ASPETTI GENETICI E MOLECOLARI DELLA FARMACO...

Ann In Super. Sanità Vol. 22, N. 1 (19863, pp. 153-156

ASPETTI GENETICI E MOLECOLARI DELLA FARMACO-RESISTENZA IN SCHISTOSOMA MANSONI

Istituto di Biologia Cellulare,CNR,Roma

~iassunto-E' stato studiato il meccanismo d'azione di farmaci del gruppo Icanto- ne e Oxamiquina per quanto riguarda il loro effetto sulle sintesi macromolecolari e sulla sopravvivenza di Schistosomi tenuti in vitro o dopo trattamento in vivo dell'ospite.

Introduzione

L'identificazione di gruppi attivi nelle molecole di farmaci permette di raggruppare i composti in famiglie,(cosa importante in casi di farmaco-resistenza e di terapie associate) e di sintetizzare molecole che, pur mantenendo caratteristiche farmacologiche , siano più convenienti dal punto di vista di tos- sicità, somministrabilit& e costo.

Un esempio ,da noi studiato, di farmaci schistosomicidi aventi lo stesso meccanismo d'azione , h quello delllIcantone e dell'Oxamiquina.questi composti mostano tra di loro una serie di somiglianze strutturali e biologiche.

Fig.1.-Formule strutturali dei composti studiati.

Come si vede nella figura 1, le loro molecole planari portano una catena late- rale alchilamino-etilamino in posizione para rispetto al gruppo critico -CH OH.

2 Entrambi i composti , prodotti ossidativi di precursori (inattivi in vitro )

aventi in R un gruppo metilico , sono attivi in vitro ed in vivo nel trattamento di infezioni di S.mansoni, ma non di S.japonicum; inoltre ceppi di schistosomi resistenti alllIcantone ( selezionati in natura ed in laboratorio) mostrano una cross-resistenza nei confronti dell'oxamniquina .

Materiali e Metodi.

I ceppi di Schistosoma usati,come pure i metodi di incubazione in vitro con precursori radioattivi ,sono stati precedentemente descritti,( 1, 2).

Risultati e Discussione.

Dell'~cantone, farmaco storicamente più vecchio dell'oxamniquina per l'im-

piego terapeutico e di cui sono note alcune caratteristiche chimico-fisiche e biologiche (interazione col DNA, mutagenicita e cancerogenicità), abbiamo studiato l'azione sulle sintesi macromolecolari nel sistema di schistosomi sensibili e resistenti dopo trattamento in vitro ed in vivo. E' risultato che questo composto causa un blocco irreversibile delle sintesi di acidi nucleici( ed in minor misura di proteine) di schistosomi adulti; tale blocco é invece completamente reversibile ( dopo rimozione del farmaco) nei sistemi resistenti: S.japonicum,ceppi Icantone-resistenti , forme immature di S. - mansoni e cellule HeLa (considerate queste ultime come modello di cellule del- ltospite).Abbiamo messo cioé in evidenza una stretta correlazione tra inibizione irreversibile delle sintesi di acidi nucleici e morte del parassita. Le stesse ricerche,estese al1'0xamniquina. hanno dato analoghi risultati, dando forza all'ipotesi,basata inizialmente soltanto sulla cross-resistenza dei due farmaci, secondo cui 1'Icantone e 1'0xawiquina uccidono i parassiti con il me- desimo meccanismo d'azione.

Per quanto riguarda l'aspetto genetico della resistenza , é risultato, dal- l'analisi della progenie ( F1 ed F2 )di incroci tra ceppi wild-tipe e ceppi resistenti alllIcantone , che ia resistenza é un carattere autosomale recessivo(3). La recessività del carattere "resistenza" (deficienza di qualche attività), i tempi relativamente lunghi (2-3 settimane)necessari a questi farmaci per espli- care la loro azione mortale,pur dopo un breve contatto col parassita,ci hanno indotto a pensare ad una certa analogia con noti agenti cancerogeni e ad ipotizzare che 1'Icantone (e llOxamniquina ) non siano i veri agenti schistosomicidi ma che essi vengano trasformati nel verme sensibile(ma non nei sistemi resistenti,per motivi genetici o di sviluppo) nei composti. attivi,dotati di atti- vità alchilanti e capaci quindi di legarsi covalentemente alle macromolecole , in particolare al DNA, degli organismi. Questa ipotesi trova forte supporto dall'uso di un derivato dell1Icantone,l'e- stere metil-carbamato, composto per il quale sono s ta t e messe in evidenza pi2 spiccate caratteristiche antitumorali e maggiori capacità alchilanti rispetto alltIcantone. Abbiamo trovato infatti che il trattamento con questo estere causa un blocco irreversibile delle sintesi di acidi nucleici e,come atteso, causa la morte dei parassiti , non solo nei vermi sensibili ma anche in quelli resistenti alltIcantone.

Nella tabella 1 sono riportati i risultati,espressi come % del controllo, delL L'incorporazione di uridina tritiata , due ore dopo trattamento in vitro con oxamniquina (OXA), Icantone (HC) e Icantone rnetil -carbamato (HC-MC),di vermi sensibili e di vermi resistenti (ceppi Icantone-resistenti, vermi immaturi e ~.ia~onicum).Nella stessa tabella sono parallelamente riportati i valori di soprawivenza di vermi trattati nelle stesse condizioni .Come si vede,esiste m a netta correlazione tra inibizione di incorporazione del precursore tri- tiato e morte dei vermi.

Altri esteri delllIcantone( acetato, propionato ecc.) sono stati da noi saggiati ed 6 stata trovata una forte corrispondenza tra capacita alchilante e rchistosomicida.

Grazie all'uso di molecole tritiate (ricerche in corso) ci proponiamo di dimostrare che 1'Icantone si lega covalentemente alle macromolecole di parassiti sensibili ma non a quelle di forme resistenti, mentre llIcantone metil-carbamato si lega alle macromolecole di entrambi.

3 Tabella 1. - Effetto dei farmaci sulla incorporazione di H-uridina (I) e sulla

sopravvivenza (SI degli schistosomi. Tutti i valori sono espressi come % rispetto ai controlli non trattati.

OXA HC HC-MC Schistosomi

I s I S I S

Sensibili 30 O 34 3 29 O

Resistenti 98 88 93 90 40 6

Immaturi 65 74 96 35

S. japonicum 93 126 20

BIBLIOGRAFIA

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A m 1 s t Supa. Sanità Voi. 22, N. 1 (1986A pp. 157-162

UN DNA SINCRONIZZATORE: IL KDNA DEI TRIPANOSOMI

P.A. Battaglia. C. Birago h M. Ponzi

Laboratorio di Biologia Cellulare, Istituto Superiore di Sanità. Roma

Riassunto. - I 5000-10000 cerchietti di DNA contenuti nell'unico mitocondrio dei kinetoplastidi sembrano non codificare nulla: non è mai stata isolata una proteina codificata da essi, non vengono tradotti nelle mini cells, sono estremamente eterogenei in sequenze di nucleotidi. Malgrado ciò la loro perdita produce dei mutanti diskinetoplastici non vitali. Qual'è allora la funzione dei minicircles? Noi ipotizziamo che servano a sincronizzare la replicazione del DNA mitocondriale con la replicazione del DNA nucleare in modo da impedire la perdita dell'unico mitocondrio dei Tripanosomatidi.

Summary. - The 5000-10000 DNA minicircles of the unique mitochondrion of kinetoplastides protozoa do not codify for any protein. The DNA of mini-circles is extremely heterogeneous in sequences and is not translatable into bacterial mini-cells. In spite of the loss of mini-circles lethal diskinetoplastic mutants are produced. What is the mini-circle function? We hypothesize that these mini-circles synchronize the replication of mitochondrial and nuclear DNA in order to prevent the loss of the only mitochondrion of Trypanosomatide.

Introduzione

I1 DNA del kinetoplasto, l'unico mitocondrio dei protozoi parassiti tripanosomi, è la forma più "barocca" di DNA che si conosca. Esso è. infatti, un gigantesco gomitolo costituito da migliaia di "cerchietti" di DNA concatenati tra loro (dai 5 ai 10.000 per ogni kinetoplasto) nelle diverse specie. e da poche decine di grandi circoli di DNA con funzione di DNA mitocondriale dell'animale (1. 2).

Come è strutturato internamente e che funzione ha un oggetto biologico tanto strano?

Dalla parte della struttura

Le prime osservazioni al microscopio elettronico della gigantesca matassa del kDNA misero in evidenza che i cerchietti di DNA, pur così numerosi, erano però tutti uguali, in dimensioni, nell'ambito di una stessa specie (3).

Si pensò così che i 10.000 cerchietti si originassero, per replicazione. da uno solo e che la straordinaria amplificazione desse origine a cerchietti tutti uguali, in ultima analisi, nella sequenza.

Quando però fu possibile isolare e saggiare biochimicamente la matassa del kDNA, la sorpresa non fu piccola nel constatare che i cerchietti, tutti uguali al microscopio elettronico, apparivano uno diverso dall'altro, se digeriti con gli enzimi di restrizione (4).

Tutti uguali o tutti diversi? La soluzione poteva ottenersi solo isolando

siiig:oij. cerch ia t i1 $ 2 : . q~s:p:i.tn c ; » i t : , . ; ~ e ~ i u c . & +em;e.i.~< 8 e I. ' 'Ex;;>.!.c:~ I~ .L, , f ! A i.,,.:

della sequenza nucleotidica, ciiia:endrj (:cibi d.(~~fiiiii?varncrri t - ~ual e ~fJ.S8f- i I ,

StTUttUld. E' quello che abbiamo fatto nel nostro Laboratorio con Maxa :'onz:,

Cecilia Birago "c:lonando" singoli cerchietti del kDNA del T. lewisi con i metc ormai classici del.llingegneria genetica e sottoponendo quindi un paio di quri:; cerchietti all'analisi delle sequenze nucleotidiche con il metodo di Sanger (f',

La struttura dei cerchietti è quella che appare nella Fig. 1,

Fig. 1 - Struttura dei mini-circles dopo sequenza dei nucleotidi. In tratto spesso, la regione costante (K); in tratto sottile, la regione variabile. Minicircle BAM ed ECO.

Affacciate simmetricamente l'una all'altra appaiono, in ogni cerchietto,, due regioni nucleotidiche che sono completamente uguali tra di loro. e che sonc anche uguali nelle migliaia di altri cerchietti del kDNA del T. lewisi: abbiami dato a queste regioni il nome di regioni costanti. (K). Tutto il resto dell,, sequenza appare profondamente variabile tra uri cerchietto e l'altro.

Cosa awione se si paragonano regioni costanti di cerchiet.ti appart-enenti : specie diverse la cui sequenza 6 stata fatta da altri autori, ad esempio,, minicircles di tripanosomatidi, lontanissimi evolutivamente, come il nostro lewisi e la Leishmania tarentolae ( 6 ) ? In seno alle regioni costant. avpartenenti alle diverse specie si conserva un nucleo comune di sequenzc (&%TTGGTGTAATA) fiancheggiato da due sequenze ripetute M(GGTGGGAC) c C(CAGGGTGG) delle quali l'una S l'immagine speculare dell'altra.

La permanenza di una regione nucleotidica identica in specie così lontane,, suggerisce che a mantenerla sia stata una pressione selettiva così forte dc ipotizzare una funzione comune e importante per tutti i Tripanosomatidi, localizzata nei nucleotidi della regione Super K: forse la regione che presiedc alla replicazione dei mini-circles. Nel nostro, come in altri laboratori, si sta lavorando intorno a questa possibilità.

Dalla parte della funzione

L'approccio generale seguito per chiarire la funzione di un tratto di DNA è quello che parte dal presupposto che il DNA, qualunque questo sia, contenga un'informazione che, per essere espressa, viene trascritta in RNA e, nella maggieranza dei casi, tradotta in proteine.

Un primo approccio è quello quindi di dimostrare, nei Tripanosomi, un RNA sintetizzato dai mini-circles.

Nessuno ì? mai riuscito a dure una dxmostrazione de1J.a presenza di un RNA

[roscritto nei mini-circles, eccetto in un caso. mai ripetuto da altri (7). Nell'impossibilità di dimostrare direttamente, nel Tripanosoma, la presenza

d l proteine espresse dai mini-circles, si può vedere di saggiare la capacità mipressiva dei mini-circles in un sistema eterologo, ad esempio nei batteri, in rui sia più semplice mettere in rilievo una proteina espressa dai mini-circles.

Sia noi che Brunel abbiamo introdotto un singolo cerchietto nei batteri per trasformazione, per poi saggiare la presenza di proteine codificate dal mini-circle (8).

Per Brunel la biosintesi di una proteina non c'è, per noi c'è. Soltanto che 8 troppo lunga (19.000 dalton) per l'open reading frame trovata nei nostri ccrchietti tanto da far supporre un artefatto prodotto dalla saldatura del veicolo (il plasmide) che ci è stato necessario per introdurre il cerchietto nel batterio.

Un mini-circle: un replicon

Un DNA che non ha altra funzione se non quella di replicarsi come si Integra nel funzionamento della cellula?

I Tripanosomatidi posseggono un solo mitocondrio che non va perduto: Infatti l'unico Tripanosoma che può farne a meno. il T. equiperdum, non è in urado di passare per un insetto vettore. Inoltre mutanti diskinetoplastici sono letali per gli altri Tripanosomi, e quello che è importante è che essi sono prodotti da farmaci che rendono asincrona la replicazione del mitocondrio con quella del nucleo. Allora perché il mitocondrio non sia perso, la fase S del kinetoplasto deve essere uguale a quella del nucleo SN ed è ciò che realmente r~wiene (9). Ma come ottenere SN = S1( se il DNA del nucleo è 4 volte di più del DNAK (2)? L'eguaglianza nei tempi di SN e SK è possibile se il numero dei replicon del DNA nucleare RN è uguale al numero dei replicon del kinetoplasto KK

I1 replicon è definito come unità capace di replicazione autonoma. In base a questa definizione ogni mini-circle corrisponde ad un replicon infatti: 1) Christine Brack ha dimostrato che ogni circolo ha la possibilità di replicarsi indipendentemente (10); 2) Kidane e anche noi abbiamo dimostrato, trasformando il lievito, che ogni sequenza saldata ai mini-circles è replicata come parte del mini-circle.

Allora se ogni mini-circle è un replicon RK = 5000 numero dei mini-circles in un kinetoplasto. E RN? RN = 6 x 107 l2 x lo4 (numero di basi presenti nel nucleo dei tripanosomi al numeratore ed al denominatore lunghezza media di un replicon sempre in coppie di basi).

In definitiva RK = RN infatti 5 x 103 = 3 x 103. La dimostrazione che ogni mini-circle rappresenta un replicon offre una

spiegazione a tre proprietà comuni a tutti i mini-circles: 1) forma circolare 2) numero costante (in seno ad ogni specie) 3) dimensioni uguali (in seno ad ogni specie). 1) Replicon lineari sono variabili in numero e in dimensioni, la forma

circolare mantiene l'identità di ogni singolo replicon. 2) Se variasse il numero dei mini-circles ad ogni replicazione, il DNA del

mitocondrio non riuscirebbe a sincronizzare la sua replicazione con quella del nucleo.

3) Se variassero le dimensioni tra i diversi mini-circles varierebbe anche il tempo di replicazione di ciascun cerchietto. Inoltre, l'estrema variabilità della sequenza. con solo un tratto perennemente conservato, fa dei mini-circles una struttura ideale per un DNA senza geni in grado solo di replicarsi.

Con quale velocità si replicano i mini-circles

Si può trovare anche un altro modo, un po' indiretto, per dimostrare che ogni mini-circle è un replicon.

Dai lavori di Cosgrave (9) e dei Simpson (11) sappiamo che da un kinetoplasto se ne originano 2 in 60 minuti. In questo tempo i cerchietti del kDNA debbono essere duplicati dalla DNA polimerasi. La velocità di duplicazione dei cerchietti dipende dal tipo di DNA polimerasi usata.

Tra tutte le polimerasi i mini-circles dovrebbero usare quella mitocondriale arganello in cui sono rinchiusi. Vediamo se è vero.

Tabella 1. - Con quale velocità si replicano i mini-circles

Mitocondrio 0.05 Eucarioti 0.5.5 Batteriofago 5 Procarioti 1 O0

Dalla Tab. 1 può osservarsi che le polimerasi dei batteri e dei loro virus sono troppo veloci. Infatti, nel tempo in cui viene sintetizzata l'intera matassa del kinetoplasto esse sarebbero in grado di sintetizzarne una cento e mille volte più grande. La DNA polimerasi eucariotica, confinata nel nucleo, è anche essa troppo veloce di 10-100 volte. E' soltanto la DNA polimerasi del mitocondrio che ha una velocità adatta a completare la sintesi del DNA del kinetoplasto nel tempo giusto.

E' da notare che nel mitocondrio sono presenti dalle 200 alle 400 molecole di DNA polimerasi (12). solo poche di queste sono però attive, fatto questo che mantiene la velocita di sintesi nell'ordine del numero di replicon della Tab. 1.

I1 calcolo teorico della velocità con cui dovrebbe replicarsi il DNA del kinetoplasto è in accordo così con l'ipotesi che ogni mini-circle sia un'unità di replicazione autonoma.

Conclusioni

Tutto è in favore così dell'ipotesi che il DNA del kinetoplasto assolva ad una funzione assolutamente originale: la sincronizzazione tra i tempi di replicazione del DNA mitocondriale e quello del nucleo.

I1 D N A si rivela così un oggetto biologico buono, non solo come bersaglio assolutamente specifico dei farmaci antitripanosomiaci, ma anche per pensare.

L'approccio ormai classico struttura-funzione della biologia moderna sembra qui non completamente soddisfacente se limitato allo studio di una parte (il Kdna) priva di funzioni se considerata isolata dal resto. La funzione del Kdna, di sincronizzare la replicazione del mitocondrio con quella del nucleo non sembra proprietà di una parte ma, integrata nel complesso cellulare, è parte del tutto.

BIBLIOGRAFIA

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Ann. bt. Super. Sanità Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 163.168

ETEROGENEITA' DELLA TUBULINA DEI PROTOZOI PARASSITI

P. Cappuccinelli (a), D. Zicconi (a), C. Sellitto (a) & V. Viclicky (b)

(a) Istituto di Microbiologia (Facoltà di Medicina), Università di Sassari, Sas- sari; ( b ) Institute of Molecular Genetics, Czechoslovak Academy of Sciences, Praha, Krc. Riassunto. - Utilizzando anticorpi monospecifici e monoclonali prodotti contro tubulina di cellule superiori è stata studiata, con l'immunofluorescenza indiretta e l'immunoblotting, la reattività immunologica della tubulina di Tricho- monas vaginal is, Herpetomonas muscarum, Leishmania tropica e Naegleria gruberi . I risultati mostrano un notevole grado di eterogeneità immunologica sia della tubulina delle differenti strutture microtubulari di uno stesso Protozoo, sia rispetto alla tubulina di cellule superiori.

Summary. - The immunoreactivity of tubulin of Trichomonas vaginalis, Herpetomo- nas muscarum, Leishmania tropica and Naegleria gruberi has been evaluated using indirect immunofluorescence and imnunoblotting with monospecific and monoclonal antibodies raised against tubulin from higher cells. Our results show an immuno- logica1 heterogeneity of tubulin both within the same protozoan ce11 and with respect to the tubulin of higher organisms.

Introduzione

La tubulina costituisce una delle proteine principali dei Protozoi. In particolare, nei Protozoi flagellati e dotati di microtubuli pel licolari o assostilari rappresenta quantitativamente una quota cospiqua delle proteine totali, potendo raggiungere, come nelle Leishmanie, anche i l 10-20% (1). Poichè essa è la proteina costitutiva dei microtubuli , indispensabili per numerose funzioni cellulari, quali la motilità, il mantenimento della forma, l'espressione di antigeni di membrana, la mitosi, ecc., teoricamente rappresenta un ottimo bersaglio di inibitori specifici in grado di bloccare le funzioni cellulari in cui è coinvol- ta. Perchè questi inibitori possano essere eventualmente utilizzati in terapia, è necessario che siano dotati di specificità assoluta verso la tubulina dei Pro- tozoi parassiti, in modo da non interferire con le analoghe strutture delle cellule dell'ospite. Questa specificità è possibile solo nel caso in cui la tubulina dei Protozoi sia differente nella struttura chimica da quella degli organismi superiori. Lo scopo di questo lavoro è la dimostrazione dell'eterogeneità della tubulina di alcuni Protozoi parassi ti confrontandola con quel la di ce1 lule superiori. E ' stata anche studiata l'eterogeneità di tubuline appartenenti a strutture cellulari diverse all'interno di uno stesso Protozoo. L'approccio è stato

d i t i p o immunochimico u t i l i z z a n d o a n t i c o r p i monoclonali e monospeci f ic i i n grado d i r iconoscere determinant i a n t i g e n i c i d i v e r s i d e l l a tubu l ina .

M a t e r i a l i e Metodi

Protozoi . Sono s t a t i u t i l i z z a t i i seguenti Protozoi : Trichomonas vag ina l i s , (ceppo i s o l a t o da un caso d i t r ichomonias i vaginale acuta), Leishmania t r o p i c a (gent i lmente f o r n i t o dal Dr.C.Bordier, Lausanne), Naegler ia g ruber i NEG (ATCC 30223) ed Herpetomonas muscarum ( i so l a to ne l nos t ro l a b o r a t o r i o ) . I pro tozo i venivano c o l t i v a t i secondo l e tecniche usua l i (2 ) ed erano u t i l i z z a t i i n fase d i c r e s c i t a logar i tm ica . La conta de i Protozoi e ra e f f e t t u a t a con metodo d i r e t t o con l a camera d i Thoma. La v i t a l i t à veniva determinata con il metodo d e l l ' e s c l u - sione del b l u t r ipano.

A n t i c o r p i . La preparazione del l ' an t icorpo monospecif i c o a n t i - tubul i n a d i f l a g e l l o d i spermatozoo del r i c c i o d i mare Strongylocentrotus purpuratus (MS) è s t a t a precedentemente d e s c r i t t a ( 3 ) . La produzione e l a ca ra t te r i zzaz ione d e g l i a n t i c o r p i monoclonal i a n t i - tubu l i n a d i cerve1 l o (TU-O1 , TU-02, TU-03 e TU-04) sono r i p o r t a t e a l t r o v e ( 4 e manoscr i t to i n preparazione). G l i a n t i c o r p i monoclo- n a l i a n t i - t u b u l i n a d i l i e v i t o (YL 1/2 e YL 1/34) sono s t a t i gent i lmente f o r n i t i da l Dr. J. K i lmar t i n , Cambridge, U.K.

