3/1/2018

1

Bacili Gram negativi

• Patogeni– Salmonella– Shigella– Yersinia pestis– Tulpini patogene de E. coli: EAEC, ETEC, EHEC

• Patogeni oportunisti– E. coli

– Klebsiella– Proteus– Yersinia enterocolitica

Fam. Enterobacteriaceae

3/1/2018

2

Familia Enterobacteriaceae

Caractere generale:

• enterobacterium = bacterie intestinală

• habitat: tractul intestinal om/animale, piele, orofaringe, apa

3/1/2018

3

Caractere morfo-tinctoriale

• Bacili Gram-negativ

• Mobili/imobili

• Unii au capsulă: Klebsiella pneumoniae

• Nu formează endospori

Caractere de cultură

• Facultativ anaerobe • Tulbură uniform mediul de cultură lichid• Au necesităţi nutriţionale reduse → se dezvoltă şi pe

geloză nutritivă • Colonii tip S• Uneori colonii mucoase: Klebsiella pneumoniae • Medii selective, majoritatea au lactoză:

• Drigalski, Levin, Leifson, Istrate-Meitert, MacConkey

3/1/2018

4

Mediul Levine

• Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial

• Componente: geloză simplă + eozină + lactoză + albastru de metilen

• Utilizare: cultivarea enterobacteriilor (E.coli)

ADCL (Leifson)

• Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial

• Componente: geloză simplă + săruri biliare + lactoză + roşu neutru

• Utilizare: cultivarea shigelelor şi salmonelelor

3/1/2018

5

Caractere biochimice

~ Încadrarea în familie pe baza a trei teste biochimice:• Fermenteză glucoza cu producere de acid şi gaz • Testul oxidazei negativ• Reduc nitraţii la nitriţi

~ Pe baza testelor biochimice şi a caracterelor an genice → genuri → specii → variante serologice

3/1/2018

6

Degradeaza oxidativ si fermentativ glucoza

3/1/2018

7

OXIDAZA

• Scop: evidentiereacitocromoxidazei

• Substrat: benzi indicatoare(alfanaftol- clorhidrat de dimetilparafenilendiamina)

• Tehnica:- se umecteaza banda

indicatoare cu apa distilata- se descaraca o colonie

bacteriana cu ajutorul ansei pebanda indicatoare

• Interpretare: test+ coloratiealbastra

Reducerea nitratilor la nitriti

• Substrat: apa peptonata + KNO3

• Incubare: 24h la 37 C

• Substanta indicatoare: ac sulfanilic/acid acetic, alfanaftilamina/ac acetic

• Interpretare: test + viraj spre rosu al indicatorului (Enterobacteriaceae)

3/1/2018

8

• Patogeni– Salmonella– Shigella– Yersinia pestis– Tulpini patogene de E. coli: EAEC, ETEC, EHEC

Enterobacterii patogene

Genul Shigella

• patogen intestinal• determină dizenterie bacilară:

– febră, – colici abdominale, – scaune diareice muco-sanguinolente

3/1/2018

9

Clasificarea Shigella

In functie de antigenul somatic O:

• Shigella dysenteriae (grup A)

• Shigella flexneri (grup B)

• Shigella boydii (grup C)

• Shigella sonnei (grup D)

Clasificarea Shigella

In functie de alte antigene :

~ Shigella dysenteriae: 12 tipuri antigenice

~ Tipul 1 = S. dysenteriae Shiga: produce exotoxina Shiga

~ Tipul 2 =S. dysenteriae Schmitzii

~ Tipul 3-12= S. dysenteriae Large Sachs

~ Shigella flexneri: 6 tipuri antigenice

~ Shigella boydii: 23tipuri antigenice

~ Shigella sonnei: 1 tip antigenic

3/1/2018

10

ShigellaRecoltarea produselor patologice

• Materii fecale: in coprorecoltoare sterile, cu mediu de transport

• Cât mai aproape de debutul bolii• Înaintea instituirii tratamentului antimicrobian• Mediu de transport:

- Cary-Blair- Stuart

Shigella Examenul microscopic din produs patologic

- Nu oferă informaţii relevante- preparatul na v între lamă şi lamelă →

polimorfonucleare şi eritrocite

3/1/2018

11

CoproculturaIzolarea

- Medii de îmbogăţire: - Mediul cu selenit acid de sodiu

- Medii de cultură pentru enterobacterii - Medii selective şi de diferenţiere

* Drigalski* Levin* Leifson* Istrate-Meitert* MacConkey

Shigella Caractere morfo-tinctoriale

Bacili Gram-negativ

3/1/2018

12

Shigella Proprietăţi de cultură

• Colonii S • Lactozo-negative

Shigella Proprietati biochimice

Mediul TSI: degradeaza fermentativ glucoza (coloana de mediu vireaza spre galben), este un bacil lactozo-negativ (panta mediului ramane rosie)

