrebbesuggerireun
meccanismoalteratodiautofagiaequindi il coinvolgimentodiunpathway
mTORdipendente modificato (Bruijn et al., 1997, Watanabe et al., 2001,
Kobayashietal.,2006). InoltreKabutadimostrache lautofagiaabbassasia i
livellidiproteinadellaSOD1mutata,chelatossicitindottadaquestultima
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(Kabuta et al., 2006). stato inoltre riportato che la funzionalit dimTOR
attivataattraverso lafosforilazionedellaSerina2448siaridottaneitopimutati
G93Aadunostadioprecoceprimadellacomparsadeisintomi(Morimotoet
al.,2007).possibilequindi che lautofagia regolatadalla rapamicina sia in
questomodellodi SLAunodeimeccanismi coinvolti.Tuttavianon ci sono
lavorisuimeccanismidiautofagiainvivonellaSLA.
Poich i BCAA regolano il complessomTOR, e poich una loro eccessiva
assunzionerisulterebbe implicatanellosviluppodellaSLA,sarannostudiate
leproprietdiscaricadipotenzialidazioneelafunzionalitdeicanaliionici
voltaggiodipendenti, parametri che risultano essere alterati nel corso della
patologia.
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3 IcanaliioniciVoltaggiodipendentielatrasmissione
sinaptica
Lagenesideimessagginervosidipendedarapidevariazionidelladifferenza
del potenziale elettrico esistente sullemembrane neuronali.Questa rapida
variazionedelpotenzialedimembranadenominatapotenzialedazione.Nel
corso di un potenziale dazione, il potenziale di membrana pu andare
incontro a variazioni dellordine di 500millivolt al secondo. Variazioni di
questordinedigrandezza sono resepossibilidallapresenzadi canali ionici
che costituiscono una classe di proteine integrali che attraversano la
membrana da parte a parte. Questi canali posseggono tre propriet
importanti: (1) lasciano passare gli ioni; (2) riconoscono e selezionano le
diverse specie ioniche; (3) si aprono e si chiudono in risposta a segnali
specificichepossonoesseredinaturaelettrica,meccanicaochimica (Kandel
etal.,1991).Ledimensionidiquesticanali,dedottedalladimensionedellepi
grosseparticellechepossonoattraversarli,corrispondonoadundiametronon
maggioredi8(1=1010m).Essiquindinonpossonoesserepercorsidalla
maggior parte delle molecole non dissociate che si trovano nei liquidi
organici,mentre lascianopassare, inmodopiomeno selettivoneidiversi
casi,molti ioni inorganici grazie alle loro dimensioni relativamente piccole
(Hille, 1986). I canali ionici possiedono la peculiare caratteristica di poter
passaredaunostatoapertooattivato,checonsente ilpassaggiodegli ioni,ad
unostatochiusoedeventualmente,adunostatoinattivato,neiqualilaperviet
dei canali interrotta e gli ioni nonpassano.La transizione tra lo stato di
apertura e quello di chiusura pu essere determinata da variazioni del
potenziale dimembrana. In questo caso si parla di canali ionici voltaggio
dipendenti. Se invece lamodificazione indotta da particolari sostanze in
gradodicombinarsicongruppichimicidelleproteinecostituenti ilcanale, i
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canalisonodettichemiodipendenti.Icanaliionicivoltaggiodipendentisono
costituitidadueparti:undominio che,appunto, sensibileavariazionidi
voltaggio e un dominio che forma il poro attraverso cui passano gli ioni
(Pongs,1999,Sansometal.,2000).
3.1 Genesiionicadeipotenzialidazione
Ineuronisono,perdefinizione,dellecelluleeccitabilicherispondonoaduno
stimolo adeguato variando il loro potenziale di membrana e, superato il
valoresoglia,generanounpotenzialedazione.
Lecellulenervosesono,inoltre,ingradodigenerarepotenzialidazioneinun
ampiointervallodifrequenze,epossonorispondereapiccolicambiamentidi
correntivariandodimolto la lorofrequenzadiscarica,odifiring(Tatenoet
al., 2004). Le propriet di scarica delle cellule nervose dipendono
allespressionedimoltitipidicanaliionicivoltaggiodipendenti.Siritieneche
le conduttanze voltaggio dipendenti delle cellule neuronali del cervello di
mammiferoincludanoalmeno2o3componentidellecorrentidisodio,4o5
diversecomponentidellecorrentidicalcio,4o5componentidellecorrentidi
potassio attivate dalla variazione del voltaggio e almeno 2 o 3 di quelle
attivatedalcalcio,elecorrentiattivatedalliperpolarizzazione.Leproprietdi
attivazione ed inattivazione di ciascun canale, e la densit alla quale sono
espressi sulla membrana di ciascun neurone, determinano la forma e la
ripetitivitdelfiring(Bean,2007).