Immunoblotting. Dopo e l e t t r o f o r e s i del l e ce1 l u l e su ge l d i p o l i a c r i l a m i d e i n cond iz ion i denaturant i (5 ) , i campioni erano t r a s f e r i t i e l e t t ro fo re t i camen te dal ge l su c a r t a d i n i t r o c e l l u l o s a ( M i l l i p o r e ) secondo l a tecn i ca de l1 'immuno- b l o t t i n g ( 6 ) . Era p o i p o s s i b i l e l o c a l i z z a r e l e bande d e l l a t u b u l i n a mediante co- l o raz ione r e v e r s i b i l e con epar ina-b lu d i t o l u i d i n a . Dopo decolorazione, l e membrane erano sa tu ra te con s i e r o bovino a l 30% e qu ind i incubate con opportune d i - l u i z i o n i d i an t icorpo i n Tris-C1 lombi, NaC1 0,15M, pH 7,4 (TBC) per 4 ore a 22°C. I 1 complesso immune veniva ev idenz ia to con un secondo ant icorpo coniugato con perossidasi , usando 1 ' a -c lo rona f to lo come subst ra to d e l l a reazione enzima- t i c a .

Immunofluorescenza. Le c e l l u l e erano f i s s a t e e permeabi l izzate con una d e l - l e t r e seguenti metodiche: formaldeide 3% e T r i t o n X-100 0,2% i n "cytoskeleton b u f f e r " (CB) ( 7 ) per 20 min., g lu ta ra lde ide 1% e T r i t o n X-100 0,2% i n CB per 20 min., formaldeide 3% i n CB per 20 min. segu i ta da metanolo per 10 min. a -20°C. I microrganismi erano po i i ncuba t i con i d i v e r s i a n t i c o r p i monospeci f ic i e monoclonali i n camera umida, a 37°C per 45 min. I v e t r i n i erano l a v a t i con TBS per 30 min. e successivamente i ncuba t i i n camera umida a 37OC per 45 min. con a n t i - l ( -g lobul ine d i topo o d i c o n i g l i o coniugate con i s o t i o c i a n a t o d i f l u o r e - sceina (DACO). Dopo r i p e t u t i lavaggi i n TBS, i v e t r i n i erano montat i con Gelva- t 0 1 (81, osserva t i con un microscopio L e i t z Laborlux 20 e f o t o g r a f a t i su p e l l i - c o l a I l f o r d HP5.

R i s u l t a t i

L ' i m u n o r e a t t i v i t à d e l l a t u b u l i n a d i Protozoi f l a g e l l a t i e d i arnoebe d i Naegler ia g ruber i con a n t i c o r p i a n t i - t u b u l i n a monospeci f ic i e monoclonali, d i d iversa o r i g ine , è s t a t a s t u d i a t a con l a t ecn i ca de l l ' immunob lo t t ing dopo e l e t - t r o f o r e s i su gel d i po l i ac r i l am ide e t ras fer imento su f o g l i d i n i t r a t o d i c e l l u -

Tabe l la 1. - Immunoblotting d i t u b u l i n e d i Protozoi con a n t i c o r p i monospecif ici e monoclonal i ant i - t ubu l ina.*

Protozoi An t i co rp i MS TU-O1 TU-02 TU-03 TU-04 YL 1/2 YL 1/34

Trichomonas vag ina l i s t t t t - - - - Herpetomonas muscarum t - nd nd nd t t

L e i shmani a t r o p i c a t t t t t nd nd

Naegler ia g ruber i - nd nd nd t - t - t = reazione pos i t i va ; - = reazione negativa; t - = reazione debolmente p o s i t i v a ; nd = non determinato. * T u t t i g l i a n t i c o r p i u s a t i danno reazione p o s i t i v a con t u b u l i n a d i c e r v e l l o d i pecora e t u b u l i n a d i f l a g e l l o d i spermatozoo d i r i c c i o d i mare.

La Tabe l la 1 mostra i r i s u l t a t i d i una s e r i e d i esperimenti . Mentre t u t t i g l i a n t i c o r p i u s a t i danno reazione p o s i t i v a con t u b u l i n a d i organismi supe r io r i ( c e r v e l l o d i pecora e f l a g e l l o d i spermatozoo d i r i c c i o d i mare), so lo a l cun i d i ess i cross-reagiscono con l a t u b u l i n a d i T. vag ina l is , H. muscarum e N. g ruber i . Quest i r i s u l t a t i dimostrano una eterogenei tà d e l l e t u b u l i n e de i Protozoi ne i c o n f r o n t i d i q u e l l e d i organismi supe r io r i . Poichè il sistema de i m ic ro tubu l i d i a lcun i Protozoi è notevolmente complesso e, da un punto d i v i s t a funzionale, è p o s s i b i l e r iconoscere t i p i d i v e r s i d i m ic ro tubu l i ( f l a g e l l a r i , pe l l i c o l a r i , as- s o s t i l a r i , m i t o t i c i , ecc. ) con l a t ecn i ca del l ' immunof l uorescenza i n d i r e t t a è s t a t a s t u d i a t a l ' i m n u n o r e a t t i v i t à dei m ic ro tubu l i d i L. t r o p i c a e T. vag ina l i s (Tabe l la 2 e 3 e F igu ra 1 ) . I r i s u l t a t i con ambedue i Protozoi mostrano anche i n questo caso una d iversa r e a t t i v i t à i n u n o l o g i c a de i d i f f e r e n t i m ic ro tubu l i . Ad esempio, i mic ro tubu l i f l a g e l l a r i d i T. vag ina l i s sono r i c o n o s c i u t i unicamente da uno de i se i monoclonali u s a t i (TU-O1 ), mentre q u e l l i a s s o s t i l a r i e m i t o t i c i r i spe t t i vamente da due e da t r e (Tabe l la 2 ) . Nel caso d i L. t rop ica , invece, due a n t i c o r p i monoclonali (YL 1 /2 e YL 1 /34) riconoscono i microtubul i f l a g e l l a r i , t u t t i reagiscono con q u e l l i p e l l i c o l a r i e so lo t r e (TU-01, TU-03 e TU-04) con q u e l l i m i t o t i c i (Tabe l la 3).

Tabe l la 2. - Immunof l uorescenza i n d i r e t t a de i microtubul i d i L e i shmani a t r o p i c a con a n t i c o r p i an t i - t ubu l i na .

Microtubul i A n t i co rp i MS TU-O1 TU-02 TU-03 TU-04 YL 1/2 YL 1/34

F lage l l a r i t - - - - t t

Pel l i c o l a r i

M i t o t i c i

Tabella 3. - Immunofluorescenza indiretta dei nicrotubuli d i -- Trichomonas vagina l is con anticorpi anti -tubulina. - ----p

Microtubuli Anticorpi MS TU-O1 TU-02 TU-03 TU-04- YL 1/2 YL 1/34

Flagel lari t + - - - - - - Assostilari t + + - - - -

- Mitotici + t t t - - - -

Figura 1 - Immunofluorescenza indiretta di T.vaginalis con un anticorpo mono- specifico anti-tubulina (a) e di ~ . t r o ~ i c a c o n l 'anticorpo monoclonale TU-03 (b). Ingrandimento: 800x.

Discussione

Questo lavoro mostra come la tubulina di alcuni Protozoi flagellati (T.va- - ginalis, H.muscarum e - L.tropica) e del1 'ameboflagel lato N.gruberi sia immunolo- gicamente eterogenea nei confronti di quel la del le ce1 luie superiori. Tale ete. rogeneità è abbastanza singolare se si considera che, fino a non molto tempo fa la tubulina era considerata una delle proteine cellulari più conservate filoge- neticamente (9). Più recentemente,però, si sono accumulate indicazioni che most; no come alcune delle tubuline dei microrganismi eucariotici possano essere differenti dalle analoghe proteine delle cellule superiori (10). Nel nostro caso, la dimostrazione dell'eterogeneità è stata ottenuta utilizzando anticorpi monoclonal i , in grado di riconoscere singoli determinanti antigenici del la molecola. La mancata reattività degli anticorpi con alcune delle tubuline esaminate potreJ. be essere dovuta sia all'assenza del determinante verso cui sono stati prodotti sia ad una sua diversa esposizione. Anche questa ultima possibilità è, in ogni caso, indice di una diversiti conformazional~e tra le tubuline che potrebbe, ever tuallente, essere alla base di una diversa sensibilità ai farmaci antimicrotubu, lari . Una differente sensibilità dei microtubul i di - T.vaginalis nei confronti dl inibitori specifici è stata recentemente dimostrata (11 ).

I nostri risultati indicano anche una eterogeneità immunologica delle tubu line appartenenti a strutture differenti di uno stesso Protozoo e sono in accor. do sia con la "multi-tubulin hypothesis" (12) sia con dati recenti ottenuti col

f l a g e l l a t o C r i t h i d i a f a s c i c u l a t a (13). Questa eterogenei tà non è i n a t t e s a i n quanto i mic ro tubu l i de i Protozoi sono organ izza t i i n s t r u t t u r e d i f f e r e n t i , a l - meno per quanto r i gua rda l a l o r o d i s t r i b u z i o n e i n t r a c e l l u l a r e e l e f unz ion i svo l - te. I n o l t r e è noto come il sistema genico che c o n t r o l l a l a s i n t e s i d e l l a t u b u l i n a s i a notevolmente complesso, potendosi avere, come ne l caso d i T.brucei, anche 13-17 geni per ciascuna d e l l e due subunità (14).

I n conclusione, ques t i d a t i dimostrano una eterogenei tà d e l l a t u b u l i n a dei Protozoi ne i c o n f r o n t i d i q u e l l a d e l l e c e l l u l e supe r io r i che può essere l a base per l 'azione s e l e t t i v a d i i n i b i t o r i s p e c i f i c i de l sistema de i m ic ro tubu l i de i Protozoi parassi ti.

I Ringraziamenti

S i r i n g r a z i a il Dr.J.Ki lmart in per g l i a n t i c o r p i monoclonali a n t i - t u b u l i n a d i l i e v i t o (YL 1/2 e YL 1/34). Lavoro esegui to con c o n t r i b u t i de l CNR, proget- t o f i n a l i z z a t o "Contro1 l o de l l e m a l a t t i e da in fez ione", e del M in i s te ro del l a Pubbl ica I s t r u z i o n e (60%).

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-

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Ann. Iit . Super. Sanità Voi. 22, N. 1 (1986). pp. 169.172

NEW TECHETOLOGIES AND CLASSICAL. PARASITOLOGY: THE USE OF MONOCLONAL ANTIBODIES T0 IDENTIFY PARASITES INSIDE THE VECTORS

(a) Dipartimento di Biologia Cellulare. Università degli Studi, Camerino, Macerata

(b) Istituto di Parassitologia, Università degli studi "La Sapienza", Roma

Sutornary. - The sporozoite antigens of Plasmodium have been intensively studied during these years. Their molecular structure has been described and their role in the host's immune response has began to be understood. The possibility to develop a sporozoite-based vaccine is currently investigated. In addition a radioimrmuioassay was evisaged to detect the circumsporozoite antigen inside the vector. The assay was compared in an experimental field trial wich the conven- tional technique of salivary glands dissection.

Riassunto. - Lo studio degli antigeni dello sporozoita di Plasmodium hanno compiuto negli ultimi anni progressi considerevoli. In particolare è stata descritta nei dettagli la struttura molecolare dell'antigene "circumsporozoitico" di P. falciparum e si sono cominciate ad ottenere significative indicazioni sul significato di tale antigene dal punto di vista della reattività imunolo- gica dell'ospite. E' in corso di valutazione la possibilità di sviluppo di vaccini basati su tali antigeni. Inoltre è stato messo a punto in test radioim- munologico che consente di individuare l'antigene circumsporozoitico nel corpo del vettore. Questo test è stato messo a confronto in uno studio sperimentale sul campo con la tecnica convenzionale della dissezione delle ghiandole salivari per evidenziare la presenza di sporozoiti all'interno del vettore.

The heterogeneity of antibodies produced in the immune response reduces the reliability of immunologic assay. Experimental immunization is still more of an art than a science and serologists have had to be satisfied with whatever quality and quantity of antiserum an immunized anima1 will provide. Even when operationally pure antigens are used for immunization, animals frequently make large amounts of antibody against minor contaminants. The affinity and quantity of the antibody often vary from anima1 to anima1 and from one bleeding to the next. Nevertheless, these problems have not prevented the affective use of antibodies in basic and applied research in biology and medicine. Immunologists have continued to seek methods of immunization that would produce large amounts of homogeneous antibodies and, as often happens in science, the solution grew out of a series of basic and completely unrelated experiments.

On August 1975 K6hler and Milstein published in Nature a paper reporting that cultured mouse myeloma cells could be fused to norma1 splenocytes from animals immunized with sheep red blood cells. The hybrid ce11 lines grew continuously in culture and they could be frozen, recovered and injected into the peritoneal cavity of syngeneic mice, where they grew and induced an ascites that contained large amounts of antibody (up to 15 mg of antibody per m1 of ascite). These findings exceeded even the wildest dreams of immunologists. Not only is it possible to genetate a homogeneous antibody. but the production of

that antibody is immortalized, and the only limitation on the amount of antibody available is the number of mice one is willing to give injections. In addition, impure antigens can be used, since the technique results in the identification and propagation of cloned ce11 lines. These lines produce a single antibody that reacts with the antigen and does not react with any contaminating material.

Basic researchers and clinica1 investigators recognized the enormous potential of monoclonal antibodies and began to generate such reagents. In some situations. where it might indeed be better to obtain large amounts of heterogeneous antiserum from a single bleeding, the introduction of hybridoma techno- logy is more of a fashion than a need. In many cases however it is an imperati- ve necessity and we will now give an example that refers to both basic and applied parasitology, and more precisely to the study of malaria parasites.

Malaria is still the most important parasitic disease affecting 200 to 400 million people. Malaria kills more than one rnillion people, mostly children, every year and disables many individuals in endemic areas. Any chance of success for whatever strategy for mosquito contro1 in endemic malaria1 areas depends on the accurate determination of the proportion of infected mosquitoes, as well as on the identification of the main vector species.

The sporozoite index 1 represents the proportion of mosquitoes bearing sporozoites in their salivary glands. Obviously this parameter is of paramount importance for the determination of the inoculation rates, & the number of infettive bites per man per night. Up to now, determination of S.I. has required laborious dissection and subjective microscope examination of salivary glands of individua1 mosquitoes. Let's think about what a difficult task it is in areas where the infection rate is below 1 infected Anopheles out of 1000. In addition, the morphology of sporozoites does not allow their species identification. Therefore, when for instance Plasmodium falcipamm and P. malariae and other plasmodia coexist, the identification of the parasite species infecting a mosquito is unachievable by simple microscopy.

Recently the group led by Ruth Nussenzweig at the New York University accomplished an important breackthrough in unveiling the secrets of the immunologic aspects of the host-parasite relationships in malaria (1). Monoclo- nal antibodies were obtained by fusing myeloma cells with splenocytes from mice bitten by irradiated, infected Anopheles. The summary of the results is that a single monoclonal antibody displayed al1 properties of polyclonal sera obtained from animals vaccinated with whole sporozoites or from patients suffering from malaria. This monoclonal identified a stage - and species - specific membrane antigen that covers the sporozoite surface and has been named circumsporozoite or CS protein. Cross-reactivity was never observed between che CS proteins of the main human malaria parasites,

Thanks to the availability of the relevant monoclonal antibody, the gene coding for the CS protein of P. falciparum has been cloned and the complete strutture of the protein has been elucidated (2,3). The rough centra1 half of the molecule consists of repeated subunits of 4 aminoacids (Asn-Ala-Asn-Pro). The presence of these repetitive subunits appears to be a common property of al1 the CS proteins. For instance in P. knaulesi they consist of 12 repetitions of 12 aminoacids. The recurrent subunits can explain the immunodominance of the CS proteins: in a study about the specificity of antibodies in immune sera from human and monkeys vaccinated with irradiated sporozoites it was shown that a single monoclonal antibody could inhibit 70-95% of the specific binding of these polyclonal sera to sporozoites extracts (4). Furthermore, every monoclonal antibody obtained thus far against sporozoites is directed against the CS protein. These findings are relevant to the development o£ vaccines against malaria using purified CS proteins. This molecule, with its surprising simplicity, appears to lend itself ideally to the chemical peptide synthesis as a means of production. This is still a developing story and we refrain to go deeper into this matter. We prefer rather to describe in detail what can be d c l t i i c d ai1 uscful by product of this line of research, namely the immediate

practical application of the antibody to detect sporozoites in mosquitoes. A simple, quick immunoassay has been developed that not only easily

detects but also identifies sporozoites in individua1 or pooled mosquitoes. Ilriefly, a microtiter plates is coated with a monoclonal antibody directed ngainst the CC protein. Then mosquitoes, or part of mosquitoes, are crushed to obtain an antigenic extract that is transferred into the previously coated plate. A 2- hour incubation allows the sporozoite antigens that may be present in the extract to bind to the antibody. At this point a second antibody, identica1 to the first but radioactively or enzyme labelled is added. Of course this antibody is bound, and the "sandwich" is completed, in the case, and only in the case. the antigen was bound by the first one (5). Incidentally it should Ibe noticed that this kind of two-site immunoradiometric assay (IRMA) is possi- hle thanks to the peculiar structure of the antigen, provided with single, recurrent epitopes. Otherwise, 2 different monoclonal antibodies, directed iigainst 2 different epitopes should have been used. Actually the ability of the CS protein to be bound in a 2-site IRMA is one of the ways in which the repetitive structure of the molecule was envisaged. Thus, the infected mosquitoes and ~ h e species of the infecting sporozoites can be readily detected. As to the sensitivity, in our hands it proved to be around 50 sporozoites/mosquito. Jiluting the mosquito in 150p 1 of fluid. This latter is not a trivial detail, since it means that up to 5 different monoclonals, directed against the CS proteins of 5 Plasmodium species can be assayed on the same mosquito.

Reviewing now the dissection of salivary glands in comparison with IRMA, it appears that the former is slow, subjective, unable to provide species identification, and requires freshly collected material; the latter is rapid, dlows to dea1 with large samples, allows the species identification, can be performed outside the collection areas, in a centra1 lab. A still open question concerne the relative reliability of the two methods. In a recent field trial in Gambia (6). it was found a good agreement between dissection and IRMA: this Latter gave an 8% infected mosquitoes and microscope gave a rough 5%. The difference was claimed to be the consequence of the ability of the monoclonal nntibody to detect sporozoite antigens in the oocyst, just before the release of sporozoites.

In a recent investigation (Esposito u., in preparation) we had the opportunity to test by IRMA about 4000 mosquitoes of the A. gambiae complex (L. r;ambie and A. arabiensis) collected inside human houses in malaria hypeqndemic areas of West Africa (Mali and Burkina-Faso), during the 1984 rainy season (June-October). This sampling activity was carried out in connection with inalariological sunreys by various colleagues including Y. Touré, G. Sabatinel- li, P. Rossi and M. Coluzzi. Part of the material was processed by the same colleagues for dissection and microscopica1 examination of. salivary glands.

To verify the quantitative contribution to the IRMA positivity given by sporozoite antigens present at the oocyst level, we performed two additional experimental procedures. First, we cut mosquitoes in abdomens and thoraxes and processed separatedly each body fraction by IRMA. Second, we processed by IRMA a sample of mosquitoes experimentally infected on a gametocyte-bearing patient. Mosquitoes vere killed at different times after the bite, so that the IRMA was performed on sub-samples where the sexual cycle of Plasmodium was at different stages.

The results of our trial can be summarized as follows: i) IRMA consisten- tly gave percentages of infected mosquitoes higher than those obtained by dissection; ii) the difference could not be explained entirely by the positivity in IRMA o£ mature oocysts, since the percentage of mosquitoes bearing sporozoite antigens only at the abdomen level did not compensate the difference between the results of IRMA and those of dissection; iii) the difference did iiot depend on a reactivity given by early stages of the sexual cycle of Plasmodium, since al1 the mosquitoes were negative for up to 10 days after the bite, when the positivity started appearing at the abdomen level.

An explanation for the. different outcomes o£ IRMA and dissection should

Ann lat. Supsr. Sonitd Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 173-178

EiOL>IFICAZIONI DELLE LARVE NEONATE DI TRICHINELLA SPIRALIS DURANTE LA MATURAZIONE

I:. Bruschi (a), M.P. Viola-Magni (a) & R.A. Binaghi (h)

Istituto di Patologia Generale dell'università, Policlinico Monteluce, Perugia; Centre de Physiologie et Immunologie Cellulaires, Hopital St. Antoine. Paris, France

IIiassunto. - Gli autori descrivono recenti osservazioni su modificazioni 1)iochimiche ed immunologiche che si instaurano nelle larve neonate di 'Trichinella spiralis durante la maturazione.

Summary (Modifications of Trichinella spiralis new-born larvae during maturation). - Authors describe some recent observations on the modifications of biochemical-immunological characteristics in new-born larvae o£ Trichinella spiralis during maturation.

Le larve new-born di Trichinella spiralis (NBL) rappresentano lo stadio contro il quale si innesca la risposta immunitaria dell'ospite, dalla riuscita della quale dipende la possibilità o meno di installazione del parassita (l).

Già da diversi anni è possibile ottenere in vitro le NBL grazie al metodo descritto da Demis e coll. (1). Seguendo la loro esperienza, tutti coloro che si sono occupati in questi anni di questo stadio della Trichinella spiralis hanno lavorato su NBL ottenute da larve adulte incubate per tutta la notte. senza tener conto di eventuali modificazioni che si potevano verificare durante le prime ore di vita delle larve; si pensava cioé di usare una popolazione omogenea di NBL contro cui testare in vitro gli antisieri e la risposta di cellule effettrici quali eosinofili, neutrofili, macrofagi.

Tuttavia era a tutti chiara la difficlotà di ottenere risultati estremamente ripetibili negli studi in vitro e le percentuali di mortalità delle NBL incubate con antisiero e cellule di varia provenienza, erano estremamente variabili.

Molto recentemente Jungery e coll. (2) hanno dimostrato la diversa composizione proteica della superficie di NBL di diverse età. Mediante un'analisi elettroforetica su gel di poliacrilamide questi autori hanno dimostrato che sulla superficie delle larve di età di 0.5 ore, 3 ore, 6 ore è presente una sola proteina, del peso molecolare di circa 64 KDa. Alla 1 8 ~ ora di vita compaiono altre tre proteine del peso molecolare rispettivamente di 58, 34 e 32 KDa; questo pattern proteico rimane invariato anche a 18.50 ore dalla nascita delle larve (Fig.1). Da questi risultati si può concludere che le NBL vanno incontro nelle prime ore di vita a modificazioni della loro superficie che potrebbero avere un significato nelle interrelazioni ospite-parassita per questo elminto.