3/1/2018

13

Utilizarea citratului simmons

• Substrat: mediu minimal cu citrat de sodiu solidificat in eprubeta in pozitia inclinata

• Tehnica: inocularea bacteriei de testat pe panta agarului. Incubare 18h la 37 C

• Interpretare: test +dezvoltarea coloniilor bacteriene si viraj verdealbastru al culorii mediului

mediul Simmons

Shigella Structura antigenică

- Aglutinări pe lamă cu seruri anti-O

3/1/2018

14

ShigellaTestarea sensibilitatii la antibiotice

Ampicilina,Imipenem, MeropenemCafalosporineChinoloneAminoglicozideTrimetoprim-Sulfamethoxazol

Genul Salmonellapeste 2200 serotipuri

Infecţii (salmoneloze):

~ Febra tifoidă – Salmonella typhi~ Febra paratifoidă – Salmonella paratyphi A, B~ Toxiinfecţii alimentare şi enterite

Salmonella typhymuriumSalmonella enteritidisSalmonella paratyphi BSalmonella panama

~ Stări septico-piemiceSalmonella paratyphi CSalmonella choleraesuis

3/1/2018

15

Genul Salmonella - clasificare

• In functie de antigenele O, H, ViSpeciile cele mai importante din punct de vedere medical:• Salmonella typhi – sursa doar omul• Salmonella paratyphi - sursa doar omul• Salmonella typhimurium• Salmonella enteritidis• Salmonella choleraesuis

Subclasificate in sute de serotipuri

Salmonella Caractere generale

~ bacili Gram-negativ

~ mobili (flageli peritrichi)

~ lactozo-negativi

~ identificarea antigenelor O, H, Vi → reacţii de aglutinare

3/1/2018

16

• Endotoxina

• Capsula = antigenul Vi• Aderenta (fimbriae)• Invazivitate (proteina)

Genul Salmonella – principalii factori de virulenta

Genul Salmonella Infectii produse

A. Salmoneloze majoreFebra tifoida si paratifoida- Salmonella typhi si S.paratyphi A, B

B. Salmoneloze minore (gastroenterite acute, toxiinfectii alimentare )

• Salmonella typhimurium, S.enteritidis

3/1/2018

17

Salmonella – posibile surse de contaminare

Recoltarea produselor patologice

1) Febre tifo-paratifoide:

– Saptamana 1 sange pentru realizarea de hemoculturi

– Saptamana 2 urina pentru realizarea uroculturii, materii fecale pentru realizarea de coproculturi

2) Gastroenterite– materii fecale pentru

realizarea de coproculturi

– lichid de vărsătură– alimente

3/1/2018

18

Salmonella Examenul microscopic din produs patologic

- Nu oferă informaţii relevante

Salmonella Coprocultura

Izolarea- Medii de îmbogăţire:

- Mediul cu selenit acid de sodiu

- Medii selective şi de diferenţiere- Drigalski- Levin- Leifson- Istrate-Meitert- MacConkey

3/1/2018

19

Salmonella Caractere morfo-tinctoriale

Bacili Gram-negativiMobili (preparat nativ)

Salmonella Proprietăţi de cultură

Mediul DrigalskiColonii lactozo-negativeColonii S

3/1/2018

20

Salmonella Proprietati de cultura

Geloza HektoenH2S

Salmonella Teste biochimice

H2S

3/1/2018

21

Creste pe mediul Simmons, cu citrat

Salmonella Teste biochimice

Salmonella Proprietăţi antigenice

- Schema de identificare antigenică Kauffmann-White

Ag “O” – caracteristică de GRUP Ag “H” - caracteristică de TIP (variaţie de fază)Ag Vi <=> Ag K – de suprafaţă Serotip = enumerarea completă a Ag O, Vi şi H1,2

3/1/2018

22

Salmonella Reacţia Widal

- r. aglutinare în tuburi

- Febre tifo-paratifoide - Creşterea titrului de anticorpilor aglutinanţi

anti-O şi anti-H

Salmonella Antibiograma

• Cloramfenicol• Ampicilina• Cefalosporine• Trimethoprim-Sulfametoxazol• Chinolone• Aminoglicozide

3/1/2018

23

Salmonella

Profilaxie• Masuri de igiena personala si publica (! Purtatorii

sanatosi)• Vaccin antiSalmonella tiphy, dar ofera protectie

limitata in timp; doar pentru populatia la risc

Professional cook for affluent families –whenever she settled in, most of the family members developed typhoid fever within 2 weeks.