3.2 Icanaliionicidelsodiovoltaggiodipendenti
Ilprincipalecontributoperlagenesidelpotenzialedazionedatodaicanali
ionici voltaggiodipendentidel sodio (Fig. 15).Uno stimolodepolarizzante,
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infattineprovoca larapidaattivazione (delladuratadicircauncentinaiodi
microsecondi) e la comparsa di una corrente entrante di sodio. Questa
correnteinduceunulterioredepolarizzazionechefaaprireunnumeroancora
maggiore di canaliNa+, determinando un ulteriore aumento della corrente
entrante.Lacorrentedisodio,alpermaneredelladepolarizzazione,raggiunge
un valoremassimo o di picco, in seguito al quale si riduce rapidamente e
ritorna al suo livello di riposo in circa 2ms. Questo rapido decadimento
spontaneo di correntedimostra che, alpermaneredelladepolarizzazione, i
canali ionicidelNa+presentano il fenomenodell inattivazione,che li rende
nuovamente impervi allo ione dopo che sono stati per un breve periodo
attivati nello stato aperto. La loro successiva attivazione, per, richiede il
passaggio attraverso lo statodi chiusura (Taglietti andCasella, 1997). Se la
depolarizzazione generata dalla corrente del sodio raggiunge un valore
soglia, viene innescato il potenziale dazione. Infatti lattivazione di questi
canali del sodio responsabile della fase dascesa del potenziale dazione
(Catterall,2000a,YuandCatterall,2003,Catteralletal.,2005).
I canali del sodio (Fig. 15) sono formati da una subunit di 260 kDa
associataadunaopisubunitausiliare(1,2e/o3)di3336kDa.Ad
oggi sono state identificatenove subunit (Nav1.1Nav1.9).Le subunit
sono suddivise inquattrodomini (I IV) simili tra loroeognunodeiquali
contieneseielichetransmembrana(S1S6).Ognidominiohanellelica
S4 dei residui amminoacidici carichi positivamente che inducono
cambiamenti conformazionali nel canale a seconda del potenziale di
membrana.Ognidominioha,traleelicheS5eS6,unlooprientrantecheva
aformarelaparteextracellularedelporo(quellaresponsabiledellaselettivit
del canale)mentre lelicaS6va a formare laparte intracellularedelporo
(Catterall,2000a,YuandCatterall,2003,Catteralletal.,2005).
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Fig.15Strutturadeicanalidelsodiovoltaggiodipendenti.Asinistra)Rappresentazioneschematicadellesubunitdelcanaledeicanalidelsodiovoltaggiodipendenti.Lasubunit
illustratainsiemeallesubunit1e2.Inumeriromaniindicanoidominideisegmenti,5e6sonoisegmenticheformanoilporo(verde),4ilsensoredelvoltaggio(giallo),illoopintracellularetraidominiIIIeIVcontieneilmotivoIFMresponsabiledellinattivazione(celeste),Psonoisitidi
fosforilazione(icerchirossisonoibersaglidellaproteinchinasiAeirombirossisonoibersaglidellaproteinchinasiC)eunprobabilesitodiNglicosilazione(YuandCatterall,2003).IlTTxsilegaalprimoloop.Adestra)Classificazioneelocalizzazionedeigenicodificantilesubunitdelcanaledel
sodio.
Daunpuntodivistasperimentale,icanalidelsodiosonostatiiprimicanali
voltaggiodipendentiadesserescoperti.Daunpuntodivistaevolutivo,sono
invece gli ultimi ad essersi sviluppati. I canali del sodio infatti sembrano
derivaredai canalidel calcio che contengonoquattrodominiomologhi (Yu
andCatterall,2003).
I lavoridiHodgkin eHuxleyhannodefinito le tre caratteristicheprincipali
dei canali del sodio: lattivazione voltaggiodipendente, la conduttanza
selettiva e linattivazione spontanea. Come gi visto le prime due
caratteristicherisiedonorispettivamenteinunaseriediresiduiamminoacidici
carichi positivamente e nel loop rientrante tra le eliche S5 e S6.
Linattivazione un processo rapido che avviene nel giro di pochi
millisecondi ed determinato dal loop che connette i domini III e IV.
Allinterno di questo loop presente una sequenza di tre amminoacidi
denominataIFM(daIsoleucina,fenilalaninaemetionina)lacuifenilalaninasi
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legaal latocitoplasmaticodelporocausandone lachiusura(Catterall,2000a,
YuandCatterall,2003,Catteralletal.,2005).
Questicanalipossonoesserebloccatidalla tetradotossina (TTX),una tossina
letaleprodottadaipesci appartenenti alla famigliadeiTetraodontiae (il cui
esemplare piu noto il pesce palla).Questa tossina va a legarsi nel poro
selettivodel canale impedendo lingressodel sodio senza tuttaviaalterare i
meccanismidaper