Quasi contemporaneamente Binaghi ed i suoi collaboratori hanno osservato che se si impiegavano NBL isolate dopo solo due ore di incubazione delle larve adulte, in test di citotossicità cellulare anticorpo-mediata (ADCC) con cellule di essudato peritoneale di topo si avevano degli indici di mortalità di NBL

estremamente più alti e con risultati maggiormente ripetibili rispetto agli i esperimenti in cui si impiegavano NBL separate da larve adulte incubate per tutta la notte, quindi di diversa età.

Fig.1.- Analisi delle proteine della superficie di NBL di diversa età, mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilamide, in condizioni riducenti. Le ore di B, C, D, E si devono intendere rispettivamente come 3, 6, 18 e 18.5 ore di vita delle larve (ridisegnate da Jungery e coll., 1983).

Da questa osservazione sono stati compiuti alcuni esperimenti in vitro ed in vivo per verificare se esistesse una differenza di comportamento tra NBL di due ore e 20 ore di vita. Negli esperimenti in vitro è risultato che incubando cellule di essudato peritoneale di topi Low antibody Producer (LP) di Biozzi con NBL di due ore o di 20 ore, antisiero di topo e complemento si avevano risultati diversi a seconda dell'età delle larve; nel primo caso infatti dopo 24 ore di incubazione con le cellule si aveva una mortalità variabile tra il 50 ed il 100% mentre nel secondo caso questa era praticamente assente anche dopo 48 ore di incubazione. Alla luce di questi risultati sono stati compiuti quindi esperimenti in vivo. Sono state iniettate NBL di due e 20 ore di vita per via endovenosa a topi di vari ceppi e dopo 30 giorni gli animali sono stati uccisi per la valutazione del loro grado di infezione. Questo è stato valutato calcolando in percentuale il numero di larve muscolari raccolte rispetto alle NBL iniettate. Le NBL di 20 ore si sono rivelate molto più infettive di quelle di due ore con un grado di infezione variabile a seconda dei ceppi impiegati (3) (Tab.1).

Successivamente Gansmuller e coll. (4) hanno effettuato uno studio di microscopia elettronica sulle cellule aderenti alle larve di due ore e di 20 ore di vita, dopo due ore di Incubazione con cellule di essudato peritoneale di topo LP di Biozzi, normale, antisiero e complemento. I risultati hanno mostrato che pure impiegando una popolazione cellulare contenente 30-40% di linfociti, 40-50% di microfagi, 10% di monociti, 5-10% neutrofili e 1-3% di eosinofili, le cellule aderenti alle NBL di due ore risultavano esclusivamente degli eosinofili. Tali cellule si presentavano fortemente aderenti alle larve con la membrana cellulare che si uniformava alle pieghe presenti normalmente alla superficie delle larve; inoltre apparivano in corso di esocitosi e del

l l. - Infettiviti? delle NBL a diverse età.

# 11'1'0 % delle larve muscolari a 30 giorni d'infezione *

NBL 2 ore NBL 20 ore

i.' i ss l ii.i\lc i l '

: I '

1 8 , parentesi il numero degli animali testati. i relativa al numero di MBL iniettate e.v. (3).

8 j~eriale elettrondenso, di probabile origine eosinofilica era interposto tra l , cellule e le larve (Fig. 2).

Fig. 2. - Eosinofilo aderente ad una NBL di due ore di vita. x 17.500 (4).

Viceversa le cellule aderenti alle NBL di 20 ore erano esclusivamente macrofagi che pur presentando un'intensa attività di membrana non avevano segni di esocitosi (Fig. 3). Questi risultati sono stati ottenuti dopo 2 - 3 ore di incubazione con le cellule, quando non è ancora evidenziabile la mortalità delle larve. Se si prolungava l'incubazione le larve di due ore andavano incontro a morte entro 24 ore, mentre quelle di 20 ore non presentavano una mortalità rilevante neppure dopo 48 ore di incubazione con le cellule.

Un riassunto delle caratteristiche delle NBL di diversa età sulla base dei risultati ottenuti dal gruppo di Binaghi è illustrato in Fig. 4.

Molto recentemente Ortega-Pierres e coll. (5) hanno ottenuto un anticorpo monoclonale di classe IgG1, diretto contro una proteina presente sulla superficie delle NBL di peso molecolare pari a 64 KDa, vale a dire la proteina che è presente da sola sulle larve di due ore di vita. Questo anticorpo monoclonale non reagisce contro gli antigeni di superficie né delle larve muscolari, né di quelle adulte di T. spiralis; sulla base di test di immunofluorescenza e di aderenza con eosinofili infatti l'anticorpo monoclonale non ha dato reazioni crociate con larve muscolari. Questo ultimo dato ci può far ipotizzare che nel passaggio maturativo da NBL a larva muscolare la proteina di 64 KDa non sia più espressa sulla superficie del parassita; saremmo

Fig. 3. - Macrofagi aderenti ad una NBL di 20 ore di vita. x 5.000. (per gentile concessione di A. Anteunis)

quindi difronte ad un meccanismo di vera e propria variazione antigenica. Gli autori hanno dimostrato anche che incubando NBL di 3 ore di vita opsonizzate con questo anticorpo monoclonale. con eosinofili purificati (circa 95%) le cellule aderivano alle larve e ne provocavano una mortalità che tuttavia era di minore intensità e più lenta ad instaurarsi di quella che si aveva opsonizzando le larve con siero immune fresco. La mortalità mediata dall'anticorpo monoclonale aumentava se si aggiungeva al sistema siero fresco normale ma non venivano raggiunti mai i livelli di citotossicità ottenuti con il siero immune fresco; questo potrebbe significare che altri anticorpi, diretti contro altre proteine di superficie, sono necessari per avere il massimo effetto larvicida.

L A R V E LARVE 2 or. 2 0 or.

Cel lula aderente in ristami ADCC @ @'

0 % o

Eosinof i lo Mmcrofqo

I Inl.ttirita8 dopo iniezione ..v. 1 0 %

Fis. 4. - Caratteristiche delle NBL di diversa età.

Anche gli esperimenti in vivo con questo anticorpo monoclonale hanno dato dei risultati interessanti. Gli autori hanno iniettato per via endovenosa in topi normali BALB/c NBL incubate con anticorpi monoclonali; in questa maniera è stata ottenuta una riduzione del 50% rispetto a quella avuta iniettando NBL da sole ed una riduzione più marcata rispetto all'infezione ottenuta con iniezione di NBL incubate con un anticorpo monoclonale diretto contro le larve muscolari. Se da un lato è stata dimostrata l'efficacia di questo anticorpo monoclonale anti NBL, in vivo, bisogna tuttavia osservare che le percentuali d'infezione ottenute da questi autori iniettando NEL di 2 ore di vita sono molto più alte di quelle ottenute da Binaghi e coll.; questi, inoltre, hanno ottenuto iniettando NBL da sole delle percentuali di infezione addirittura inferiori a quelle trovate da Ortega-Pierres e coll. iniettando NBL incubate con anticorpo monoclonale diretto contro di esse.

In una recente rassegna sugli antigeni di superficie dei parassiti (6) gli autori, descrivendo il lavoro di Jungery e coll., ipotizzano che le NBL di poche ore di vita non posseggano il recettore per il Complemento che comparirebbe tardivamente; questo permetterebbe ai parassiti di essere inattaccabili dalle cellule dell'ospite per tutto il tempo necessario per arrivare ai muscoli e quindi essere anatomicamente sequestrate dai meccanismi di difesa immunitari. Secondo questa ipotesi le NBL di due ore dovrebbero risultare più resistenti in vivo di quelle di 20 ore in cui potrebbe essere già comparso il recettore del Complemento. Questa teoria è senza dubbio in contrasto con i risultati ottenuti da Binaghi e coll. secondo i quali sono le larve di due ore le meno infettive.

Quale che sia il momento di insorgenza di una resistenza da parte delle larve. resta il fatto che ancora non siamo in grado di stabilire se questo fenomeno abbia un significato nella vita naturale del parassita e che rilevanza abbia o se si tratti piuttosto di una conseguenza della coltura in vitro dei parassiti. Anche nella schistosomiasi da Schistosoma mansoni è stata descritta un'acquisizione da parte dello stadio polmonare della schistosomula di una resistenza da parte della tossicità dei macrofagi che invece sono capaci di determinare una mortalità delle schistosomule allo stato cutaneo (7).

I1 verificarsi di un fenomeno analogo in stadi di parassiti così diversi quali lo Schistosoma mansoni e la Trichinella spiralis ci fa propendere per l'ipotesi che si tratti di un processo naturale.

La modificazione delle larve durante la loro maturazione rappresenta comunque un modello estremamente interessante per lo studio dei meccanismi di evasione della risposta immune da parte dei parassiti e, per quanto riguarda la trichinellosi, potrebbe aiutare a comprendere meglio la modalità con cui l'ospite si difende da questo parassita. Dal punto di vista estremamente parassitologico sarà di notevole interesse valutare se durante la aturazione is hanno modificazioni della sintesi di proteine. DNA, RNA che potrebbero spiegare la differente composizione proteica delle NBL di diversa età.

BIBLIOGRAFIA

DENNTS, D.T., DESPOMMIER, D. & DAVIS, N. 1970. Infectivity of the newborn larva of Trichinella spiralis in the rat. J. Parasitol. 56: 974-977. JUNGERY, M.. CLARK, N.W.T. & PARKHOUSE, R.M. 1983. A major change in surface antigens during the maturation o£ newborn l a ~ a e of Trichinella spiralis. Mol. Biochem. Parasitol. 7: 101-109. BINAGHI, R.A., VENTURIELLO, S.M. & BRUSCHI, F. 1985. Increased infectivity and resistance to cytotoxicity during maturation of migrant Trichinella spiralis larvae. In: Trichinellosis VI. (in corso di stampa). GANSMOLLER, A., ANTEUNIS, A., VENTURIELLO, S.M., BRUSCHI, F. & BINAGHI. R.A. 1985. Nature of the cells involved in the "in vitro" immune cytotoxicity of migrant Trichinella spiralis larvae. Trichinellosis VI. (in corso di stampa).

5. ORTEGA-PIERRES, G., MACKENZIE. C.D. & PARKHOUSE, R.M.E. 1984. Protection against Trichinella spiralis induced by a monoclonal antibody that promotes killing of newborn larvae granulocytes. Parasite Inmiunology 6: 275-284. . - ~ .

6. PHILIPP, M. & RUMJANECK, F.D. 1984. Antigenic and dynamic properties of helminth surface structures. Mol. Biochem. Parasitol. 10: 245-268.

7. SHER, A.. JAMES, S.L., SIMPSON. A.J.G., LAZDINS. J.K. & MELTZER, M.S. 1982. Macrophages as effector cells of protective inmiunity in murine Schistosomiasis. 111. Loss of susceptibility to macrophage-mediated killing during maturation of S. mansoni schistosomula from the skin to the lung stage. J. Imunol. 128: 1876-1879.

COMUNICAZIONI

AN In Super. Snid Vol. 22. N. 1 (1986). pp. 181-184

PROGRAMMA 01 LOTTA ANTIMALARICA A.OUAGA0OUGOU (BURKINA FASO) - LIVELLI DI IRASMISSIONE DELLA MALARIA: DATI ENTOMOLOGICI

P. Rossi. L. Mancini. A. Belli e G. Sabatinelli

Ministero Affari Esteri. Dipartimento per la Cooperazione allo sviluppo - Istituto di Parassitologia dell'Univarsita degli studi di Roma "La Sapienza"

Riassunto - Vengono riportati i risultati delle attività di monitoraggio entomologico condotte nell'ambito della prima fase del Programma di Lotta alla Malaria nella città di Ouagadougou (Burkina Faso).

Summary - (Malaria Control programme in Ouagadougou (Burkina Faso) - Levels of malaria tntnsmissim: entomological data. ) - Results from the entomological survey csrried out in the first phase of the Malaria Control Programme in the city of Ouagadougou are reported.

Introduzione

Nell'ambito della prima fase del programna di lotta alla malaria nella cit- t& di Ouagadougou è stata eseguita una cartografia dei focolai larvali di Ano- - pheles gambiae s.1. su tutto il territorio urbano ed è stata condotta un'inchiesta entomologica longitudinale con l'obbiettivo di determinare i livelli di trasmissione della malaria in zona urbana e di compararli a quelli delle zone rurali limitrofe. Tale studio è stato completato da un'indagine parassitologica i cui risultati vengono riportati da Sabatinelli et al. (1).

Ouagadougou, capitale del Burkina ~aso(ex1to Volta), è situata in una zona di savana sudaniana nel cuore dellVAfrica Occidentale, ed è caratterizzata da un regime di precipitazioni annuo di circa 860 mm (media 1961 - 19701, dia- tribuito in 70 giorni di piogge, da metà giugno a met8 settembre. Nel 1984 la stagione delle piogge è stata piuttosto anomala, essendo iniziata in marzo e terminata in novembre, con un totale di soli 550 mm.Lacittà, che si estende su un diametro di circa 12 km, è costituita per meno del 40% da quartieri lottizzati, dotati di infrastrutture viarie, idriche, fbgnarie ed elettriche, e per il restante 60% da quartieri non lottizzati, sorti spontaneamente negli ultimi anni a seguito di una forte immigrazione di masse rurali. Nella zona settentrionale della città B presente un grande bacino idrico, di cui solo un terzo è bonifica- to. Dati demografici ed etnici sono riportati da Sabatinelli et al. (1).

Materiali e metodi

I1 monitoraggio delle alate è stato eseguito da marzo a novembre attraverso catture diurne al piretro (CPP), secondo gli standard O.M.S. (21, con frequenza mensile in stagione secca e quindicinale in stagione delle piogge in città. Co- no stati scelti 5 quartieri della città rappresentativi di situazioni ecologiche differenti (Caint Camille, Nongremassm, Kologh Naba, Gounghin Nord e Saint Leon) e 3 villaggi situati nei dintorni di Ouagadougou (Pabre, Zaghtouli e Koubri). In ognuna di queste zone sono state stabilite 5 stazioni di cattura fisse, in case

abitate corrispondenti alla tipologia locale più comune. A causa di difficoltà logistiche le catture hanno avuto inizio in marzo nei quartieri e solo in luglio nei villaggi. Le femmine di Anopheles dopo identificazione, sono state contate e dissezionate per la ricerca degli sporozoiti. I1 coprifuoco tuttora in vigore non ci ha permesso di effettuare le catture notturne su uomo. I1 Tasso d'Inocu- lazione Entomologico T I E è stato quindi calcolato come numero di femnine Fed/abitante moltiplicato per l'indice sporozoitico.

Risultati

I1 censimento dei focolai larvali di A. gambiae s.l., condotto durante tut- to l'anno, ci ha permesso di tracciare la Grtografia di questi ultimi e di pre- cisarne la natura, l'estensione e la durata. S6no stati recensiti su tutta la superficie urbana oltre 200 focolai temporanei, cioè presenti solo durante la stagione delle piogge, In particolare sono state individuate ampie zone di acque stagnanti, comprendenti numerosissime piccole raccolte d'acqua, come ad esempio il canale S. Camille. I bacini idrici non bonificati presenti nella parte settentrionale della città sono risultati importanti aree di focolai larvali semipermanenti. Le cave di argilla utilizzate per la costruzione di mattoni, sparse su tutta la fascia periferica urbana, costituiscono altresi' un ambiente estremamente favorevole allo sviluppo delle larve di - A. gambiae s.l., soprattutto in stagione secca.

A. 9ambiae s.1. è risultato il solo vettore di malaria in zona urbana, mentre inzona rurale anche A. funestus è risultato positivo alla ricerca degli sporozoiti. In totale, attraverso le CPP sono state catturate 6.678 femmine di A. gambiae s.l., delle quali 4.272 dissezionate per la ricerca degli sporozoitiF L'analisi degli indici entomologici elaborati sulla base dei dati raccolti da marzo a novembre 1984 mostra una notevole eterogeneità nei livelli di trasmia- sione della malaria fra i quartieri della città. Per quello che riguarda la den- sità (espressa come numero medio di femmine di A. gambiae s.l./camera) ' valori minimi sono stati rilevati nei quartieri lottizzti di Gounghin Nord e Ssint Leon (media del periodo considerato, rispettivamente 1.1 e 0.9). I valori più e- levati (15.3) sono stati registrati nei due quartieri di Kologh Naba e Nongre- massm, posti ai margini dei bacini idrici. E' da notare che in questi due quartieri le densità sono risultate elevate già a partire dai mesi di aprile e maggio (17.2 in aprile a Kologh Naba e 9.6 in maggio a Nongremassm), ed hanno rag- giunto i massimi valori stagionali rispettivamente in giugno con 38.2 ed in luglio con 52.0 femmine/camera. Nel quartiere di S. Camille sono stati registrati valori intermedi (7.8), con un rapido aumento da maggio a giugno (da 1.6 a 14.4). I valori medi di densità riscontrati nei villaggi sono comparabili a quelli di alcuni dei quartieri campione (44.4 a Pabre e 20.5 a Zaghtouli), ad eccezione di Koubri dove la densith media raggiunge 114.0 (massimo registrato 269.7 in a- gosto).

Per quanto riguarda gli indici sporozoitici le prime positività sono state osservate in maggio nel quartiere di Kologh Naba (1.5%). L'andamento ai è poi mostrato discontinuo durante la stagione delle piogge, con valori oscillanti attorno alltl%. Sono stati registrati due picchi, uno nel mese di agosto (4.2% a S. Camille) ed uno in ottobre, quest'ultimo corrispondente ai valori massimi registrati nella stagione (3.6% a S. Camille, 5.6% a Nongremassm e 11.5% a Kologh Naba). Nessuna positività E stata riscontrata nei quartieri di Gounghin Nord e S. Leon durante tutto il periodo preso in esame.

I1 Tasso d'Inoculazione Entomologi~o Cumulativo, ossia il numero di punture infettanti ricevute da ogni abitante durante il periodo in esame (marzo - novembre), è zero per i due quartieri centrali, mentre risulta di 5 punture infettanti per abitante a Nongremaaam ed a S. Camille e di 15 a Kologh Naba. Nei villaggi tale indice, calcolato a partire da luglio, & risultato di 418 a Koubri (pari a più di 3 punture infettanti/uomo/notte), 91 a Pabre e 74 a Zaghtouli.

Discussione

L'analisi dei dati raccolti mostra che A. gambiae s.1. è il solo vettore della malaria in città. I livelli globali di%asmissione risultano in zona urbana inferiori rispetto alle zone rurali limitrofe. Cio' sembra dovuto soprattutto ai più alti indici sporozoitici osservati nei villaggi. I valori estremamente elevati di densità/camera di femmine di A. gambiae s.1; rilevati nel villaggio di Koubri determinano il T.I.E.C. eccezionalmente alto che vi è stato calcolato.

All'interno della città la situazione riguardante i livelli di trasmissione della malaria è estremamente eterogenea. Si possononfatti distinguere quartieri nei quali essa sembra assente (Gounghin Nord e S. Leon) e quartieri nei quali la trasmissione della malaria presenta livelli piuttosto elevati. Nei quartieri più colpiti notiamo ulteriori differenze riguardanti la durata della trasmissione che raggiunge almeno sei mesi a Kologh Naba e Nongremassm, mentre è di circa tre mesi a S. Camille. Queste eterogeneità epidemiologiche sono da mettere in relazione alla presenza nelle zone oggetto d'indagine di differenti tipi di focolai larvali di A. gambiae s.1.: focolai temporanei e di piccole dimensioni nei quartieri centrali e lottizzati, aree estese di focolai larvali semipermanenti adia- centi i quartieri situati ai margini dei bacini idrici, ed estese zone di focolai temporanei nei quartieri non lottizzati come S. Camille. In città, dunque, la malaria sembra avere una distribuzione di tipo "focale", caratterizzata da livelli di trasmissione diversi osservati in zone relativamente vicine una all'altra (es. Gounghin Nord e Kologh Naba), che indica una scarsa mobilità del vettore in zona urbana. Questo aspetto della biologia di A. gambiae s.1. è stato oggetto di uno studio specifico, i cui risultati vengono presentati da Sabatinelli et al. (4). La conferma, infine, delle eterogeneità dei livelli di trasmissione della malaria evidenziate dalla presente inchiesta entomologica, è stata fornita da un'inchiesta protozoologica condotta in agosto - settembre nelle stesse zone prese da noi in esame (1).

BIBLIOGRAFIA

SABATINELLI, G., BOSMAN, A., LAMIZANA, L., ROSSI, P. 1985. Programma di lotta antimalarica a Ouagadougou (Burkina Faso). Livelli di trasmissione della malaria: dati protozoologici. Annali 1st. San. stesso vol. -- P

MOLINEAUX, L. e GRAMICCIA, G. 1980. Le projet Garki. Organisation mondiale de la Santé, Génève. JEPSON, W.F., MOUTTA, A. L COURTOIS, C. 1947. The malaria problem in Mauri- tius: the bionomics of Mauritius anophelines. Bull. ent. Res. 38: 177. -- SABATINELLI, G., ROSSI, P., BELLI, A. 1985. Programma di m a antimalarica a Ouagadougou (Burkina Faso). Dispersione di Anopheles gambiae s.1. in zona urbana. Annali 1st. Cup. San. stesso vol.

Ann I& Supr. Sanilà Vol. 22, N. 1 (1986h pp. 185-188

PROGRAMMA DI LOTTA ANTIMALARICA A OUAGADOUGOU (BURKINA FASO) - LIVELLI DI TRASMISSIONE DELLA MALARIA: DATI PROTDZOOLOGICI

G. Sabatinelli (a), A. Boaman (a), L. Lamizana (b) & P. Rosai (a)

(a) Ministero Affari Esteri, Dipartimento per la Cooperazione allo Sviluppo - Istituto di Parassitologia dellrUniversità di Roma "La Sapienza"

(b) Ministère de la Sante Publique du Burkina Faso, Ouagadougou

Riassunto. - Vengono presentati i risultati di una indagine malariologica condotta su gruppi di bambini tra O e 5 anni, nella città di Ouagadougou e zone rurali limitrofe, durante la stagione delle piogge 1984.

Summary (Malaria contro1 programme in Ouagadougou (8urkina Faso) - Levela of malaria transmission: protozoological data). - Results of a malariological survey carried out on a group of children 0-5 years old in the city of Ouagadougou and neighbouring rural zones during the 1984 rainy seaaon are reported.