Twice forcibly isolated, died after a total of nearly three decades of isolation.

Thought to be responsible for 20-30 outbreaks of the ilness.

After the first quarantine, changes her name to Mary Brown and continues to work as a cook.

After death, autopsy reveales the presence of S. typhi in her gallbladder.

Mary Mallon (1869-1938)

3/1/2018

24

Enterobacterii oportuniste

Escherichia

Klebsiella – Enterobacter – Hafnia – Serratia

Proteus – Providencia – Morganella

Arizona – Edwarsiella – Citrobacter

Enterobacterii oportuniste

Escherichia coli

~ 80% flora normală a colonului

~ bacili Gram-negativi

~ lactozo-pozitivi

~ luciu metalic – mediul Levin

3/1/2018

25

Escherichia coli

Tipuri de îmbolnăviri:

• boli diareice – doar tulpinile enteropatogene

• infecţii urinare

• infecţii ale plăgilor

• sepsis

Escherichia coli

Tulpini care produc boli diareice:

~ ETEC (E.coli enterotoxigen)

~ EIEC (E.coli enteroinvaziv)

~ EPEC (E.coli enteropatogen)

~ EHEC (E.coli enterohemoragic)

~ VTEC (E.coli produce toxină Shiga-like) → O157:H7

3/1/2018

26

GENUL ESCHERICHIAE. coli

Frotiu colorat Gram din cultura pura

E. coli pe mediul ADCL (bacterie lactozo-pozitiva)

3/1/2018

27

E. coli

Mediul LevineMediul Drigalski

E. coli

Mediu cromogen

Colonii roz

3/1/2018

28

Escherichia coliIdentificare biochimică

IMViC• Testul indol• Testul roşu metil• Reacţia Voges-Proskauer• Testul citrat

OXIDATIE-FERMENTATIE

E. coli este un bacil lactozo-pozitiv si care degradeaza si fermentativ glucoza

Mediul TSI neinsamantat

3/1/2018

29

Teste biochimice rezultate din tipurile de fermentatie

• TESTUL ROSU-METIL

• TESTUL VOGES-PROSKAUER

TESTUL ROSU-METIL

• Scop: fermentarea substratului si scaderea pH-ului sub 5• Tehnica:

– tulpina bacteriana testata se insamanteaza in apa peptonata glucozata. – Incubare 18h la 37 C. – Developare cu solutie rosu fenol

• Interpretare: – Test + culoare rosie (pH<5): E. coli– Test - culoare galbena (pH>5): Klebsiella

3/1/2018

30

TESTUL VOGES-PROSKAUER

• Scop: evidentierea fermentatiei acetoinice

• Tehnica: – tulpina bacteriana se insamanteaza in apa peptonata glucozata. – incubare 18h la 37 C. – Se alcalinizeaza. – Developare cu alfanaftol.

• Interpretare:– test + inel rosu-violaceu la interfata de contact: Klebsiella– Test - : E.coli

TESTUL VOGES-PROSKAUER

3/1/2018

31

TESTUL INDOL

• Scop: evidentiaza prezenta triptofanazei• Tehnica:

– cultura bacteriana de 24h in apa peptonata – benzi indicatoare cu reactiv indol.

• Interpretare: – test + culoare rosu-violaceu (E.coli)

Grupul Klebsiella – Enterobacter – Hafnia –Serratia

Klebsiella pneumoniaeKlebsiella rhinoscleromatisEnterobacter cloacaeEnterobacter aerogenesHafnia alveiSerratia marcescens

3/1/2018

32

Grupul KEHSTipuri de îmbolnăviri:

~ Dobândite în spital~ Infecţii cu localizări <=> E.coli~ Cauze importante de bacteriemii~ Klebsiella pneumoniae – inf. pulmonară~ Majoritatea → tulpini cu rezistenţă mul plă la

antibiotice

Klebsiella pneumoniae

~ cantităţi moderate în intestinul omului /animalelor

~ infecţii respiratorii, urinare, otite~ bacili Gram-negativi~ capsulă polizaharidică ~ colonii mari mucoase , fenomen de

cameleonaj

3/1/2018

33

KlebsiellaKlebsiella

Frotiu coloratia tuş de China

3/1/2018

34

Klebsiella pneumoniae – colonii mucoase datorita capsulei

Klebsiella

Proprietati biochimice

3/1/2018

35

Proteus vulgaris, P.mirabilis

~ saprofiţi (materie organică în descompunere)~ flora intestinală normală~ infecţii urinare, alte tipuri de infecţii~ bacili Gram-negativi, mobili~ lactozo-negativi~ invadează suprafaţa mediilor gelozate

Genul Proteus

Proteus vulgaris

Flageli

3/1/2018

36

Genul Proteus – fenomenul de migrare

PRODUCEREA DE H2S

3/1/2018

37

TESTUL UREAZEI

• Scop : evidentierea ureazei, enzima ce scindeaza ureea cu formare de amoniac

• Substrat: mediu de cultura ce contine uree si indicator colorimetric (de Ph).