Introduzione

L'inchiesta protozoologica, oggetto della presente nota, è stata condotta assieme ad uno studio entomologico longitudinale (1) al fine di raccogliere dati di base per un programna di lotta antimalarica nella città di Ouagadougou. Scopo del lavoro è stato quello di determinare la prevalenza dell'infeziona in differenti zone della città durante il periodo di massima trasmissione, di confron- tare la situazione malariologica tra zona urbana e zona rurale limitrofa e verificare le correlazioni tra gli indici protozoologici e gli indici entomologici osservati nelle stesse zone. La città di Ouagadougou, capitale del Burkina Faso (ex Alto-Volta), conta una popolazione di circa 407.000 abitanti dei quali solo il 33 % vive in aree lot- tizzate, dotate di infrastrutture. I1 tasso bruto di mortalità (stima 1976) è del 22 % O , quello di natalità del 46 %O ed il 50 % della popolazione ha meno di 20 anni. I1 tasso di accrescimento a Ouagadougou è del 10 % annuo anche a causa della forte immigrazione urbana. Nel dipartimento di Ouagadougou l'etnia prevalente è quella Mossi (40 %). Considerando tutta la popolazione del Burkina Faso le percentuali delle ernoglobinopatie AS ed AC sono rispettivamente 11.26 L e 18.74 % (2). Dati sulla climatologia e geografia della zona di studio sono forniti da Rossi et al. (l ).

Materiali e Metodi

L'inchiesta protozoologica è stata effettuata dal 27 agosto al 13 settembre 1984, su 2.117 soggetti di età compresa tra O e 5 anni residenti negli stessi quartieri (Kologh Naba, Nongremaasm, St.Camille, Gounghin Nord e St.Leon) e villaggi (Zaghtouli, Pabrè e Koubri) oggetto dello studio entomologico longitudinale (1). E+ stato inoltre preso in considerazione il quartiere Tanghin.

Durante l'inchiesta sono stati utilizzati questionari per raccogliere, per ciascun bambino, dati, oltre che sull'identità personale, sulla mobilità, eventuale chemioprofilassi e chemioterapia eseguita, utilizzazione di zanzariere ed insetticidi, durante i due mesi di luglio ed agosto che hanno preceduto l'inchiesta. Per ogni soggetto è stata effettuata goccia spessa e striscio secondo gli atan- dards O.M.S. e l'esame parassitologico è stato effettuato su 100 campi di goccia spessa a 1000 X. L'indice di densità parassitaria (IOP) e l'indice di densità parassitaria positiva (IDPP) sono stati calcolati secondo la metodologia adotta- ta nel progetto Garki (3). I1 gruppo di età 0-5, ritenuto particolarmente utile ai fini della presente inchiesta per la sua bassa mobilità, è stato ulteriormente analizzato in base ai sottogruppi 0-11 mesi, 12-23 mesi e 2-5 anni.

Risultati

Su 2.117 soggetti esaminati l'indice plasmodico totale (IP tot.) è risulta- to del 29.4 %. L'IP per le differenti specie ha dato i seguenti valori: Plasmo- dium falci arum 29 %, P.malariae 1.37 %, P.ovale 0.5 %. L'indice gametocitico -1 7.5 18 e P.falciparum è presente nel 98.6 % delle infezioni. L'IP aumenta progressivamente con l'età mentre per 1'IG si osserva un aumento significativo tra le classi di età 0-11 e 12-23 mesi. L'esame globale dei bambini tra O e 5 anni nei 6 quartieri campione di Ouagadou- gou dà un IP tot. pari al 16 % mentre in zona rurale, come media dei tre villaggi, 1'IP tot. raggiunge il 62%. Tale differenza è altamente significativa con una probabilità inferiore all'uno per mille. Tra i tre villaggi sono state riscontrate notevoli differenze nella prevalenza della malaria. I valori più alti delltIP sono stati osservati nei villaggi di Koubri (87.9 %) e di Pabrè (74.6 %). E' da notare che nel villaggio di Zaghtouli, ove è stato rilevato un IP più basso (50.9 %),viene praticata una estesa copertura chemioprofilattica che raggiunge 1'81.5 %. Anche in città sono state rilevate notevoli differenze di prevalenza tra idiver- si quartieri campione. I valori più elevati delllIP tot. sono stati osservatinei quartieri di Nongremassm (26.4 %), Tanghin (21.8 % l , Kologh Naba (20.3 %) e Ct. Camille (15.6 %). I valori delllIP tot. sono significativamente più bassi aGoun- ghin Nord (9.5 %) ed a St.Leon (3 %). Differenze significative negli indici protozoologici sono emerse anche sudistan- ze assai brevi tra 3 gruppi di bambini abitanti nel quartiere di Kologh Naba in tre zone contigue poste a distanze crescenti (100-350 m, 400-600 m, 800-1050 m) dal margine di un bacino idrico ove sono localizzati i focolai larvalidi Anophe- les gambiae s.1. Questi dati mostrano che 1'IP tot. e 1'IDP diminuiscono in maniera significativa in funzione dell'allontanamento dai focolai larvali, mentre 1'IOPP varia in maniera inversa. Si è anche proceduto ad una analisi della correlazione tra gli indici plasmodici e gli indici entomologici relativi alla prima metà del mese di agosto (1). La correlazione tra 1'IP tot. ed il tasso di inoculazione entomologico (TIE) è significativa (P(.05) sia che ai consideri il campione globale 0-5 anni, sia trat- tando separatamente le diverse classi di età. Questa correlazione è molto più alta nella classe di età 0-11 mesi (P(.01) e decresce progressivamente nelle classi 12-23 mesi e 2-5 anni (P(.05). L'IOP di P.falciparum è risultato correla- to significativamente con le densità per camera di femmine di Anopheles gambiae s.1. (P<.05) ed ancor più con l'indice sporozoitico (P(.01).

Discussione

L'analisi dei risultati mette in evidenza notevoli differenze della prevalenza della malaria nelle zone studiate. La più alta prevalenza nella zona rurale rispetto alla città, sembra essere dovuta essenzialmente agli alti tassi di

I iioculazione entomologica (1 ) . I 'influenza della chemioprofilassi è evidente nel villaggio di Zaghtouli che,pur iivendo un TIE superiore a quello di Pabrè, con una copertura chemioprofilattica che raggiunge 1'81.5 %, presenta un IG ed un IP nettamente inferiore (P(C.001). Ira i 6 quartieri campione della città di Ouagadougou si sono messe in evidenza rone a bassa ed alta prevalenza della malaria. Queste differenze sono in stretta relazione con i differenti tassi di inoculazione entomologica rilevati negli !]tessi quartieri, livelli influenzati in maniera determinante dal numero, esten- tilone e persiatenza dei focolai larvali di A.gambiae s.1.(1). Infatti i più alti indici protozoologici (15.6-26.4 %) sono stati rilevati nei quartieri Kologh Na- ba, Tanghin, Nongremassm e St.Camille nei quali lo studio entomologico (1) ha messo in evidenza alti tassi di inoculazione entomologica (5-15 punture infettan- I l/uomo per il periodo marzo-novembre). Invece nei quartieri lottizzati del centro città, St.Leon e Gounghin Nord, ove non sono state riscontrate positività per sporozoiti, sono stati rilevati gli indici plasmodici più bassi (3-9.5 %). l'analisi dei 3 sottocampioni di Kologh Naba, mette in evidenza il carattere fo- rale della trasmissione malarica a Ouagadougou, probabilmente dovuto alla scarsa dispersione di A.gambiae s.1. osservata nello stesso quartiere (4). Le variazioni degli indici parassitologici tra le 3 zone nel quartiere sembrano infatti dovute all'allontanamento dai focolai larvali e quindi ai differenti gradi di esposizione cui sono sottoposti i gruppi di bambini esaminati. Differenze su distanze molto brevi sembrano peraltro una caratteristica dell'area urbana in quan- to analisi statistiche compiute in sottocampioni dei villaggi non hanno mostrato differenze significative. La stretta relazione tra gli indici entomologici di trasmissione e la prevalenza della malaria negli stessi quartieri e villaggi, è stata messa in evidenza da un coefficiente di correlazione significativo soprattutto nella classe di età 0-11 mesi e cib conferma l'importanza dello studio della prevalenza della malaria in questa classe di età per valutare il rischio di infezione plasmodiale in una determinata zona. La situazione epidemiologica osservata non è risultata essere stata influenzata in maniera significativa dalla mobilità di una frazione della popolazione esaminata.

BIBLIOGRAFIA

ROSSI, P., MANCINI, L., BELLI, A. & SABATINELLI, G. 1985. Programma di lotta antimalarica nella città di Ouagadougou (Burkina Faso) - Livelli di trasmissione della malaria: dati entomologici. -- Annali 1st. Sup. p San. stesso voL BROUSSAL, G., NACOULMA, O. & SAWADOGO, A. 1982. Hemoglobinoses et Drepano- cytose en Haute-Volta. Presses Africaines, Ouagadougou. MOLINEAUX, L. & GRAMICCIA, G. 1980. Le projet Garki. Organisation mondiale de la Santé, Génève. SABATINELLI, G., ROSSI, P. & BELLI, A. 1985. Programma di lotta antimelari- ca a Ouagadougou (Burkina Faso) - Dispersione di Anopheles gambiae s.1. in zona urbana. Annali 1st. a - San. stesso vol.

Ann In Supa. SoniY Vol. 22, N. 1 (1986). pp. 189-192

PROGRAMMA D I LOTTA ANTIMALARICA A OUAGADOUGOU (BURKINA FASO):

IL COMPLESSO ANOPHELES GAMBIAE NELLA CITTA' D I OUAGADOUGOU E VILLAGGI LIMITROFI

I s t i t u t o d i Parassitologia, Universi tà d i Roma "La Sapienza" e Ministero degl i A f f a r i Ester i : Dipartimento Cooperazione a l l o Sviluppo

Riassunto. - Vengono descr i t te l a distr ibuzione e i polimorf ismi da inversioni d i An.arabiensis e Anopheles gambiae S.S. nel l a c i t t à d i Ouagadougou (Burkina Faso) e i n quattro v i l l a g g i l i m i t r o f i .

Summary. - The d i s t r i bu t i on and inversion polymorphi sms o f Anopheles arabiensi s and An.gambiae S.S. are descri bed i n samples from Ouagadougou (Burkina Faso) and from four v i l l ages i n the neighbourhood o f the town.

Introduzione

Nel1 'ambito del programma d i l o t t a contro l a malaria n e l l a c i t t à d i Ouagadougou (Burkina Faso-ex A l to Volta) sono s ta te e f fe t tua te cat ture d i a la te d i Anopheles gambiae s.1. i n d ivers i qua r t i e r i de l l a c i t t à e i n quattro v i l l a g g i d i s t a n t i non p i o d i 35 km da l l a c i t t à stessa. Parte d i questo materiale (femmine semigravide) P stato u t i l i z z a t o per osservazioni citotassonomiche oggetto d e l l a presente nota.

Come P noto l'esame dei cromosomi p o l i t e n i c i de l l e c e l l u l e n u t r i c i ovariche d i femnine semigravide permette l ' ident i f icaz ione precisa del l e specie c r i p t i che del complesso gambiae attraverso l 'osservazione d i inversioni paracentriche specie-specif iche f i ssa te a l l o s ta to omozigote sui cromosomi sessuali. G l i s tessi preparati consentono l 'osservazione d i pol imorf ismi cromosomici particolarmente comuni i n queste specie (1 ) . Materiale e Metodi

L ' a t t i v i t à d i campionamento P s ta ta condotta prevalentemente durante l a stagione de l l e piogge 1984. Le cat ture sono s ta te e f fe t tua te a l l ' i n te rno de l l e ab i taz ion i mediante spruzzamento d i p i r e t r o ne l l e prime ore del pomeriggio. Le zanzare sono s ta te f i s sa te i n loco i n Carnoy etanolo-acetico e spedite a Roma dove sono s ta te esaminate citologicamente. I n alcune stazioni d i cat tura ( i qua r t i e r i d i Kologh Naba, Tanghin, St.Camille. St.L&on e i v i l l a g g i d i Nioko I 1 e Pabr€) e stata e f fe t tua ta una sola cat tura nel mese d i agosto mentre ne l l e a l t r e (quart iere Nongremassm e v i l l a g g i Zagtouli e Koubri) sono s ta te p o s s i b i l i cat ture con un r i tmo mensile, fornwdo cosl da t i s u f f i c i e n t i per un prel iminare studio longitudinale. Lavoro eseguito ncll'aibito del c o n t r a t t o C.E.E. TSD.016. I (TT) .

R i s u l t a t i e Discussione

Nel le l o c a l i t à i n esame sono s ta te i d e n t i f j c a t e due de l l e sei specie del complesso: An.arabiensis e An.gambiae S.S.. Nei campioni del mese d i agosto, centro de l l a stagione de l l e piogge, l a frequenza percentuale d i gambiae S.S. 6 o s c i l l a t a i n maniera non s ign i f i ca t i va intorno a l 50% nei v i l l a g g i d i Nioko I 1 e Zagtouli, mentre è r i s u l t a t a signif icativamente maggiore nei v i l l a g g i ,d i Pabre (68%) e i n pa r t i co la r modo d i Koubri (88%). Esaminando i n de t tag l io i cinque qua r t i e r i d i Ouagadougou (che considerati i n t o t o hanno mostrato una par i frequenza de l l e due specie). s i è potuta osservare una notevole v a r i a b i l i t à del l e frequenze r e l a t i v e de l l e due specie: nel quart iere nord- occidentale d i Kologh Naba l a frequenza d i gambiae S.S. era del 77% mentre a Tanghin, quart iere s i tua to poco distante da Kologh Naba ma a l d i l à del "barrage" e carat ter izzato da l l a presenza d i p iccole mandrie d i bovini, l a frequenza d i gambiae S.S. scende a l 57%. Anche g l i a l t r i t r e qua r t i e r i hanno mostrato f o r t i osc i l l az ion i del l e frequenze r e l a t i v e del l e due specie: 27% d i gambiae s.s a St.Cami l le, 43% a Nongremassm e i n f i n e 63% a St.L@on-Samandin. Le dif ferenze fortementemente s i gn i f i ca t i ve ne l l e frequenze r e l a t i v e del l e due specie osservate t r a v i l l a g g i e t r a qua r t i e r i d e l l a c i t t à i n campioni temporalmente omogenei non sono facilmente corre1 abi l i con ovvie di f ferenze ambientali; va comunque det to che osc i l l az ion i apparentemente stocastiche ne l l e prevalenze r e l a t i v e d i arabiensis e gambiae s.s sono s ta te osservate anche i n p roge t t i d i r i ce rca i n a l t r e zone d e l l 'A f r i ca occidentale (2). spesso i n ambiti d i tempo e d i spazio anche minori d i q u e l l i da noi esaminati.

Come s i 6 accennato, per alcune stazioni d i ca t tu ra è s ta to poss ib i le ef fet tuare raccol te mensil i con i seguenti r i s u l t a t i : nel v i l l agg io d i Zagtouli (a c i r ca 10 km da Ouagadougou) l a frequenza r e l a t i v a de l l e due specie non s i discosta i n cinque cat ture (da giugno a ot tobre) signif icativamente dal 50%; nel v i l l a g g i o d i Koubri (a c i r c a 35 km da Ouagadougou) s i nota invece un mode1 l o d i d istr ibuzione alquanto di f ferente, i n f a t t i l a frequenza d i An.arabiensis e signif icativamente p i ù elevata ( i n media c i r ca il 30%) nei due campioni c a t t u r a t i rispettivamente a l 1 ' i n i z i o ( l u g l i o ) e a l l a f i n e (ot tobre) de l l a stagione de l l e piogge, mentre nei mesi cen t ra l i de l l a stagione umida essa 6 notevolmente i n f e r i o r e ( i n media c i r ca il 10%). Nel la cerchia de l l a c i t t à , il quar t iere set tent r ionale d i Nongremassm ha invece mostrato una prevalenza r e l a t i v a de l l e due specie molto v ic ina a l l a p a r i t à per t u t t o il periodo d i campionamento (apr i le-ot tobre) , con deviazioni generalmente non s ign i f i ca t i ve .

An.arabiensis è r i s u l t a t o pol imorf ico per t r e sistemi d i inversione: 2Ra (con frequenze medie dell 'ordinamento a generalmente i n f e r i o r i a l 3021, 2Rb (con frequenze d e l l 'ordinamento bc o s c i l l a n t i in torno a l 25%) e i n f i n e 3Ra (con frequenze del l 'ordinamento a ampiamente o s c i l l a n t i in torno a l 50%).

Nel le l o c a l i t à i n esame An.gambiae S.S. mostra un interessante fenomeno g ià r i scon t ra to nel l e reg ion i centro-settentr ional i del confinante Mali : l a coesistenza a l l ' i n t e r n o de l l a specie d i diverse popolazioni quasi completamente i so la te riproduttivamente, ciascuna del l e qual i carat ter izzata da d i f f e r e n t i polimorfismi per invers ion i (3). I n par t ico lare i n Ouagadougou e d in to rn i @ s ta to poss ib i le mettere i n evidenza due d i queste popolazioni o forme cromosomiche: Mopti e Savanna. La prima è carat ter izzata dagl i ordinamenti 2Rbc e 2Ru e l a seconda dal1 'ordinamento 2Rb; sono i n o l t r e presenti c a r i o t i p i denominati provvisoriamente " i b r i d i " i n quanto non a t t r i bui b i li ad alcuna de l l e

predet te forme essendo il probab i le r i s u l t a t o d i i n c r o c i t r a d i esse o d i i n c r o c i d i una d e l l e due forme con i n d i v i d u i i b r i d i p o r t a t o r i d i r icombinazioni t r a g l i ordinamenti c a r a t t e r i s t i c i d i ciascuna forma. La d i s t r i b u z i o n e d i t a l i forme cromosomiche n e l l a c i t t à d i Ouagadougou e ne i v i l l a g g i d i Pabré, Nioko I 1 e Koubri 6 essenzialmente s imi le : o l t r e 1'85% (747/848) d i gambiae S.S. 6 c o s t i t u i t o d a l l a forma Mopti, c i r c a il 10% 6 c l a s s i f i c a b i l e come forma Savanna mentre l a pa r te rimanente è c o s t i t u i t a da " i b r i d i " . Unica eccezione a questo modello generale 6 il v i l l a g g i o d i Zagtoul i , ne l quale il campione d i femnine d i gambiae S.S. è c o s t i t u i t o per i 1 75% (111/147) d a l l a forma Mopti, mentre c i r c a il 20% 6 a t t r i b u i b i l e a l l a forma Savanna. Va nota to che Zagtou l i 6 l 'un ica t r a l e s taz ion i d i c a t t u r a prese i n esame p r i v a d i r i s a i e n e l l e immediate vicinanze; questo ben s i accorda con l a re laz ione g i à mostrata i n Mal i t r a prevalenza d e l l a forma Mopti e presenza d i r i s a i e o comunque r a c c o l t e d i acqua permanente. La d i s t r i buz ione d e l l e due forme d i gambiae S.S. ne i q u a r t i e r i d i Ouagadougou presenta qualche punto d i r imarchevole in teresse: s i 6 i n f a t t i no ta ta una notevole prevalenza d e l l a forma Mopti ne i q u a r t i e r i d i Kologh Naba, Tanghin e Nongremassm, i p i ù v i c i n i a l l a zona dei "barrages" e qu ind i i p i ù d ipendent i da i f o c o l a i d i acqua permanente a i q u a l i sembra par t ico larmente l ega ta l a forma Mopti, mentre nel qua r t i e re d i St.L&on, s i t u a t o a l cent ro d e l l a c i t t à e d i s t a n t e c i r c a 3 km, l a forma cromosomica Savanna preva le nettamente ( c i r c a 68%) s u l l a forma Mopti ( c i r c a 30%). Una p o s s i b i l e spiegazione d i questa d i f fe renza, fortemente s i g n i f i c a t i v a , potrebbe r i s i e d e r e p r o p r i o n e l l a d is tanza d i St.Léon dai "barrages" e quindi dai f o c o l a i l a r v a l i con acqua permanente e d a l l a dipendenza del qua r t i e re stesso da f o c o l a i l a r v a l i d i t i p o temporaneo, t ipicamente fo rmat i dal76 piogge. A questo t i p o d i s i tuaz ione sembrerebbe par t ico larmente legata l a forma Savanna (3). Va i n o l t r e considerato che, come il l u s t r a t o a l t r o v e i n questo volume (41, l a d ispers ione d i gambiae s.1. i n questa s i tuaz ione urbana, 6 estremamente r i d o t t a , per c u i l e femnine appartenenti a l l a forma Mopti , prodot te essenzialmente da i f o c o l a i l a r v a l i permanenti c i r c o s t a n t i l e zone dei "barrages", gravi terebbero i n maggior pa r te n e l l e vicinanze, mentre a l cent ro d e l l a c i t t à . dove l a d i s p o n i b i l i t à d i f o c o l a i P quasi eslusivamente dipendente d a l l e piogge, prevale l a forma Savanna che, come s i 6 detto, appare p i ù l ega ta a queste condiz ioni .

BIBLIOGRAFIA

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Ann Iat. Supar. SonlM Vol. 22. N. l(1986). pp. 193-1%

F'ROGRAMMA DI LOTTA ANTIMALARICA A OUAGAOOUGOU [BURKINA FASOI - DISPERSIONE DI ANOPHELES GAMBIAE S.L. IN ZONA URBANA

C. Sabatinelli, P. Rossi e A. Belli

Ministero Affari Esteri, Dipartimento per la Cooperazione allo Sviluppo - Istituto di Parassitologia delllUniversità di Roma "La Sapienza"

Riassunto - Vengono esposti i risultati preliminari di uno studio sulla diaper- sione del vettore Anopheles gambiae s.1. in zona urbana.

Cummary (Malaria contro1 programme in Ouagadougou (Burkina Faeo) - Dispersion of Anopheles gambiae s.1. in urban area). - Preliminar results of a study on the disperaion of A.gambiae s.1. vector are reported with some consideration on their epidemiological importance.

Introduzione

La dispersione di Anopheles gambiae è uno degli aspetti più importanti dell'epidemiologia della malaria nelle zone urbane delloAfrica tropicale. Fino ad oggi gli studi a questo proposito si riferivano essenzialmente alla dispersione di questo vettore nelle zone rurali delle savane e hanno evidenziato delle distanze medie di 3 Km, che possono raggiungere un massimo di 6.8 Km con vento favorevole (1 ) (2) (3). Uno studio (4) ha tuttavia dimostrato, una dispersione assai minore (1-14 Km) di A. ambiae s.1. in zona urbana.

Le indagini entomologiche -e-TS-- 5 e protozoologiche (6) condotte per definire un progremma-di lotta contro la malaria a Ouagadougou, hanno evidenziato ampie variazioni nei tessi di inoculazione entomologica e negli indici plasmodici anche in quartieri assai vicini. Una tale focaliti di trasmissione sembrerebbe essenzialmente dovuta ad una assai debole mobiliti del vettore A.gambiae s.1. in zona urbana.

Al fine di contribuire ad una migliore conoscenza di questi fenomeni è sta- to condotto uno studio specifico sulla dispersione di A.gambiae s.1. in zona urbana scegliendo come area di indagine un quartiere della citth di Ouagadougou.

Materiali e Metodi

Quale zona di studio è stato scelto il quartiere di Kologh Naba; quartiere lottizzato, presenta dei focolai larvali di Anopheles gambiae s.1. relativamente localizzati anche in stagione delle piogge. Il quartiere, di circa 500 m2, è attraversato da strade perpendicolari in terra battuta che delimitano dei lotti di 100 metri di lato comprendenti 16 concessioni nelle quali è edificato un numero variabile di case in argilla ed argilla-cemento. I focolai larvali, costituiti da pozze di acqua stagnante, torbida, insoleggiata e senza vegetazione, sono situati quasi esclusivamente sul bordo del barrage no 2 che delimitala parte Nord del quartiere. L'insufficiente riempimento del bacino idrico, a causa delle scarse precipitazioni, Ilassenze di manutenzione dei margini e la natura

del suolo, sono all'origine della formazione dei focolai larvali. Nel quartiere sono stati stabiliti 81 punti di cattura, 3 per lotto, costituiti da una casa in 'lbanco" di dimensioni standard (2.5 x 3 x 3 m) con un tetto in lamiera ondulata, una sola porta e finestra. Alcuni lotti sono stati esclusi da questo studio in quanto mancavano di case con caratteristiche standard. In totale sono stati dunque presi in considerazione 27 lotti disposti su 7 file parallele situate a distanze crescenti dal margine del "barrage" (tra 100 e 1050 m). Era i 600 ed i 900 metri dai focolai larvali è presente una zona priva di abitazioni e pertanto esclusa dallo studio. Nelle abitazioni scelte dormivano una media di 3 persone per notte. Le catture sono state effettuate dal 27 al 30 agosto 1984, tra le ore 8 e 10 con la tecnica delle catture al piretro. Nei giornidelle catture non si sono avute piogge né forti venti.

Risultati

Le zanzare raccolte secondo il metodo sopra descritto sono state identificate e contate in laboratorio. Su un totale di 4.145 zanzare, sono state identificate 892 femmine e 354 maschi di Anopheles gambiae s.l., 1 1 s di A.funestus Giles, 15 PP di A.pharoensis Theo. 1.709 PP e 1.164 66 di Culex quinquefasciatus Say. Per oani lotto. corris~ondente a tre ounti di cattura, è stata calcolata la media déi valori'della densità per camera di femmine di.A.gambiae s.1. e di-Cul& uinquefasciatus ed il valore medio per fila di lotti. L'esame comparativo di iuesti valori da un X2 altamente significativo per A.gambiae con una probabilità inferiore all'uno per mille mentre le variazioni sono al limite della significa- tività per C.quinquefasciatus ( .O5)P).Ol). I valori medi della densità per camera e pek lotto delle femnine di A.gambir sono stati correlati con le rispettive distanze dai focolai larvali. La dlstri uzione che ne risulta mostra che la den- sità per camera decresce in funzione dell'allontanamento dai focolai larvali, ad eccezione di un lieve rialzo nella zona situata più all'interno (900-1050 m). A soli 300 metri dai focolai larvali si osserva una diminuzione del 50 5 della densità per camera (11 PP/camera) rispetto alla densità massima rilevata nella fila di case situate a 200 metri dai focolai (28 %+/camera). Si osserva anche che a soli 545 metri la riduzione è de11188 5 (3 */camera). La densità media per camera di femmine di Culex quinquefasciatus non risulta invece correlata significativamente all'allontanamento dai margini del "barrage" e mostra un andamento irregolare probabilmente influenzato dai focolai larvali(acque luride) sparsi in tutto il quartiere. Per quanto concerne le due altre specie di Anopheles raccolte, A.funestus ed A. haroensis, la densità per camera è risultata molto bassa (massimo 4 %+/carne-

e la loro presenza limitata alla prima fila di case vicine al "barrage". + Discussione

I dati raccolti nel presente studio vanno integrati con quelli della inchiesta entomologica e protozoologica condotte nel quadro del Programma di lotta contro la malaria nella città di Ouagadougou (5)(6). Nella zona che si estende dai margini del "barrage" fino a 350 metri, i valori di densità per camera di femmine di A.gambiae s.1. risultano compresi tra 11 e 25 e corrispondono a tassi di inoculazione entomologici (TIE) varianti tra 0.06 e 0.14, cioè da 1 a 4 punture infettanti per uomo e per mese (PIUM). Nella zona che si estende tra i 400 ed i 600 m, a valori di densità per camera compresi tra 3 e 7 corrisponde un TIE compreso tra 0.002 e 0.14, cioè da 0.5 a 1 PIUM. Le differenze tra gli indici entomologici delle due zone sono state confermate dai risultati dell'inchiesta protozoologica condotta all'inizio del mese di settembre dello stesso anno, nelle due stesse zone, (6) su 228 bambini di età com-

presa tra O e 5 anni. I risultati mostrano che nei 99 bambini abitanti la zona d~!i primi 350 metri, l'indice plasmodico totale (IP tot.) è del 33.3 %, l'indice ipmetocitario (IG) dell'8 % e l'indice di densità parassitaria (IDP) per Plasmo- ilium falciparum del 12.3 %. Invece nei 129 bambini residenti nella zona che si (%!;tende tra 400 e 600 rnj llIP tot. è de11'8.5 %, 1'IG de11'1.5 ?i e 1'IDP per I'.falciparum del 5.8 %. Le differenze osservate tra i due gruppi risultano tutte !iignificative con una probabilità inferiore all'uno per mille. A 500 metri dai focolai larvali di Anopheles gambiae s.1. si osserva dunque una diminuzione notevole di tutti gli indici malariometrici rispetto a quelli osservati nella popolazione che risiede in prossimità di questi focolai. I risultati dello studio mostrano, in zona urbana, una dispersione relativamen- l e debole del vettore A.gambiae s.1. probabilmente dovuta ad una elevatafrequen- ra e relativamente uniforme distribuzione spaziale degli ospiti. 4ueste osservazioni aprono prospettive interessanti per il controllo della malaria in zona urbana. In particolare appare molto promettente l'utilizzazione di insetticidi ad azione residua nelle case prossime ai focolai larvali, sia per proteggere la popolazione a più alto rischio,sia per limitare la dispersione del vettore.

BIBLIOGRAFIA

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5. ROSSI, P., BELLI, A., MANCINI, L. & C A B A T I N E L L ~ 1985.Xgramma di lotta antimalarica a Ouagadougou (Burkina Faso) - Livelli di trasmissione della malaria: dati entomologici. Annali 1st. San. stesso vol.

6. CABATINELLI, G., BOCMAN, A., LAMIZAKL. & R m , P. 1985. Programa di lotta antimalarica nella città di Ouagadougou (Burkina Faso) - Livelli di trasmissione della malaria: dati protozoologici. Annali 1st. San. stesso vol.

Ann I& Super. Sana VOL 22, N. i (1x16) pp. 1w.m

LIVELLI DI SENSIBILITPA' DI ANOPHELES GAMBIAE S.L. AGLI INSETTICIDI TRADIZIO- NALI E VALUTAZIONE DELL'EFFICACIA DI BACLLLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS

i? BACILLUS SPHAERICUS

C;. Majori (a), G. Sabatinelli (b), P. Rossi (b), R. ~ o m i (a) e F. villani (a)

(a) Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio di Parassitologia, Roma

( b ) Ministero Affari Esteri, Dipartimento Cooperazione allo Sviluppo

RIASSUNTO I saggi biologici effettuati su Anopheles yambiae s.1. nell'area urba na di Ouagadougou hanno messo in evidenza una sensibilita al fenitrothion, malathion, fenthion, temephos, chlorpyriphos e propoxur, ed una diminuita censibilita al DDT. Nella zona rurale (Koubri) è Dresente una resistenza al DDT - - - - -

e dieldrin. Bacillus thuringiensis H-14 e - B. sphaericus hanno dimostrato una elevata attività biologica in laboratorio.

SUMMARY Anopheles yambiae s.1. in urban areas of Ouagadougou, Burkina Faso, shows susceptibility to fenitrothion, malathion, fenthion, temephos, chlorpyriphos. propoxur, whereas 2 hours exposure to 4% DDT is required to have 100% mortality. DDT and dieldrin resistant populations from rural areas (village of ~oubri) are present. Bacillus thuringiensis H-14 and - B. sphaericus appear to have good larva1 contro1 potential.

Introduzione

In Burkina Faso, ex Alto Volta, Anopheles yambiae s.1. 6 il principale vettore di malaria in tutto il paese, e costituisce il solo vettore accertato nella zona urbana di Ouagadougou (1) . Le operazioni di lotta antivettoriale sono state effettuate in passato particolarmente nella zona di Bobo Dioulasso nel decennio 1955-1965. I primi dati sui livelli di sensibilita agli insetticidi in An. - yambiae sono quelli pubblicati da Hamon 5. G. nel 1957; successivamente i dati sulla sensibilita agli insetticidi tradizionali sono stati raccolti da Ricosse et al.(Z). La resistenza al dieldrin nel villaggio di Pala,e al DDT in -- Bobo Dioulasso, è stata riportata da Hamon et. - al.nel 1968(3) e rilevata fin dai primi anni di lotta antimalarica. Tra le cause principali dell'insorgenza della resistenza è stata menzionata la pressione selettiva esercitata dagli insetticidi clororganici impiegati in agricoltura ( Ricosse et. al., 1969).

Nell'ambito della prima fase del progetto di lotta antimalarica nella citta di Ouagadougou sono stati effettuati saggi di sensibilità di An. gambiae s.1. aali insetticidi comunemente imuieaati. ed è stata valutata l'efficacia in - - - ~

laboratorio di alcune formulazioni a base di Bacillus thuringiensis H-14 e B. - sphaericus, ceppi 1593 e 2362.

Materiale e metodi

I tests di sensibilita sono stati effettuati seguendo le metodiche standard raccomandate dalllOMS (4.5). Le prove con le alate sono state condotte impiegando femmine ingorgate di 5 yambiae s.1. raccolte in differenti occasioni in abitazioni della zona urbana di Ouagadougou ed in un villaggio

(Koubri) situato a 27 Km dalla capitale.Gmppi di 20 zanzare sono stati esposti per 1 ora a carte impregnate con DDT 4%. dieldrin O ,Q%, fenitrothion l%, malathion 5%, propoxur 0,1%. L'esposizione all'insetticida è stata protratta per 2 ore quando vi 6 stata soprawivenza con 1 ora di contatto.

Le prove di sensibilita sulle larve sono state eseguite su gmppi di 20 larve al 3' stadio-inizio del 4*,esposte per 24 ore a varie concentrazioni di una soluzione alcolica di chlorpyrifos, fenitrothion, fenthion, malathion, temephos-Le prove sono state effettuate in bicchieri di carta del diametro di 8 cm contenenti 250 m1 di acqua esente da tracce di cloro.Sono state calcolate le percentuali di mortalità osservate dopo 24 ore o 48 ore a differenti concentrazioni e successivamente corrette con la formula di Abbott; i valori di L C ~ ~ e LCgO sono stati ottenuti con l'analisi dei probit (6)utilizzando un progranmia su computer Tektronix Mod. 4051. Sono stati calcolati anche i limiti fiduciali delle concentrazioni letali ed i valori dello slope.

Per la valutazione dell1attivit8 larvicida dei bioinsetticidi thuringiensis H-14 e sphaericus e stato seguito il metodo riportato da Majori & Ali (7). Sono state preparate sospensioni allll% (peso / volume) dei formulati, agitando per pochi minuti; l'agitazione è stata mantenuta per le diluizioni successive necessarie per le prove. Per ogni concentrazione sono state effettuate 3 repliche e tutte le prove sono state ripetute in diverse occasioni non meno di 4 volte.

I saggi sulle zanzare adulte e sulle larve sono stati effettuati in Genna- io-Febbraio , durante la stagione secca (23-25*C ; 20-25s di U.R.) e in Ago- sto-Settembre, durante la stagione delle piogge (24-28°C ; 70-74 % di U.R.)

Non 8 stata osservata una variabilità significativa tra i risultati delle prove effettuate in stagione secca e stagione delle piogge

Risultati e discussione

I risultati dei saggi biologici effettuati con dosi diagnostiche indicano livelli normali di sensibilità al fenitrothion, malathion e propoxur, mentre per il DDT si evidenzia un moderato livello di resistenza nel caso delle popolazioni di A. pnbiae raccolte nell'area urbana di Ouagado\igou (Tabella 1) ed una marcata resistenza al DDT e dieldrin, in misura nettamente maggiore per questo ultimo, nelle alate provenienti dal villaggio di Koubri (Tabella 2).

Tabella 1 - Sensibilità a vari insetticidi di adulti(a'di Anopheles pmbiae s.1. raccolti nell'area urbana di Ouagadougou, Burkina Faso

Insetticida Conc. ( % l Tempo di Mortalità (a) (b) Esposizione (h)

FENITROTHION 1 1 100 MALATHION 5 1 100 PROWXUR 0.1 1 100 DDT 4 1 88.5 DDT 4 2 100

(a) fenunine ingorgate o gravide ; (b) mortalita corretta con la formula di Abbott .

I valori di LC 50

e LCgO per gli insetticidi fosforganici (Tabella 3) rientrano nell'ambito della sensibilità normale e in accordo con l'attività biologica esplicata dai sirigoli principi attivi.

talwlla 2 - Sensibilita agli insetticidi clororganici di adulti(a) di Anopheles gambiae s.1. raccolti nel villaggio di Koubri, Ouagadougou, Burkina Faso.

Innetticida Concentr. (%) Tempo di Mortalità ( 8 ) (b)

esposizione (h)

nm 4 DDT 4 DIELDRIN 0,4 DIELDRIN 0.4

1 f e d n e ingorgate o gravide; (b) mortalità corretta con la formula di Abbott.

'Tabella 3 - SensibilitB agli insetticidi fosforganici di larve di 3O- 4Ostadio di Anopheles yambiae s.1. raccolti nell'area urbana di Ouagadougou, Burkina Faso.

Concentrazione letale (mg/l) a 24 ore

Insetficida %o Limiti fid. 95% LC90 Limiti fid. 95% Slope

Le formulazioni di batteri sporigeni hanno dimostrato una elevata attività biologica nei confronti di A. gambiae s.1.. secondo le caratteristiche dei pro dotti (Tabella 4 , 5). In base ai risultati delle prove eseguite € possibile prevedere una efficace utilizzazione di cpesti bioinsetticidi per il controllo delle popolazioni vettrici nell'area di Ouagadougou.

Tabella 4 - Attività biologica di Bacillus thuringiensis H-14 su larve di 3O- 4Ostadio di Anopheles pambiae s.1. dell'area urbana e periferica di Ouagadougou, Burkina Faso.

Concentrazione letale (mq / 1) a 24 ore

FORMULAZIONE LC50 Limiti fid. 95% LC90

Limiti fid. 95% Slope

BACTIMOS, WP 0,0809 0,0698 - 0,0937 0,2312 0,1802 - 0,2973 2,27 TEKNAR, FC 0,6618 0,4452 - 0,9837 1,7426 1,7374 - 2,0145 2,09 VECMBAC, WP 0,1099 0,0959 - 0,1260 0,3753 0,2961 - 0,4757 2,59

Tabella 5 - Attività biologica di Bacillus sphaericus su larve di 3O- 4- stadio di Anopheles gambiae s.1. dell'area urbana e periferica di Ouagadougou, Burkina Faso.

Concentrazione letale (mq / 1) a 48 ore

CEPPO Limiti £id. 95% LCgO Limiti fid. 95% Slope

--

1593 0,4312 0,3421 - 0,5420 1,0650 0,7312 - 1,5542 1.97 2362 O ,2187 0,1370 - 0,3483 1,2983 0,9531 - 1,7245 4.03

I dati ottenuti con questa indagine preliminare forniscono le necessarie informazioni sui livelli di sensibilità o resistenza agli insetticidi tradizio nali e sulla efficacia in laboratorio di alcune fomlazioni a base di batteri sporigeni, in modo da poter idoneamente progranmare operazioni di lotta anti anofelica.

BIBLIOGRAFIA 1) ROSSI, S., MANCINI, L., Belli, A., SABATINELLI, G. 1985. Progranuna di lotta

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A m II* Supu. SimW Voi. 22, N. 1 (1986). pp. 201-204

VALORE DIAGNOSTICO DEL NUMERO DEI RAMI DELLE SETOLE ANTEPALMATE PER L'IDENTIFICAZIONE DELLE SPECIE ITALIANE DEL COMPLESSO ANOPHELES MACULIPENNIS

D. Bocco l in i (a), A. Sabat in i (a) e M. Coluzzi (b )

( a ) Laborator io d i Parassi to logia, I s t i t u t o Superiore d i Sanita' , Roma ( b ) I s t i t u t o d i Parass i to log i a, Un ive rs i ta ' "La Sapienza", Roma

Summary (Diagnost ic value o f t he number o f branches o f antepalmate h a i r s f o r t he i d e n t i f i c a t i o n o f t he I t a l i a n species o f t h e Anopheles maculipennis complex). - The la rva1 morphological character o f t h e number o f branches o f antepalmate ha i r s has been riexamined i n order t o ob ta in a b e t t e r eva luat ion o f i t s d iagnost ic value f o r t he I t a l i a n species * o f t he maculipennis complex. S t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f fe rences were confirmed between a l 1 species. However, on l y f o r a few comparisons, t h e character i s completely d i sc r im inan t and usefu l i n f i e l d research.

Int roduzione

O l t r e a l l a specie nominale Anophelei macul ipennis, sono present i i n I t a l i a a l t r e cinque specie appartenenti a l l 'omonimo complesso: An. me1 anoon, An. messeae, An. atroparvus, An. labranchiae e An. sacharovi . Dopo i pr im i l a v o r i d i F a l l e r o n i ( 1 ) che portarono a l l a scoperta d i questo gruppo d i specie c r i p t i c h e , il problema d e l l a l o r o i d e n t i f i c a z i o n e e ' s t a t o a f f r o n t a t o da d i v e r s i a u t o r i u t i l i z z a n d o c r i t e r i mor fo log i c i e genet ic i . L'esame e l e t t r o f o r e t i c o d i s is temi gene-enzima d iagnos t j c i e ' attualmente il solo c r i t e r i o che consenta l a c o r r e t t a c l a s s i f i c a z i o n e d i t u t t e l e specie a l l o s tad io l a r v a l e e d i a l a t a ( 2 ) . Questo metodo ha anche permesso d i c a r a t t e r i z z a r e popolazioni de l l a Va1 l e Padana r i f e r i b i 1 i morfologicamente ad An. subalpinus (taxon considerato sinonimo d i An. melanoon) e appartenenti probabilmente ad una set t ima e n t i t a ' del complesso maculipennis i n I t a l i a ( 3 ) . L'esame e l e t t r o f o r e t i c o del ma te r ia le non e ' t u t t a v i a sempre fac i lmente u t i l i z z a b i l e i n quanto comporta c o s t i no tevo l i e i l traspor to del ma te r ia le v i v o o congelato i n labora tor io . Alcuni c r i t e r i mor fo log i c i q u a l i ad esempio i c a r a t t e r i de l1 'uovo messi i n evidenza da F a l l e r o n i (1) possono quindi ancora c o s t i t u i r e un supporto notevole per i ndag in i d i campo s i a pure con l e ben note l i m i t a z i o n i dovute a l l a d i f f i c o l t a ' d i o t tenere ovodeposizioni da a l a t e c a t t u r a t e i n a t t i v i t a ' d i puntura. I n questo contesto abbiamo r i t e n u t o u t i l e r iesaminare c r i t i camente il solo c a r a t t e r e morfo logico l arva le considerato d i in te resse d iagnost ico per i l complesso e c i o e ' il numero dei rami d e l l e se to le antepalmate del I V e V t e r g i t e addominale (3-5). L ' o b i e t t i v o e ' s t a t o q u e l l o d i d e f i n i r e megl io i l i m i t i en t ro i q u a l i questo c a r a t t e r e puo' essere u t i l i z z a b i l e i n i ndag in i d i campo i n I t a l i a .

Mater ia l i e metodi

Sono s ta te esaminate 1 .O49 larve appartenenti a 23 campioni i d e n t i f i c a t i precedentemente con l'esame de l l e uova o dei sistemi gene-enzima. Le larve a l I V s tadio sono s ta te f issate i n formalina a l 4%, ch ia r i f i ca te i n c lo ra l la t to feno lo e montate i n l i qu ido d i Faure o i n fenolo-balsamo.

Tabella 1. - Numero e distr ibuzione dei rami d e l l e setole antepalmate del I V e V segmento addominale d i larve d i I V stadio d i diverse specie del complesso An. macul ipennis.

---------------------------------------------------------------------*----------

SPECIE LOCALITA ' N ESTREMI MEDIA DS ES ................................................................................ labranchiae Pol icoro (MT) 36 6-12

Buonamico (RC) 47 4-18 Bernalda (MT) 44 5-1 3

TOTALE 127 4-18

atroparvus Fol lonica (GR) 30 9-17 Ravenna (RA) 13 10-13 C o l l i a Volturno (1s) 16 10-18 Vallo de l l a Lucania (SA) 11 11-18

TOTALE 70 9-18

maculipennis Buonamico (RC) 59 9-19 13.49 1.87 0.24 R i e t i (RI) 81 9-22 14.18 2.17 0.24 Vica lv i (FR) 49 11-19 14.29 2.00 0.29 Orte (VT) 13 11-20 14.38 2.40 0.66 Opi (AQ) 106 11-22 14.74 2.33 0.23 S.Oliva (FR) 33 11-23 16,64 3.04 0.53

TOTALE 341 9-23 14.50 2,39 0,13

messeae Sart irana e Torre Bere t t i (PV) 117 9-23 15.25 3,26 0.30 R i e t i (RI) 79 12-28 15.90 2,76 0.31

TOTALE 196 9-28 15.51 3,07 0,22

me1 anoon Roma (RM) Massarosa (LUI Sa r t i rana (PV) (subalpinus) 47 18-34 24;60 3;26 0;48 Vica lv i (FR) 92 20-31 25.02 2.79 0.29

TOTALE 233 16-34 23,42 3147 0,23

sacharovi Taranto (TA) 48 29-50 38,08 4,66 0,67 Vieste (FG) 34 33-49 41,73 3,92 0,67

TOTALE 82 29-50 39.60 4,70 0.52 ................................................................................