• Tehnica:– tulpina bacteriana testata se inoculeaza in mediu. – Se incubeaza 18h la 37 C.

• Interpretare:– test+viraj corespunzator al zonei bazice: Proteus

Proteus spp.

Ureaza +

H2S

3/1/2018

38

TESTUL FENILALANINDEZAMINAZEI

• Scop: evidentierea prezentei FAD• Substrat: agar inclinat ce contine fenil-alanina• Tehnica:

– tulpina bacteriana se insamanteaza pe panta agarului. – Developarea reactiei cu FeCl3

• Interpretare: test+ aparitia culorii verzi (Proteus)

Yersinia pestis

~ ciuma (pesta)

~ bacili Gram-negativ

~ capsulă proteică

Yersinia enterocolitica~ Sdr. Diareic febril

Yersiniapseudotuberculosis~ Inf. la păsări, rozătore, rar

om~ Lez. tipică: noduli

asemănători celor tbc în intestin, org. parenchimatoase

3/1/2018

39

Identificarea bacteriilor utilizand proprietatile lor biochimice

bioMérieux VITEK2

3/1/2018

40

MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)

Dupa identificarea bacililor Gram negativi se realizeaza testatrea sensibilitatii lor la antibiotice

Antibiograma – obligatorie • Beta-lactamine• Carbapenemi• Cefalosporine• Chinolone• Aminoglicozide • Polimixine (Colistin)• Trimetoprim-sulfametoxazol

3/1/2018

41

Bacili Gram negativi aerobi glucozo-nefermentativi

Pseudomonade

- bacili Gram negativi

- strict aerobe, metabolism oxidativ

- catalazo-pozitivi si oxidazo-pozitivi

Bacili Gram negativi aerobi glucozo-nefermentativi

Pseudomonade• specii fluorescente, care produc pigmenti

difuzibili fluorescenti: – Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic)– Pseudomonas putida, – Pseudomonas fluorescens;

• specii non-fluorescente: – Pseudomonas alcaligenes, – Pseudomonas pseudoalcaligenes.

3/1/2018

42

Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic)

• patogen nosocomial (10% din totalul infectiilor nosocomiale)

• Bacterie oportunistă• Habitat:

– sol, apă – Poate coloniza tubul digestiv şi pielea persoanelor

sănătoase

Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic)

• ITU• infectii de tract respirator• infectii ale plagilor, suprainfectii ale arsurilor• bacteriemie, septicemie, infectii sistemice, mai ales

la pacientii imunocompromisi• otite externe la inotatori ;

• infectii oculare dupa interventii chirurgicale

3/1/2018

43

Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic)

Proprietati microscopice:

• bacili Gram negativi

• mobili

Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic)

Proprietati de cultura:

• pigment difuzibil fluorescent de mai multe tipuri:* piocianina, albastra, cu proprietati antibacteriene fata de alte specii bacteriene* pioverdina, galben-verde culoarea verde, stralucitoare* piorubina, rosie, ocazional*piomelanina, bruna, ocazional

• cultura degaja o aroma caracteristica, aromata, asemanatoare cu florile de tei, iasomie, mere verzi

• strict aeroba

3/1/2018

44

Pseudomonas spp.► Bacil Gram-negativ, mobil► Nefermentativ

► Se dezvoltă pe medii simple, geloză nutritivă → producere de pigment difuzibil

Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic)

Antibiograma – obligatorie • foarte rezistenta la antibiotice;• are rezistente naturale multiple, datorate structurii

peretelui celular.• Carbapenemi• Penemi • Unele Cefalosporine gen. III; gen. IV• Chinolone• Aminoglicozide • Polimixine (Colistin)• In caz de monoterapie dezvolta rapid rezistenta.

3/1/2018

45

Genul Vibrio

• bacterii Gram-negative

• foarte mobile (cil polar)

• formă de bastonaş încurbat

• facultativ anaerob

• majoritatea speciilor saprofite, unele produc îmbolnăviri

uşoare

3/1/2018

46

Specia tip: Vibrio cholerae

• două biotipuri holerigene: ► cholerae clasic► El Tor

• V. cholerae O139 "Bengal" (1992, Bangladesh → derivate din biotipul El Tor

• mai multe biotipuri neholerigene (sindroame diareice benigne)

Habitat: apa de mare, apa de suprafaţă

Contaminare:► apă, alimente

contaminate ► fecal-orală

Infecţie:Holera = infecţie acută,

intestinală

► diaree apoasa► deshidratare masivă► stare generală alterată► evoluţie severă

Genul Vibrio

3/1/2018

47

Structura antigenică

variaţia antigenică → rol în epidemiologia

holerei şi virulenţa vibrionilor holerici

• Ag H (flagelar) → specificitate largă

• Ag O (soma c) → strict specific

• Şase serogrupuri O1 → O6 • Vibrionii holerigeni = serogrup O1 conţin trei factori

antigenici: A, B, C

• ► 3 serotipuri: → Ogawa (AB)→ Inaba (AC)→ Hikojima (ABC)

• ► Fiecare serotip poata exprima fenotip „casic” sau El Tor

• ► V. cholerae O139 "Bengal" este singurul serotip non-O1

3/1/2018

48

3/1/2018

49

Recoltarea produselor patologice

► Materii fecale → mediu de transport Cary-Blair

► Lichid de vărsătură

►Apă potabilă, alimente

Izolare

► apă peptonată alcalină (mediu de îmbogăţire)

► mediu cu săruri biliare (BSA)

3/1/2018

50

a) Caractere morfo-tinctoriale:

bacili Gram-negativiîncurbaţi

Genul Vibrio

b) Caractere de cultură:► Mediul BSA: Colonii tip S, transparente

c) Caractere antigenice:► vibrionii holerigeni aglutinează cu ser

anti-O1► vibrionii neholerigeni nu aglutinează cu ser anti-O1 (neaglutinabili – NAG)

d) Caractere de patogenitate: testul ansei ligaturate

Genul Vibrio

3/1/2018

51

Tratament

• reechilibrare hidro-elecroliticăantibiotice: • Tetraciclina• Cloramfenicol• Sulfamide• Aminoglicozide• Chinolone

Genul Helicobacter

• bacili Gram negativi, incurbati pana la spiralati• mobili prin unul/mai multi flageli• microaerofili• speciile gastrice se caracterizeaza prin producerea de ureaza

in cantitati mari• Implicat in etiologia ulcerului gastric si duodenal, a diferitelor

tipuri de gastrite, a cancerului gastric

3/1/2018

52

Helicobacter pylori

Recoltarea produselor patologice: biopsie din mucoasa gastrica (endoscopie); prelevarea de probe multiple=>4 fragmente din antru, regiunea fundica.

• Important: cel putin o luna fara tratament inainte de recoltarea probei.

un fragment plasat direct in mediu cu uree si indicator de pH (rosu fenol)+ureaza preformata a HP =>virarea indicatorului de pH in galben;

examen histopatologic

3/1/2018

53

Helicobacter pylori

Recoltarea produselor patologice: biopsie din mucoasa gastrica (endoscopie); prelevarea de probe multiple=>4 fragmente din antru, regiunea fundica.

frotiu: bacili Gram negativi, incurbati; IF pentru diagnostic diferential cu Campylobacter

cultura: colonii mici, transparente, apar in 3-7 zile; permite testarea sensibilitatii la antibiotice.

Helicobacter pylori

Metode neinvazive:• testul respirator cu uree marcata :

– ingerare uree marcata cu C13 (neradioactiv) sau C14 (radioactiv) => intensa activitate a ureazei, daca exista HP in stomac => eliberare de CO2 marcat, absorbit in circulatia sanguina si eliminat prin respiratie => detectat si cuantificat in aerul expirat (spectroscopie de masa);

– dezavantaj: este foarte costisitor.

3/1/2018

54

Helicobacter pylori

Helicobacter pylori

• detectarea anticorpilor specifici, in special de tip IgG; • ELISA; • cost relativ scazut, • indicat preferential in studii epidemiologice.

3/1/2018

55

Helicobacter pylori

Indirect diagnosis: SerologicDetection of specific antibodiesELISA – Ig G anti HP

Helicobacter pylori

Determinarea antigenului din materiile fecale recoltate de la pacient – test imunocromatografic, rapid, 15-20 min.

3/1/2018

56

Helicobacter pylori - Tratament

• Combinatie intre un inhibitor de pompa de protoni (ex. Omeprazol, esoprazol… ) si 2 antibiotice pentru 10-14 zile

• Macrolide (Claritromicina), • Amoxicilina,• Metronidazol, • Chinolone.