I l s u l t a t i e discussione

Differenze s i g n i f i c a t i v e ( t d i Student) r i su l tano t r a l e medie d i t u t t e l e ~ p e c i e che variano da 9.6 per An. labranchiae a 39.6 per An. sacharovi (Tabella I). Al l1 in te rno de l l e singole specie di f ferenze s ign i f i ca t i ve ( t d i Student) r lsu l tano t r a l e popolazioni d i macul ipennis, melanoon e sacharovi . Tal i dlfferenze sono a t t r i b u i b i l i a di f ferenze genetiche dovute a fenomeni d i der iva o a di f ferenze fenot ip iche dovute a l1 ' e f f e t t o d i d ivers i ambienti l a r v a l i o d i dlverse condizioni d i a l levamento. I 1 campione d i melanoon d i Sart irana (Pavi a), r let t roforet icamente d i f fe renz iab i le e r i f e r i b i l e presumibilmente ad An. subalpinus (2). r i s u l t a intermedio r i s p e t t o a i campioni d i Massarosa e Vfcalvi sicuramente r i f e r i b i l i a melanoon.

I 1 carat tere e ' completamente discriminante solo t r a An. sacharovi e le, a l t r e specie, ad eccezione d i melanoon. Anche considerando l ' i n t e r v a l l o d e f i n i t o da 1 deviazione standard in torno a l l a media, l a sovrapposizione coinvolge t u t t e l e specie del gruppo ad eccezione d i labranchiae/melanoon e atroparvus/melanoon.

I d a t i concordano ampiamente con q u e l l i es is ten t i i n le t teratura, solo per An. atroparvus, An. messeae e An. sacharovi sono s t a t i t r o v a t i va lo r i medi p iu ' a l t i . Soprattutto nel caso d i An. sacharovi, che presenta setole con un numero particolarmente elevato d i rami con conseguente maggiore p o s s i b i l i t a ' d i er rore nel conteggio, l a di f ferenza puo' essere a t t r i b u i t a ad un esame p iu ' accurato del l e setole.

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RUOLO DELLA COMPETIZIONE NELLA DISTRIBUZIONE DI VETTORI D I MALARIA I N ITALIA

M. Coluzzi (a) e A. Sabat in i (b )

(a ) I s t i t u t o d i Parassi to logia, U n i v e r s i t a ' "La Sapienza", Roma (b) Labora tor io d i Parassi to logia, I s t i t u t o Superiore d i Sanita ' , Roma

Sumnary ( E f f e c t o f compet i t ion i n t h e d i s t r i b u t i o n o f ma lar ia vec tors i n I t a l y ) . - Unespected pa t te rns of d i s t r i b u t i o n o f Anopeheles 1 abranchi ae and Anopheles sacharovi and some v a r i a t i o n s i n t h e i r range i n I t a l y observed i n recent years suggest t h e e f f e c t o f compet i t i ve phenomena w i t h o ther species o f t h e macul ipennis complex.

I 1 r u o l o de i fenomeni d i competizione i n t e r s p e c i f i c a n e l l a d i s t r i b u z i o n e d e l l e zanzare e ' s t a t o i p o t i z z a t o r ipetutamente. I n t e o r i a l ' in f l uenza d i questo f a t t o r e e ' da prendere i n a t t e n t a considerazione s o p r a t t u t t o per specie t r a c u i es is tono s t r e t t e r e l a z i o n i f i l o g e n e t i c h e come e ' il caso dei membri del complesso Anopheles maculipennis. Alcune osservazioni s u g l i a r e a l i de i due p r i n c i p a l i v e t t o r i d i ma lar ia compresi ne l complesso, An. labranchiae e - An. sacharovi , e sul l e v a r i a z i o n i i n te rvenu te ne l l a l o r o d i s t r i b u z i o n e i n - I t a l i a n e g l i u l t i m i anni, fanno supporre l ' i n f l u e n z a d i fenomeni d i competizione.

An. labranchiae e An. sacharovi sono g l i elementi p i u ' mer id iona l i de l - - complesso maculipennis. La l o r o speciazione appare legata ad i s o l a t i f o r m a t i s i durante l ' u l t i m a g lac iaz ione i n nord A f r i c a ( labranchiae) e ne l l 'As ia mediterranea (sacharovi ). G l i area1 i p r i m i t i v i d i queste due specie te rmof i l e s i sono es tes i verso nord probabilmente i n tempi s t o r i c i , entrando i n con ta t to con q u e l l i d i elementi p i u ' s e t t e n t r i o n a l i de l complesso q u a l i An. maculipennis, An. atroparvus e An. melanoon (1 1. Le n i c c h i e ecologiche d i - - - queste specie s i sovrappongono largamente e l e d i f fe renze che cara t te r izzano An. labranchiae e An. sacharovi sembrano sostanzialmente legate a l l a l o r o p i u ' - - spiccata t e r m o f i l i a che determina, ne l caso del l 'a la ta , una p i u ' s t r e t t a associazione con l 'ambiente domestico termicamente p r o t e t t o e un conseguente importante r u o l o v e t t o r e per l a malar ia. I 1 d iverso termopreferendum e ' ev idenz iab i l e anche a l l o s tad io l a r v a l e (presumibilmente c o i n v o l t o i n maniera p i u ' d i r e t t a n e g l i i p o t i z z a t i fenomeni d i competizione), ma r e c e n t i i ndag in i s v o l t e i n Ca labr ia hanno permesso d i documentare r ipetutamente l a coesistenza d i l a r v e d i - An. maculipennis e An. labranchiae a pochi cen t ime t r i d i distanza, n e l l a stessa r a c c o l t a d'acqua, e probabilmente compet i t i ve r i s p e t t o a l l a stessa n i c c h i a ( 2 ) . La sovrapposizione de l l a n i c c h i a ecologica sembra par t i co la rmente ampia t r a - An. labranchiae' e il suo p i u d s t r e t t o v i c a r i a n t e s e t t e n t r i o n a l e

An. atroparvus. L'assenza d i s i t u a z i o n i d i r e a l e s i m p a t r i a t r a queste due - specie e l a l o r o d i s t r i b u z i o n e pa rapa t r i ca i n I t a l i a , suggeriscono chiaramente una i p o t e s i d i esclusione compet i t iva. D ' a l t r a p a r t e l a d i s t r i b u z i o n e c o s t i e r a i n I t a l i a peninsulare d i - An. labranchiae s i spiega d i f f i c i l m e n t e s u l l a base d e i s o l i f a t t o r i c l i m a t i c i , considerando che l a s tessa spec ie most ra d i p o t e r co lon izzare ampiamente zone i n t e r n e i n S i c i l i a ed i n Sardegna ( f i g . 1 ) . Anche i n questo caso l ' i p o t e s i che emerge e ' q u e l l a d i una compet iz ione con a l t r i membri d e l complesso maculipennis, i n p a r t i c o l a r e - An. atroparvus, p r e s e n t i i n I t a l i a peninsulare ma non n e l l e i s o l e . A l l o s tesso modo l a d i s t r i b u z i o n e st ret tamente c o s t i e r a d i An. sacharovi e il suo adattamento a l l e acque salrnastre, sono probabilmente de terminat i d a l l a compet iz ione che questa specie t r o v a n e l l e acque d o l c i in te rne . La stessa spec ie i n f a t t i s i r i v e l a quale elemento e u r i a l i n o e colonizza fac i lmente acque d o l c i i n t e r n e i n d i v e r s e zone d e l 1 'As ia dove sono assent i compe t i t o r i d e l complesso macul i p e n n i s ed i n p a r t i c o l a r e - An. labranchiae e - An. atroparvus.

L ' i p o t e s i d i un r u o l o d i fenomeni c o m p e t i t i v i n e l l a d i s t r i b u z i o n e d i - An. labranchiae e - An. sacharovi emerge anche d a l 1 'esame d i a lcune v a r i a z i o n i i n te rvenu te ne l l a d i s t r i b u z i o n e d i ques t i v e t t o r i dopo l a f o r t e r i d u z i o n e c u i

F ig. 1. - D is t r i buz ione d i An. labranchiae i n I t a l i a s u l l a base d i t u t t i i d a t i d i s p o n i b i l i . L 'a rea le ha sub i to una f o r t e r i duz ione a segui to de i t r a t t a m e n t i a n t i m a l a r i c i e n e g l i anni r e c e n t i e ' r i s u l t a t o nuovamente i n espansione s o p r a t t u t t o i n Sardegna e i n S i c i l i a .

sono s t a t i :e l a campagna ant ima lar ica con i n s e t t i c i d i ad sogget t i durant . azione residua. Le osservazioni p i u ' r e c e n t i dimostrano che An. labranchiae, p u r essendo presente nuovamente i n densi t a l e leva te i n alcune l o c a l i t a ' de l l ' I t a l i a peninsulare (2,3,4), e ' c a r a t t e r i z z a t o attualmente da una d i s t r i b u z i o n e a mosaico, mo l to focale, p i u ' s t ret tamente c o s t i e r a che i n passato e comunque ancora mol to l i m i t a t a r i s p e t t o a l l ' a r e a l e documentato precedentemente a g l i i n t e r v e n t i con insetticidi. Alcune zone un tempo co lon i zza te da - An. labranchiae sono s t a t e soggette a t rasformazioni ecologiche o ad inquinamenti che l i m i t a n o fortemente l e p o s s i b i l i t a ' d i sv i luppo d i questa come d i a l t r e specie d e l gruppo maculipennis. Tu t tav ia sono numerose l e zone i n c u i buone p o s s i b i l i t a ' d i sv i luppo permangono ma dove - An. labranchiae appare s o s t i t u i t o da An. melanoon, - An. maculipennis o - An. atroparvus. S i m i l i s o s t i t u z i o n i sembrano essere avvenute anche per An. sacharovi almeno ne l d e l t a de l Po dove non siamo - r i u s c i t i a met te re i n evidenza questa specie un tempo mol to frequente. I n base a i n o s t r i da t i , An. sacharovi permane sicuramente so lo i n alcune l o c a l i t a ' - c o s t i e r e d e l Gargano dove era i n passato s impatr ico/parapatr ico con - An. labranchiae e dove s i r e g i s t r a l 'apparente scomparsa d i ques t 'u l t ima specie.

Indag in i sper imenta l i su quest i fenomeni sono d i grande in te resse p r a t i c o i n quanto t u t t o f a r i t e n e r e che es is tano n o t e v o l i p o s s i b i l i t a ' d i manipolazioni d e l l a frequenza d e l l e d iverse specie con opportuni lanc i . Ad esempio l a d i f f u s i o n e d i - An. labranch ie i n Sardegna potrebbe r i s u l t a r e fortemente r i d o t t a da l l ' immiss ione d i a l t r e specie de l gruppo maculipennis non v e t t r i c i d i malar ia. L 'uso d i queste metodologie dovrebbe i n o l t r e essere attentamente v a l u t a t o ne l caso d i complessi d i specie d i Anopheles t r o p i c a l i (ad esempio complesso Anopheles gambiae) che comprendono specie v e t t r i c i e non v e t t r i c i .

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IL COMPLESSO ANOPHELES GAMBIAE IN MOZAMBICO

! 1 V.Petrarca (a), G.C.Carrara (b), M.A.Di Deco (a) e G.Petrangeli (a)

(a) Istituto di Parassitologia, Universita di Roma "La Sapienza" (b) Ministeri0 de Saiide, Maputo, Mozambico

Durante le stagioni delle piogge (ottobre-marzo) del 1983 e 1984 sono state effettuate catture di alate di Anophel s.1. in riposo al1 'interno delle abitazioni in 27 località appartenenti a otto delle dieci provincie in cui è suddivisa la Repubblica Popolare del Mozambico. Le alate semigravide sono state fissate sul campo in Carnoy etanolo-acetico e quindi spedite al l ' Istituto di Parassi tologi a di Roma dove sono state esaminate ci tologicamente. Come è noto l 'esame dei cromosomi p01 itenici del le ce1 lule nutrici ovariche del le alate semigravide permette l 'identificazione indubbia delle specie criptiche del complesso gambiae (altrimenti molto difficilmente distinguibili ) come anche lo studio di eventuali polimorfismi da inversioni paracentriche (1 1. Sono state identificate in totale 1376 alate di cui 432 An.arabiensis, 497 An.gambiae S.S., 446 An.merus e 1 An.quadriannu1atus.

An.gambiae S.S. 6 apparsa la specie del complesso prevalente nei campioni delle provincie settentrionali, caratterizzate da foreste ed elevata piovosità (superiore a 1000 mn/anno): nelle località delle provincie Cabo Delgado e Nampula essa 6 risultata sempre la sola presente (almeno nel periodo da noi considerato) con l 'unica eccezione del campione di Olumbi, dove due delle quattro alate catturate sono state identificate come An.merus, la specie della costa orientale africana del complesso a sviluppo larvale in acqua salmastra. Nella parte nord occidentale del Paese (provincie di Niassa e Tete) An.gambiae S.S. è risultata simpatrica con An.arabiensis; in particolare nei campioni raccolti nei villaggi della zona a più elevata altitudine (superiore a 800 m s.1 .m.) del Niassa la frequenza di arabiensis raggiunge circa i l 25% e nel1 'unico campione della provincia di Tete, catturato nel v1 llaggio di Moatize, essa è superiore al 40%. Nei campioni delle località centrali costiere di Quel imane (provinci a Zambesi a) e Beira (provinci a Sofal a), caratterizzate da stagni a mangrovie, la maggior parte degli esemplari catturati è stato identificato come An.merus (circa i l 75%), mentre i l resto del campione era costituito da An.gambiae S.S.; quest'ultima specie è risultata predominante (80% circa) nel campione del vi l laggio di Marromeu (provincia Sofala), sulla riva sud del fiume Zambesi a circa 50 km dalla costa, mentre i l restante 20% del campione era costituito da An.arabiensis. Nel sud del Mozambico (provincie Gaza e Maputo) caratterizzato da un clima più arido (meno di 600 mm/anno di pioggia) e da temperature medie annuali relativamente minori, An.gambiae S.S. sembra scomparire del tutto nei campioni Lavoro eseguito nell'aibito del contratto C.E.E. TSO.OIS.I(TT).

c a t t u r a t i a l 1 ' interno de l l e abitazioni, s o s t i t u i t o da An.arabiensis, che su l l a costa, laddove esistono stagni salmastri a mangrovie. è simpatrico con An.merus. Particolarmente interessante è il campione catturato a Chokwe (provincia Gara), un v i l l agg io s u l l a r i v a sud del fiume Limpopo a c i r ca 70 km d a l l a costa; i n esso è i n f a t t i presente An.merus ( c i r ca 13%) nonostante l a distanza dall'oceano e l'assenza d i mangrovie a l l e qual i è usualmente legato l o sviluppo la rva le d i questa specie. I n t a l e l o c a l i t à è t u t t a v i a presente acqua salmastra dovuta probabilmente a l l a soluzione i n acqua piovana d i sale presente nel suolo. Un fenomeno s imi le s i v e r i f i c a anche ne l l e l o c a l i t à p i ù meridional i d i Bela Vista, Salamanga e Tinonganine, t u t t e s u l l e r i v e del fiume Maputo, che possono essere salmastre per l ' ingresso d i acqua marina sospinta da l l e maree. Nel la l o c a l i t à d i Bela Vista, i n un unico campione cat turato i n a t t i v i t à d i puntura su bovini, è s ta ta i d e n t i f i c a t a l ' un i ca femnina d i An.quadri annul atus.

L'esame dei cromosomi ao l i ten ic i , o l t r e a f o rn i re i cara t te r i c i totassonomici a t t i a l l a ident i f icaz ione del l e specie del complesso, ha permesso anche l o studio dei polimorfismi da invers ion i paracentriche i n An.arabiensis e An.gambiae S.S.. An.rnerus è r i s u l t a t o sempre monomorfico per l'ordinamento standard, fenomeno g ià segnalato i n un lavoro e f fe t tua to su l l e coste del Kenya (2).

An.arabiensis ha mostrato polimorfismo da inversione 2Rb/+: l a frequenza del1 'ordinamento i n v e r t i t o nel1 'area d i d istr ibuzione de l l a specie ( l o c a l i t à meridionali e nord-occidentali) s i aggira molto uniformemente in torno a l 70% con l 'unica eccezione del campione d i Moatize (proyincia Tete-non distante dal fiume Zambesi) i n cu i l a frequenza d i 2Rb scende, ma i n maniera non s ign i f i ca t i va , a l 50%. I n alcune l o c a l i t à è presente anche il polimorfismo 3Ra/+ ma con frequenze del l 'ordinamento i n v e r t i t o mai super ior i a1 1 '8%.

An.gambiae S.S. presenta due polimorfismi da inversione: 2Rb/+ e 2La/+. La frequenza dell'ordinamento b è molto bassa o par i a zero nei campioni de l l e zone cost iere nord o r i e n t a l i e cent ra l i , generalmente d i foresta. mentre sale f i n o ad un massimo d i c i r ca il 35% ne l l e aree occidental i p i ù interne e montuose. La frequenza dell'ordinamento 2La var ia da un minimo del 28% f i n o ad un massimo del1 '84: l e frequenze p i ù elevate s i osservano i n zone con scarsa p iovos i tà ( c i r ca 700 tmn/anno) del l a provincia nord-occidentale Tete ( l o c a l i t à Moatize). Questi da t i sembrano i n accordo con quanto g i à osservato i n zone de l l lA f r i ca occidentale ( l ) , dove s i è potuta notare una relazione t r a aumento de l l a frequenza dei por ta to r i d i questo ordinamento e condizioni d i a r i d i t à relativamente elevate.

La deviazione d i ciascun campione d i An.arabiensis e An,gambiae S.S.

d a l l ' e q u i l i b r i o d i Hardy-Weinberg non è r i s u l t a t a mai s ign i f i ca t i va .

BIBLIOGRAFIA

1. COLUZZI M., SABATINI A.. PETRARCA V.. D I DECO M.A. 1979. Chromosomal d i f f e r e n t i a t ion and adaatation t o h&an environment i n the Anoaheles - gambiae complex. ~rans.~oy.~oc.tro~.~ed.~y~. , 73: 483-497.

2. MOSHA F.W., PETRARCA V. 1983. Ecologica1 studies on Anopheles gambiae complex s i b l ing species on the Kenya coast. Trans.Roy.Soc.trop.Med.Hyg., 77: 344-345.

Ann Il* Super. Smdbi VoL 22, N. 1 (1986), pp. 211-214

IDENTIFICAZIONE MORFOLOGICA D I ALATE D I ANOPHELES MERUS I N MOZAMBICO I N UNA ZONA D I SIMPATRIA CON AN.GAMBIAE E AN.ARABIENSIS

M.A.Di Deco (a), G.C.Carrara (b), V.Petrarca (a) 8 S.8agalino (a)

(a) I s t i t u t o d i Parassitologia, Universi tà "La Sapienza", Roma (b) Min is ter i0 de Saùde, Maputo, Mozambico

Anopheles merus è l a specie del complesso gambiae a sviluppo la rva le i n acqua salmastra che v ive lungo l a costa d e l l 1 A f r i c a or ientale. Situazioni d i simpatrismo sono s ta te documentate a l l o stadio d i a la ta con l e specie d i acqua dolce An.gambiae e An.arabiensis. Nonostante l 'elevato cr ip t ic ismo t r a l e specie del complesso uno studio d i Coluzzi nel 1964 (1 ) ha evidenziato due ca ra t t e r i d i t i p o biometrico ( i l rapporto palpale e il numero d i s e n s i l l i celoconici del l 'antenna) che permettono d i d i f ferenz iare An.merus r i s p e t t o ad An .arabiensis e An.gambiae. Alcune osservazioni successi ve hanno confermato i l valore tassonomico d i t a l i ca ra t t e r i mettendo t u t t a v i a i n evidenza una notevole v a r i a b i l i t à cost che popolazioni d e l l a stessa specie ma d i diversa o r ig ine geografica mostrano d is t r ibuz ion i t a l v o l t a p iu t tos to diverse mentre popolazioni appartenenti a specie diverse mostrano aree d i sovrapposizione anche p iu t tos to ampie (1, 2, 31. G l i s tud i soprac i ta t i s i sono basati, per l ' i den t i f i caz ione d i An.merus r i s p e t t o a l l e specie d'acqua dolce su materiale d i laborator io or ig inato da femnine i d e n t i f i c a t e mediante t e s t d i i bridizzazione oppure su materiale d i campo i den t i f i ca to con il t e s t d i to l leranza a l l a sa l in i tà . La scoperta che l e sei specie del complesso possono essere t u t t e d i f fe renz ia te s u l l a base d i r iordinamenti cromosomici ev idenz iab i l i ne l l e c e l l u l é n u t r i c i ovariche del l e a l ate semigravide, ha determinato un minore interesse per t a l i metodi morfologic i . Tuttavia, dato i 1 l i m i t e che i l metodo citotassonomico presenta (è appl icab i le i n f a t t i solo ad a la te n e l l o stadio f i s i o l o g i c o d i semigravide) abbiamo r ipreso i n considerazione il metodo biometrico per valutarne l a sua eventuale u t i l i t à pratica. L'opportunità per t a l e studio c i L!! stata f o r n i t a da un materiale, proveniente dal Mozambico, particolarmente adatto perchè c o s t i t u i t o da esemplari r a c c o l t i i n natura e appartenenti a l l e t r e specie i d e n t i f i c a t e cromosomicamente (4).

Mater ia l i e Metodi

Il materiale consiste d i 100 An.gambiae, 150 An.arabiensis e 200 An.merus r a c c o l t i da Febbraio a Giugno 1983 e da Dicembre 1983 a Giugno 1984 prevalentemente i n r iposo a l l 'interno de l l e abi tazioni . Ali.gambiae L!! stato raccol to i n parte lungo l a costa centrale del Mozambico dove è simpatrico con An.merus e i n parte n e l l e reg ion i p i ù in terne e set tent r ional i . An.arabiensis proviene prevalentemente da l l a costa meridionale dove è s ta to t rovato i n

Lavoro e s e g u i t o nalllambit.a da l c o n t r a t t o C . E . E . TSD.Ol6.I(TT).

simpatria con An.merus e solo in piccola parte è originario della regione più interna e settentrionale del Paese. An.merus, infine, proviene da località della costa centrale e meridionale del Paese.

I1 capo di ciascun esemplare, identificato cromosomicamente come appartenente a una delle tre specie, è stato chiarificato in clorallattofenolo e montato in fenolo-balsamo per la misura dei segmenti palpali e la conta del numero totale di sensilli celoconici sui segmenti antennali (dal 3" al IO0). Entrambe le osservazioni sono state eseguite a 200 ingrandimenti utilizzando un oculare micrometrico per la misura dei segmenti palpali. Per analizzare la distribuzione dell'indice palpale nelle tre specie sono stati utilizzati tutti gli esempi ari disponi bili mentre per analizzare la distribuzione del numero di sensilli celoconici dell'antenna solo un sottocampione di 50 esemplari è stato utilizzato per ciascuna specie. Per ogni esemplare è stato calcolato i l numero medio di sensi1 l i celoconici tra le due antenne. I1 criterio per stabilire la uti lizzabilità pratica di tali caratteri è stato basato sul calcolo del coeffici ente di differenza tra le medie (1 ).

Risultati e Conclusioni

I1 diagramma delle distribuzioni dell'indice palpale nei campioni da noi esaminati è riportato nella Fig. 1. Si pub notare come tali distribuzioni risultino diverse soprattutto tra merus e le due specie d'acqua dolce essendo le medie e le deviazioni standard dellJindice palpale di An.merus, An.arabiensis e An.gambiae rispettivamente pari a 0,89*0,04, 0,7810,03, e 0,7710,02. Mediante i l calcolo del coefficiente di differenza è risultata un'area di sovrapposizione delle distribuzioni di tale carattere inferiore al 5% tra merus e arabiensis e inferiore al 3% tra merus e ~ambiae.

Il diagramma della distribuzione del numero di sensilli antennali nei campioni da noi esaminati è riportato in Fig. 2. Anche per questo carattere biometrico le medie risultano diverse tra merus e le specie d'acqua dolce e in particolare rispetto ad An.gambiae. Le medie e le deviazioni standard del numero di sensilli celoconici di An.merus, An.arabiensis e An.gambiae sono rispettivamente 33,4513,33, 28,0413,61, e 21,5212,ll. Le aree di sovrapposizione, calcolate mediante i l coefficiente di differenza, sono 22% e 1,5% rispettivamente per le coppie merus-arabiensi s e merus-gambiae.

Infine è stato calcolato l'indice di correlazione tra i due caratteri biometrici. Poichè la correlazione non 6 risultata significativa in nessuna

30 A n gambiae

d An. arabiensis = 20 2 An. merus P e 10 U.

O 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 Numero sensilll celoconici

Fig.1. - Distribuzione del1 'indice palpale in alate raccolte in Mozambico e identificate ci totassonomicamente.

del le t r e specie s i 5 i po t i zza to che i due metodi appl icat i contemporaneamente migliorassero l a p o s s i b i l i t a d i i den t i f i caz ion i corret te. Tale ipotes i è s ta ta saggiata esaminando il numero d i s e n s i l l i celoconici i n t u t t i g l i esemplari d ispon ib i l i che pur appartenendo a specie diverse cadevano ne l l ' a rea d i sovrapposizione per 1 ' ind ice palpale. Come atteso su 40 esemplari ind is t ingu ib i l i sul l a base d i quest 'u l t imo carat tere ben 37 r isul tavano i d e n t i f i c a b i l i s u l l a base d e l l ' a l t r o .

I nos t r i dat i , o t t enu t i su esemplari d i campo i d e n t i f i c a t i con l a tecnica citotassonomica, r i su l tano completamente i n accordo con quanto osservato da Coluzzi su ceppi d i laborator io o r i g i na r i d e l l o A f r i c a Orientale, ma non completamente i n accordo con quanto osservato da Bushrod (2) e Mosha & Nutero (3) su materiale i d e n t i f i c a t o con il t e s t d i to l leranza a l l a s a l i n i t à . Tuttavia mentre i dat i d i Bushrod anche se d ivers i dai nos t r i confermano un1area d i sovrapposizione molto l i m i t a t a t r a merus e l e specie d'acqua dolce, i da t i d i Mosha & Mutero a l cont rar io mostrano un'area d i sovrapposizione estremamente estesa (59%). Anche ammettendo una v a r i a b i l i t à dei ca ra t t e r i morfologic i dovuta a f a t t o r i ambientali e genetici, il reperto d i Mosha & Mutero c i sembra troppo d i f fe ren te da quel lo degl i a l t r i autor i e perciò presumi b i lmente v i z i a to da e r r o r i d i c lass i f icaz ione v e r i f i c a t i s i a l momento d e l l 'applicazione del t e s t d i to l leranza a l l a sa l in i tà .

I n conclusione quindi l ' ind ice palpale e il numero dei s e n s i l l i celoconici u t i l i z z a t i contemporaneamente permettono d i dist inguere con un a l t o l i v e l l o d i a f f i dab i l i t à An.merus da l l e specie simpatriche An.gambiae e An.arabiensis. Tuttavia e consigl iabi le, qualora s i vog l ia eseguire un lavoro tassonomico d i questo t ipo, valutare preventivamente su un campione i d e n t i f i c a t o co l metodo citotassonomico, l ' e n t i t à de l l e eventuali aree d i sovrapposizione es i s ten t i t r a l e diverse specie per i due ca ra t t e r i biometrici .

30 I An. gambiae ap i 20 O An. arabiensis

C Q>

l0 E L

O 0.68 0.70 0.72 0.74 0.76 0.78 0.80 0.82 0.04 0.86 0.88 QSO 0.92 0.94 036 0.98 Indice palpale

Fig.2. - Distr ibuzione del numero d i sensi1 li celoconici d e l l 'antenna i n a la te raccol te i n Mozambico e i d e n t i f i c a t e citotassonomicamente.

BIBLIOGRAFIA 1. COLUZZI M. 1964. Morphological divergences i n the Anopheles gambiae

complex. Riv.Malario1. 43: 197-232. 2. BUSHROD F.M. 1981. The Anopheles gambiae complex and Bancroftian

f i l a r i a s i s trasmission i n a Tanzanian Coastal Vil lage. Ann. trop. Med. Parasit. 75: 93-100.

3. MOSHA F.M. & MUTERO C.M. 1982. Separation o f Anopheles merus from freshwater Anopheles gambiae by s a l i n i t y tolerance t e s t and morphological characters. Parassitologia 24: 255-264.

4. PETRARCA V., CARRARA G.C., D I DECO M.A. & PETRANGELI G. 1984. I 1 complesso Anopheles gambiae i n Mozambico. ( I n questo stesso volume).

Ann I.* Supr. Su*@ VoL 22, N. l(1986). pp.215-218

ESAME COMPARATIVO D E I TASSI D I INFEZIONE CON SPOROZOITI E FILARIE I N DIVERSE

FORME DEL COMPLESSO ANOPHELES GAMBIAE I N UN VILLAGGIO DEL MALI

Y.T.Touré (a), Y.Petrarca (b) e M.Coluzzi (a)

(a) Ecole Nationale de Médecine, Bamako, Mali (b) I s t i t u t o d i Parassitologia, Universi ta d i Roma "La Sapienza"

Recenti r icerche citogenetiche sul complesso Anopheles gambiae i n Mali (1) hanno permesso d i precisare l a distr ibuzione d i An.arabiensis e An.gambiae S.S.

e d i mettere i n evidenza nel l 'ambito d i quest'ultima specie t r e diverse un i t à tassonomiche indicate, con una nomenclatura non linneana, come Mopti, Savanna e Bamako. Queste t r e forme ca ra t t e r i zzab i l i cromosomicamente hanno uno status d i specie i n c i p i e n t i con tass i d i ibr id izzazione abbastanza e leva t i t r a Bamako e Savanna, meno frequenti t r a Mopti e Savanna e del t u t t o assenti t r a Mopti e Bamako. Con l ' o b b i e t t i v o d i evidenziare eventuali d i f ferenze nel ruo lo vet tore per plasmodi e f i l a r i e umane sono s ta te eseguite una ser ie d i osservazioni nel v i l l agg io d i Bananbani dove t u t t i quattro i taxa sopra r i co rda t i coesistono durante l a stagione de l l e piogge i n proporzioni v a r i a b i l i e mostrano l i v e l l i d i an t ropo f i l i a molto a l t i (HBI 7 0,90) e p iu t tos to uniformi. I n f a t t i il l i m i t a t o numero degl i animali o s p i t i a l t e r n a t i v i ( i n par t ico lare bovini) nonchè l a l o ro disposizione nel v i l l agg io non favorisce deviazioni r i l e v a n t i del l ' a t t i v i t a d i puntura che resta quasi t u t t a or ientata sull'uomo anche nel caso dei membri del complesso meno specificamente ant ropof i l i qual i An.arabiensi S.

Le zanzare sono s ta te raccol te con ca t tu ra to r i a serbatoio durante l e prime ore de l l a mattina i n ab i taz ion i scel te a caso, e mantenute i n b i cch ie r i d i cartone i n buone condizioni cl imatiche f i n o a l l e prime ore del pomeriggio. Dal le 14 a l l e 18 s i è proceduto a l l o r o esame operando solo su l l e femmine gonotroficamente a t t i v e che avevano compiuto un pasto d i sangue dcrante l a precedente not te e che r isul tavano a l 111-IV stadio ovarico d i Christophers (semigravide). Ciascuna d i queste zanzare è s ta ta dissezionata i n modo da consentire: 1) l'esame microscopico de l l e ghiandole s a l i v a r i per l a r i ce rca d i sporozoit i ; 2) l'esame microscopico del torace e del capo per l a r i ce rca e l ' ident i f icaz ione d i larve d i f i l a r i e ; 3 ) l 'assorbimento su car ta da f i l t r o del sangue residuo contenuto nel l ' in tes t ino per l ' ident i f icaz ione del l 'ospite; 4) l a fissazione i n etanolo/acido acetico i n microtubi da m1'0.5 de l l e ovaie da u t i l i z z a r e successivamente per l'esame dei cromosomi p o l i t e n i c i de l l e c e l l u l e n u t r i c i ovarìche. I preparati cromosomici sono s t a t i o t tenut i secondo l a tecn i - ca d i Coluzzi ( 2 ) modif icata da Hunt ( 3 ) e l a c lass i f icaz ione dei d ivers i taxa è s ta ta f a t t a seguendo il precedente lavoro (1).

L'esame comparativo dei tass i d i infezione è stato l i m i t a t o a l l a stagione

Lavoro eseguito nell'aibito di programmi finanziati da C.E.E., M.P.I. e O.II.S./T.D.R.

delle piogge e in particolare ai mesi di luglio, agosto e settembre in corrispondenza con le maggiori densità e con la presenza contemporanea dei quattro taxa oggetto del confronto. Sono stati complessivamente esaminati 1904 esemplari di cui 486 (25,53%) An.arabiensis e 1418 An.gambiae (74,47%), questi ultimi divisi in 453 (31 Mopti, 598 (41,178) Savanna, 154 (10,86%) Bamako e 213 (15,02%) portatori di cariotipi non facilmente riferibili ad una delle tre forme cromosomiche (in prevalenza cariotipi risultanti da i bridazioni ) . Del le 1904 zanzare esaminate ben 276 sono risultate portatrici di sporozoiti nelle ghiandole salivari con un tasso di infezione, molto elevato, pari al 14,50%. Osservazioni condotte in para1 lelo identificando gli sporozoiti con anticorpi monoclonali (Esposito et al., in preparazione) hanno consentito di accertare che oltre i l 99% delle infezioni era riferibile a Plasmodium falciparum in accordo con i dati rilevati nella popolazione umana durante la stagione delle pi w e .

La distribuzione delle zanzare infette risulta omogenea nei quattro taxa se si pongono a confronto i campioni totali. Ciò fa ritenere che non sono complessivamente presenti differenze rilevanti nei livelli di suscettibilità al parassita o nella longevità media e che, nelle condizioni prevalenti nel villaggio, tutti i taxa confrontati mostrano un elevatissimo tasso di puntura sul- l'uomo, confermato d'altronde dalle identificazioni dei pasti di sangue. Quando l'analisi comparativa viene indirizzata ai campioni dei singoli mesi emergono differenze significative nei tassi di infezione dovute almeno in parte a variazioni non parallele nell'eta media di alcune delle popolazioni presumibilmente in relazione a un loro sviluppo stagionale asincrono e/o a diversi valori adattativi (e longevità) rispetto a determinate condizioni stagionali. Diffe- renze più importanti si osservano nel1 'ambito del l a stessa popolazione tra varianti cromosomici per inversioni paracentriche del braccio 2R. Ad esempio nella popolazione Mopti gli eterocariotipi bc/u mostrano a luglio un tasso di infezione del 27,l2% significativamente piii elevato (P=0,002) del tasso osservato nei corrispondenti omocariotipi che risulta de1118,53% nello stesso mese (Tab.1). Questa differenza non è confermata ad agosto ciò che fa ipotizzare una relazione con un temporaneo vantaggio del1 'eterozigote durante i l mese di luglio e un corrispondente aumento della sua longevità media. Simili osservazioni sono possibili anche per polimorfismi cromosomici 2R di An.arabiensis e della forma Savanna di An.gambiae.

Per quanto riguarda le osservazioni su larve di filarie gli esami morfolo- gici eseguiti in particolare sul terzo stadio (L ) ci consentono di riferire le

3 infezioni a Wuchereria bancrofti in accordo con i dati parassitologici umani e con l 'elevato livello di antropofilia documentato. Del le 1904 zanzare esaminate 209 (10,97%) sono risulatate infettate (presenza di LI-L3) e 66 (3,47%) sono risultate infettanti (L3). La distribuzione delle zanzare infettate e infettanti nei quattro taxa non risulta omogenea. In particolare i tassi di infezione sui campioni totali sono pari a 4,32% per An.arabiensis, 4,64% per Mopti, 2,68% per Savanna e 0,65% per Bamako (solo una zanzara infettante su 153 esaminate). La minore efficienza vettrice della forma Bamako non sembra dovuta a minore longevità in quanto tale fattore influenzerebbe anche i l tasso di infezione con sporozoiti e, d'altra parte la minore frequenza di 'filarie in questa forma si osserva anche considerando le larve L e L Potrebbero quindi essere

2' ipotizzati meccanismi di resistenza al l linbezione o un ritmo di puntura diverso tale da determinare una minore probabilità di suzione delle microfilarie.

Ann, Id . Supr. Sanità Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 219-220

ZANZARIERE A BARRIERA PER I L CAMPIONAMENTO D I CULICIDI I N ATTIVITA' D I PUNTURA

SU ANIMALI

(a) Ecole Nat ionale de Médecine, Bamako, Mal i (b ) I s t i t u t o d i Parassi to logia, Un ive rs i tà d i Roma "La Sapienza"

Summary (Fences f o r sampling mosquitoes b i t i n g on anima1 herds).- Mosquito n e t fences 2.30-2.50 m h i g h placed around cowherds a t t h e i r n i g h t r e s t i n g s i t e s have been successfu l ly u t i l i z e d t o ob ta in l a r g e samples o f malar ia vectors o f the Anopheles gambiae complex and o f o ther mosquito species. Co l l ec t i ons o f blood f e d mosquitoes were c a r r i e d out dur ing the n i g h t by inspect ing r e g u l a r l y the n e t s ide f a c i n g t h e anima1 enclosure. This sampling procedure has important advantages over a l t e r n a t i v e procedures based on d i r e c t c o l l e c t i o n on anima1 o r on t h e use o f b a i t e d t raps.

Lo s tud io d e l l e preferenze a l imentar i dei d i t t e r i c u l i c i d i è d i grande in teresse epidemiologico e viene af f rontato con d iverse tecniche (1 ) . L ' i d e n t i f i c a z i o n e del sangue i n g e r i t o fo rn i sce informazioni a t t e n d i b i l i so lo quando s i a p o s s i b i l e d ispor re d i campioni rapp resen ta t i v i d i zanzare che s i sono n u t r i t e . La c a t t u r a not tu rna d i r e t t a su o s p i t i a l t e r n a t i v i e i n d iverse cond iz ion i r e s t a comunque una v e r i f i c a importante de l comportamento d i puntura ed è ind ispensab i le i n mol te r i ce rche par t ico larmente quando - s i t r a t t i d i s t imare l a f raz ione esofaga ed e s o f i l a d i una determinata specie. La c a t t u r a not tu rna su uomo è usata con successo n e l l o s tud io de i t a s s i d i inoculaz ione d i plasmodi e f i l a r i e e n e l l a valutaz ione d e l l a capaci tà v e t t r i c e . La c a t t u r a not tu rna su animal i pone invece d i v e r s i problemi s o p r a t t u t t o quando s i debba operare su grossi mammiferi a l 1 'aperto (bov in i i n p a r t i c o l a r e ) e quando non s i a p o s s i b i l e d i spo r re d i sogget t i d o c i l i od opportunamente immobi l i zza t i . Sono s t a t i anche sper imentat i numerosi t i p i d i t rappo le (vedi 1) a t t raverso cu i , t u t t a v i a , s i i n f l uenza quasi sempre l a composizione del campione. D ' a l t r a pa r te i n s i t u a z i o n i i n c u i l ' an ima le u t i l i z z a t o quale esca 6 presente i n numerosità ed aggregazioni impor tant i , l ' e f f e t t o a t t r a t t i v o d i s i n g o l i sogget t i assoc ia t i o meno a t rappo le può essere comparativamente de l t u t t o i r r i l e v a n t e . S i m i l i osservazioni sono s t a t e da no i f a t t e r ipetutamente n.el corso d i i ndag in i su i v e t t o r i d i ma lar ia del complesso An.gambiae l a c u i f raz ione zoo f i l a / e s o f i l a è i n genere scarsa e i c u i o s p i t i a l t e r n a t i v i sono c o s t i t u i t i pr inc ipalmente da bov in i . I n t a l i cond iz ion i 6 r i s u l t a t o molto u t i l e "operare" su l1 ' i n t e r a mandria con "zanzariere a bar r ie ra ' ' secondo il metodo che descriviamo qui d i seguito.

Ricerche e s e g u i t e con f o n d i C.E.E. e O.M.S./T.D.R.

I 1 p r inc ip io , mol to semplice, è que l l o d i r e a l i z z a r e una b a r r i e r a d i r e t e zanzariera esternamente a l r e c i n t o i n c u i sono c h i u s i g l i animal i durante l a not te. La zanzariera viene montata su p a l i m e t a l l i c i c o s t i t u i t i ciascuno da due segmenti il primo de i q u a l i lungo due met r i è i n f i s s o nel te r reno per una p ro fond i tà d i c i r c a 30 cm mentre il secondo, lungo 1 metro, è raccordato a l primo i n modo da formare un angolo d i 120" r i v o l t o verso il rec in to . I p a l i vengono p o s t i ad una d is tanza d i due met r i e sono p r o v v i s t i d i a n e l l i m e t a l l i c i da agganciare ad a n e l l i d i t e l a pred ispost i s u l l a zanzar iera i n modo che questa r i s u l t i tesa t r a i p a l i a formare una b a r r i e r a cont inua d i 2,30-2,50 m d i a l tezza i n t o r n o a g l i animal i . Tra il r e c i n t o e l a parete d i r e t e zanzariera viene l a s c i a t o un c o r r i d o i o p e r c o r r i b i l e d i c i r c a 1 m d i larghezza u t i l i z z a t o durante l a n o t t e per ispezionare ogni 10-15 m inu t i l a parete i n t e r n a d e l l a zanzariera con una t o r c i a e l e t t r i c a e campionare l e zanzare n u t r i t e con un asp i ra to re a serbato io ( 2 ) . Una b a r r i e r a c o s t i t u i t a da 30 p a l i e 60 me t r i d i zanzariera può essere fac i lmente t raspor ta ta e montata da t r e t e c n i c i i n meno d i 30 minut i .

La parete d i r e t e zanzariera i n t o r n o a l l a mandria non c o s t i t u i s c e un ostacolo r i l e v a n t e né per l ' e n t r a t a né per l a f u o r i u s c i t a d e l l e zanzare, come d ' a l t r a pa r te s t a t o d imostrato da G i l l i e s e Wilkes (3) con b a r r i e r e anche p i ù a l te . I n o l t r e nel nos t ro caso l e zanzare possono passare non solo sopra l a zanzariera ma anche s o t t o i n quanto una apertura d i 10-20 cm viene l a s c i a t a a l l ' a l t e z z a del suolo. Per quanto l a zanzariera non impedisca l 'a l lon tamento d e l l e zanzare n u t r i t e , u n ' a l t a percentuale d i queste, appesanti te da l pasto d i sangue, sosta s u l l a b a r r i e r a per p e r i o d i s u f f i c i e n t i a consent i re l a ca t tu ra .

Questo metodo d i campionamento d i c u l i c i d i i n ' a t t i v i t à d i puntura a l 1 'esterno su animal i , v iene da no i u t i l i z z a t o con successo i n r i ce rche i n corso s u l complesso An.gambiae i n Mal i e presenta a nos t ro parere i seguenti vantaggi: 1) il campione r i s u l t a i n genere molto p i o numeroso e presumibilmente p i ù rappresentat ivo d i que l l o che s i o t t i e n e con l a c a t t u r a su s i n g o l i animal i o con t rappole; 2) il campione è c o s t i t u i t o prevalentemente da femmine che hanno compiuto i n d i s t u r b a t e un pasto d i sangue completo su l1 'animale e possono qu ind i fac i lmente essere mantenute v i v e ed u t i l i z z a t e per al levamenti e per d i v e r s i t i p i d i esame t r a i q u a l i l ' a n a l i s i c i totassonomica de i cromosomi d e l l e c e l l u l e n u t r i c i ovariche; 3) vengono e v i t a t e imnob i l i zzaz ion i spesso traumatiche per g l i animal i con i q u a l i s i e v i t a un con ta t to d i r e t t o l im i tando cost i r i s c h i per il personale addetto a l l a c a t t u r a notturna.

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Anrr 1st. Supa. Vol. 22, N. 1 (1986). pp.221324

OSSERVAZIONI D I LABORATORIO SU POLIMORFISMI DA 1NVERS.IONE ORIGINATI DA INCROCI TRA POPOLAZIONI DIVERSE D I ANOPHELES GAMBIAE S.S.

A. Persiani, M.A. D i Deco & G. Pet range l i

I s t i t u t o d i Parassi to logia, Un ive rs i ta d i Roma "La Sapienza''

Alcune specie d i zanzare de l complesso Anopheles gambiae sono c a r a t t e r i z - zate da un e levato grado d i pol imorf ismo dovuto a i n v e r s i o n i paracentr iche. I n almeno due specie del complesso (An.gambiae S.S. e An.arabiensis) t a l e v a r i a b i - l i t a cromosomica 6 mantenuta, i n cond iz ion i n a t u r a l i , a l i v e l l i mol to a l t i e t a l i , probabilmente, da consent i re a l l a specie d i aumentare l e p o s s i b i l i t a d i adattamento a cond iz ion i ambienta1 i diverse (1 ) . Quando partendo da alcune popolazioni po l imor f iche de l complesso An.gambiae s i s t a b i l i s c o n o ceppi i n l abo ra to r io s i osserva i n genere i l mantenimento de.i p01 i m o r f i smi o r i g i n a r i . I n p a r t i c o l a r e un ceppo d i An.gambiae S.S. co lon izzato n e l l a Gambia e s tud ia to i n l a b o r a t o r i o per nove generazioni ha mostrato costantemente eccessi, spesso s ta t is t i camente s i g n i f i c a t i v i , del l e frequenze e te roca r io t i p i che osservate r i s p e t t o a i v a l o r i a t t e s i secondo l a legge d i Hardy-Weinberg ( 2 ) . I n questa nota vengono presenta t i u l t e r i o r i d a t i su l pol imorf ismo d i un ceppo d i Rn.gambiae S.S.. I n questo caso i pol imor f ismi non sono g l i s tess i p resent i i n natura i n quanto sono s t a t i o r i g i n a t i incrociando i n l a b o r a t o r i o popolazioni cromosomicamente diverse, geograficamente d i s t a n t i e non completamente panmitt iche.


I 1 mater ia le da n o i u t i l i z z a t o è s t a t o o t tenu to mediante i n c r o c i t r a l e t r e seguenti co lon ie d i l abo ra to r io : Ziguinchor, s t a b i l i t a ne l 1981 a p a r t i r e da ovodeposizioni d i o l t r e 80 femmine r a c c o l t e ne i p ress i d i Ziguinchor, Senegal meridionale, corr ispondente a l l a popolazione 2 d e s c r i t t a i n ( 3 ) . c a r a t t e r i z z a t a dai po l imor f ismi 2Rd/+, 2La/+; Bansang, c o s t i t u i t a ne l 1981 a p a r t i r e da ovode- pos iz ion i d i c i r c a 50 femnine r a c c o l t e ne i p ress i d i Bansang, n e l l a zona i n t e r - na d e l l a Gambia, corr ispondente a l l a popolazione 1 d e s c r i t t a i n ( 3 ) . monomorfa per l e i n v e r s i o n i f i s s a t e 2Rb e 2La; Bamako, s t a b i l i t a n e l 1983 da mate r ia le proveniente da Banambani, n e i p ress i d i Bamako, nel Mal i meridionale, c o r r i - spondente a l l a forma-cromosomica Bamako d e s c r i t t a i n (41, c a r a t t e r i z z a t a da l polimorfismo 2Rjcu/jbcu e da1l"inversione f i s s a t a 2La.

I n nessuno d e g l i i n c r o c i esegu i t i t r a quest i ceppi s i sono. osservat i fenomeni d i i n c o m p a t i b i l i t à ed e t e r o c a r i o t i p i mol to r a r i o assenti i n na tu ra sono r i s u l t a t i produci b i li i n labora tor io , p resent i ne l ceppo i b r i d o secondo l 'a t te - so e con f i t n e s s normale o comunque non i n f e r i o r e a i ceppi pa ren ta l i . Uno de i ceppi r i s u l t a t o da quest i i n c r o c i , e contenente ordinamenti d i t u t t e e t r e l e colonie, e s t a t o a l l e v a t o per numerose generazione e da noi preso i n esame a l Lavoro e s e g u i t o n a l l ' a n b i t o d i prograa i i f i n a n z i a t i da C.N.R. e I . P . I .

Sistema 2R i

f i n e d i osservare il mantenimento dei d ivers i ordinamenti a l t e rna t i v i . A d i - stanza d i 16 mesi da l l ' i nc roc io eseguito t r a i ceppi parental i , abbiamo esaminato t r e campioni d i a la te femmine pre levat i r ispett ivamente da l l a XXV, X X V I I e X X V I I I generazione.

L ' a l levamento è stato eseguito i n stanze termostatiche a l l a temperatura d i 2&1°C, umidità r e l a t i v a var iab i le dal 50 a l 70% e fotoperiodo d i 12h . Per l o studio del p01 imorfismo cromosomico sono s ta te u t i l i z z a t e a la te femmine semigravide; i preparati dei cromosomi p o l i t e n i c i de l l e c e l l u l e n u t r i c i ovariche sono s t a t i a l l e s t i t i secondo l e tecniche i n uso presso il nostro laborator io ( 3 ) . Dal la l e t t u r a del car io t ipo d i ciascun indiv iduo sono s ta te calcolate l e frequenze degl i ordinamenti cromosomici a l t e rna t i v i quindi . applicando l a legge d i Hardy-Weinberg, l e frequenze attese dei c a r i o t i p i : eventuali scostamenti t r a frequfnze dei c a r i o t i p i osservate e attese sono poi s ta te saggiate con il t e s t del X per s t a b i l i r n e l a s i g n i f i c a t i v i t 8 .


I n t u t t i i campioni appartenenti a l l e t r e generazioni è s ta to documentato il mantenimento d i t r e dei cinque ordinamenti a l t e r n a t i v i presenti nei ceppi parental i ovvero 2R+, 2Rjcu e 2Rd, mentre g l i ordinamenti 2Rb e 2Rjbcu sono andati pers i ; i n o l t r e dal l 'ordinamento 2Rjcu s i sono o r i g i n a t i per crossing over due nuovi var ian t i : 2Rj e ZRcu, presenti con frequenze basse ne l l e genera- z ion i da noi esaminate. Solo i n alcuni i nd i v i du i e teroz igot i per due o p i i i inversioni è s ta to poss ib i le s t a b i l i r e mediante l e t t u r a d i r e t t a se l e inversio- n i appartenevano o no a l l o stesso omologo. S i dovuto perciò procedere a l l 'ana l i s i del l e frequenze distinguendo a l l ' in terno del cromosoma 2 t r e s is te- m i d i inversione: il sistema 2Rj con i due ordpamenti a l t e r n a t i v i +J e j, il sistema 2Rd con i t r e ordinamenti a l t e rna t i v i + . d e cu e il sistema 2La con i due ordinamenti a l t e rna t i v i +a ed a. I n Fig.1 sono r i p o r t a t e l e frequenze degl i ordinamenti cromosomici osservate ne l l e t r e generazioni successive per ciascuno dei t r e sistemi d i inversione. S i può notare che i n t u t t i e t r e i sistemi g l i ordinamenti cromosomici standard vanno progressivamente aumentando ne l l e t r e generazioni successive.

Le frequenze car io t ip iche de l l e t r e generazioni sono r i p o r t a t e i n Tabella 1 dove per ciascun sistema d i inversione sono s ta te messe a confronto con l e frequenze attese secondo l ' e q u i l i b r i o d i Hardy-Weinberg. S i può notare che g l i scostamenti sono dovuti a eccesso pressocché costante degl i e te rocar io t ip i e d i f e t t o degl i omocariotipi. La deviazione t r a numero dei c a r i o t i p i osserva o e !! atteso secondo l ' e q u i l i b r i o d i Hardy-Weinberg, saggiata col t e s t del X è r i s u l t a t a s i gn i f i ca t i va ne l l a XXV generazione per il sistema 2Rj (P=0.005) e 2Rd (P<<0,001), n e l l a X X V I I generazione per i sistemi 2Rd (P<0,001) e 2La

Sistema 2Rd Sistema 2La

r : . < . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :,. . . . . . :.:. . . .,>,...,. : .:,, ........ .... ..: . . .

Fig . 1 - Frequenze degli ordinamenti c r w s m i c i a l t e r n i t i v i per i t r e sistemi d'inversione del cronosma 2 i n un ceppo d i laboratorio di Anopheles gcnbiae S.S.. l cmpioni appartengono a t r e diverse generazioni.

223

(P=0,04) e n e l l a X X V I I I generazione per il sistema 2La (P<t0,001). Un d iscorso a p a r t e mer i ta i n f i n e 1 ' a n a l i s i del tasso d i e teroz igos i pre-

sente ne i t r e campioni. S i è i n f a t t i no ta to che t a l e va lore diminuisce per i sistemi 2Rj e 2Rd e aumenta per il sistema 2La. T a l i andamenti oppost i c i hanno tndot to a calco1 are l a frequenza medi a d i e teroz igos i . Abbi amo qu ind i constata- t o che, pur variando l ' e t e r o z i g o s i t r a un sistema d i invers ione e l ' a l t r o e, ne l l 'ambi to d e l l o stesso sistema, t r a una generazione e l ' a l t r a , il va lo re d i eterozigosi media per generazione rimane costante i n t o r n o a l 52%.

I r i s u l t a t i qu i espost i concordano ne l1 ' i n d i c a r e il mantenimento de l p01 i - morfismo cromosomico i n ceppi d i l a b o r a t o r i o anche quando esso è prodot to da ordinamenti a l t e r n a t i v i d e r i v a n t i da popolazioni d iverse per o r i g i n e geograf ica e non completamente panmi t t i c h e .

I cambiamenti d i frequenze osservat i n e l l e t r e generazioni possono essere i n f l u e n z a t i da f a t t o r i q u a l i o r i g i n e d i nuove associaz ioni per e f f e t t o d e l l o scambio, i n e v i t a b i l i fenomeni d i deriva, d i f f e renza ne i v a l o r i a d a t t a t i v i t r a i c a r i o t i p i r i s p e t t o a l l e cond iz ion i d i labora tor io . T a l i cambiamenti d e l l e frequenze, t u t t a v i a , sembrano non in f luenzare l a frequenza media d i e teroz igos i che s i è mantenuta i n t o r n o ad un va lore pressocché costante. I d a t i sembrano confermare un r u o l o importante d e l l a sovradominanza marginale d e l l ' e t e r o z i g o t e s i a per il mantenimento de i pol imorf ismi , s i a per spiegare a lcun i de i cambiamenti d i frequenze osservat i . I n p a r t i c o l a r e l 'aumentq progressivo i n frequenza del l 'ord inamento Z L + ~ appare legato a l vantaggio d e l l l e t e r o c a r i o t i p o i n quanto

a a l ' omocar io t ipo 2Lt /t r i s u l t a pressocche assente e pe rc iò presumibilmente svantaggiato almeno n e l l e nos t re cond iz ion i d i labora tor io .

Tabella 1. - Fm+mze pmtuli oasvdc isqra) e a t t e (rotto) W c a l b i p l pe. l diversi sistmi di imaiaa ncl cm ~ 6 m 2 I n f a ( n c d i r n q d t labastrr(odiPmpr1agsiblirs.s.. Icsplmt gpatei ipDatrtdivengmmdor(.

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M.A.

INVERSIONE

Di Deco (a) & H.Tran Duc (b)

IN UNA POPOLAZIONE LABORATORIO

I s t i t u t o d i Pa rass i to log ia (Faco l ta d i Medicina), Un ive rs i t à d i Roma "La Sapienza", Roma I s t i t u t o d i Ma la r i o log id d i Hanoi, V ie t Nam

Int roduzione

I 1 pol imorf ismo cromosomico per i n v e r s i o n i paracentr iche è mol to d i f f u s o i n d iverse specie d i Ano fe l i n i ed è s t a t o s tud ia to s i a i n cond iz ion i n a t u r a l i che d i l abo ra to r i o . Anopheles stephensi s i è d imostrato par t i co la rmente adat to a s t u d i d i l a b o r a t o r i o che hanno permesso d i ev idenziare l e r e l a z i o n i f i l o g e n e t i c h e con l a specie a f f i n e An.superpictus ( 1 ), d i descr ivere l a d i s t r i b u z i o n e geograf ica d i d i v e r s i v a r i a n t i cromosomici (2 ) e i n f i n e d i s t a b i l i r e l e r e l a z i o n i t r a quest i v a r i a n t i e a l cun i mode l l i d i comportamento (ved i (3 ) per una b i b l i o g r a f i a d e t t a g l i a t a ) . I 1 pol imorf ismo p i ù ampiamente s tud ia to , s o p r a t t u t t o da quest 'u l t imo punto d i v i s ta , è s t a t o il 2Rb/+ che sembra anche essere f i n o ad oggi il p i u d i f f u s o . Questo pol imorf ismo insieme a l 2Lc/+ è s t a t o da no i preso i n esame e d e s c r i t t o i n questa nota paPticolarmente i n re laz ione a i tempi d i sv i luppo l a r v a l e i n cond iz ion i d i l abo ra to r i o .


I r i s u l t a t i qu i espost i sono s t a t i o t t e n u t i con il ceppo De lh i 1971 (2) i n allevamento presso l ' I s t i t u t o d i Parass i to log ia . Tale ceppo è c a r a t t e r i z z a t o da l l a presenza d i due pol imorf ismi : il 2Rb/+ e il 2Lc/+. Sono s t a t e esegui te cinque consecut ive generazioni d i l a b o r a t o r i o da c u i sono s t a t i e s t r a t t i a l t r e t t a n t i campioni d i a l a t e femnine con numerosità, n e l l ' o r d i n e , p a r i a 120, 87, 104, 137 e 142. I cromosomi p o l i t e n i c i o v a r i c i d i t a l i campioni hanno permesso l ' a n a l i s i de i due po l imor f i smi present i . Mentre il primo campione è s t a t o a l l e v a t o i n cond iz ion i standard, g l i a l t r i q u a t t r o sono s t a t i o t t e n u t i i n cond iz ion i p i ù c o n t r o l l a t e e c ioè con d e n ~ i t à l a r v a l e p i ù bassa corr ispondente a 120 l a r v e per bacina ( l l a r v a per 3 cm d i s u p e r f i c i e ) e separando l e a l a t e per g i o r n i d i s fa r fa l lamento i n modo da f o r n i r e l o r o il pasto d i sangue e n t r o due g i o r n i da l l o s fa r fa l lamento stesso.

Lavoro eseguito nrll'aibito di prograiii finanziati da C.N.R. e I.P.I.

Risultati

La frequenza percentuate degli ordinamenti 2Rb e 2Lc nelle cinque generazioni, diagrammata in Figura 1 indica che i due polimorfismi si aggirano intorno a valori medi piuttosto diversi essendo i l 2Rb pari al 53,90% e i l 2Lc pari al 34,00%. Inoltre, mediante test di omogeneità sono state evidenziate forti oscillazioni (P << 0,001) nella frequenza del 2Rb nelle successive generazioni mentre la frequenza $e1 2Lc appare molto pia stabile (P < O,6O). Saggiando, mediante i l test del X , l 'equilibrio di Hardy Weinbergh per i due sistemi di inversione nei cinque campioni, è risultato che la distribuzione dei cariotipi osservata per i l sistema 2Lc è sempre in accordo con i valori attesi mentre la distribuzione dei cariotipi 2Rb mostra un forte eccesso di eterozigoti nel primo campione (P < 0,001 ) e un eccesso significativo anche se di minore entita nel quinto campione ( P < 0,05).

Nella Figura 2 sono riportate le frequenze percentuali degli ordinamenti 2Rb e 2Lc per tre delle quattro generazioni ottenute con allevamento controllato. Ogni singola generazione è stata suddivisa secondo i giorni di sfarfallamento: sfarfallamento precoce che comprende 1 O , 2" e 3' giorno e sfarfallamento tardivo che comprende i giorni successivi al 3". I dati mostrano un andamento costante in tutte le tre generazioni con una diminuzione significativa (P < 0,01, P 0,05 e P C 0,Ol) della frequenza dell 'ordinamento 2Rb nell 'ultima parte dello sfarfallamento. L'ordinamento 2Lc invece. non ha mostrato nelle diverse generazioni un andamento costante. Solo in una delle tre generazioni di laboratorio si osserva un aumento significativo (P < 0,001) dell 'ordinamento nell 'ultima parte dello sfarfallamento.

lo-3O giorno 4O-5" giorno

Generazioni Generazioni Generazioni

Figura 1 Figura 2

Fig. 1 - Frequenze percentu-ali degli ordinamenti cromosomici 2Rb e 2Lc in campioni di alate femmine appartenenti a cinque generazioni successive di un ceppo di l ~boratorio di -.

Fig. 2 - Frequenza degli ordinamenti 2Rb e 2La in campioni di alate femmine appartenenti a tre generazioni di laboratorio di un ceppo di Anopheles stephensi. Ogni campione è stato suddiviso in due sottocampioni secondo i l periodo di farfallamento: sfarfallamento precoce 1 2" e 3" giorno) e sfarfallamento tardivo (4' e 5' giorno).

nclusioni

Sembra, i n conclusione che entrambi i polimorfismi abbiamo valore ds t ta t i vo i n condizioni d i laboratorio. Tuttavia, i due polimorf ismi sembrano vere un s ign i f i ca to diverso i n f a t t i mentre il 2Rb/+ è soggetto a l fenomeno

drl l 'eccesso d i eterozigot i , come g ià notato per a l t r e specie d i Anopheles (4) I l 2Lc/+ non presenta mai questo fenomeno. almeno ne l l e nostre condizioni d i

!

rilevamento. I n o l t r e l ' o rd inawn to 2Rb, contrariamente a l 2Lc. ha mostrato una chiara relazione con i tempi d i sviluppo la rva le i n accordo con quanto g ia precedentemente mostrato da Coluzzi (5). E ' s ta ta osservata i n f a t t i una frequenza p i ù elevata d i questo ordinamento t r a l e a la te che, a p a r i t à d i schiusa hanno uno sviluppo preimaginale p i ù rapido. quest'ultima osservazione potrebbe f o r n i r e l a spiegazione de l l e f o r t i osc i l l az ion i osservate per l 'ordinamento 2Rb nel l e successive generazioni d i laboratorio. E' i n f a t t i possibi le amnettere che l e oviposiz ioni da cu i s i è or ig inata ciascuna de l l e nostre generazioni non siano s ta te rappresentative d i t u t t a l a generazione parentale presente ne l l a gabbia d i allevamento ma siano provenute soprat tut to da a la te s f a r f a l l a t e per prime quando s i è reg is t ra ta una frequenza del1 'ordinamento 2Rb p i ù elevata e da a la te s f a r f a l l a t e p iù t a r d i quando viceversa s i è reg is t ra ta una frequenza del 2Rb p i i i bassa.

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sono s ta te eseguite principalmente nel v i l l agg io d i Mandina Ba, non ldntano da l l a foce del fiume Gambia e i n due p i c c o l i v i l l a g g i (Ker Madi e Balingho) presso Farafenni. Sono s t a t i pos t i a confronto campioni r a c c o l t i i n pa ra l l e l o i n diverse s i tuaz ion i o con d ivers i metodi d i cat tura come ind icato qui d i seguito: A) cat ture diurne i n ab i taz ion i umane; B ) cat ture diurne i n r i cove r i esterni; C) cat ture diurne i n r i cove r i per bovini ed equini; D) cat ture not tur - ne su uomo a l l 'es terno e a l l ' i n te rno ; E) cat ture notturne su bovini a l l ' e s t e r - no. Le zanzare ottenute con cat ture diurne (A, B, C ) sono s ta te dissezionate nel pomeriggio de l l o stesso giorno prendendo i n esame solo l a f razione del campione che aveva punto l a not te precedente e il cu i sviluppo ovarico r i s u l t a - va a l 1x1-IV stadio d i Christophers. D i queste zanzare è s ta to prelevato il residuo d i sangue nel l ' in tes t ino per l ' ident i f icaz ione del l 'ospi te mentre l e ovaie sono s ta te f i s sa te per l a preparazione dei cromosomi p o l i t e n i c i . Le zanzare ottenute da l l e cat ture notturne (D, E), molte de l l e qual i digiune, sono s ta te n u t r i t e su po l l o durante l a stessa not te e mantenute i n condizioni clima- t i c h e o t t ima l i per favor i re un normale sviluppo ovarico f i n o a l 111-IV stadio d i Christophers e consentire così l a preparazione dei cromosomi p o l i t e n i c i .


Le indagini sono s ta te eseguite durante l a stagione de l l e piogge neg l i anni 1980 e 1981 esaminando complessivamente o l t r e 12000 zanzare. La frequenza d i An.melas è r i su l t a ta , nei campioni r a c c o l t i a l l ' interno del l e abi tazioni , mediamente del 7% a Mandina Ba e del 40% ne l l a zona d i Farafenni. Variazioni altamente s i gn i f i ca t i ve sono s ta te osservate i n ciascuna de l l e due l o c a l i t à i n rapporto a i d ivers i t i p i d i campionamento. Ta l i var iàz ion i sono i n l i nea d i massima concordanti nel confermare una elevata z o o f i l i a ed e s o f i l i a i n An.melas (4). I n base a i d a t i r e l a t i v i a l1 ' ident i f icazione del pasto d i sangue nei campioni r a c c o l t i ne l l e abi tazioni , l a tendenza d i An.melas a n u t r i r s i su bestiame sarebbe non p i ù d i quattro vo l te maggiore r i spe t to a quel la d i An.gambiae. La di f ferenza t r a l e due specie r i s u l t a t u t t a v i a grossolanamente sottostimata da questo t i p o d i campionamento i n quanto An.melas che punge a l1 'esterno su animali (prevalentemente bovini ed equini ) ha una p robab i l i tà molto p i ù bassa d i An.gambiae d i andare a r iposare n e l l e ab i taz ion i umane (endof i l ia ) . I n f a t t i l e cat ture eseguite a Ker Madi su animali a l l 'es terno mostrano un rapporto medio d i 1 gambiae per 20 melas mentre nel campione pos i t i vo per sangue d i animali cat turato z l l ' i n t e r n o de l l e ab i taz ion i n e l l o stesso periodo il rapporto è d i 1 gambiae per 0,6 melas. Pertanto se l a proba- b i l i t à d i An.gambiae d i entrare ne l l e abi tazioni è 1 quel la d i An.melas r i s u l t a essere i n f e r i o r e a 0,05. Tenendo conto quindi del diverso comportamento endofi- l o de l l e due specie, l a z o o f i l i a d i An.melas sarebbe almeno 10 vo l t e p i ù elevata d i quella d i An.gambiae come d ' a l t r a parte è ind icato da l l e cat ture i n para l le lo su uomo e su bovino.

Questo comportamento zoo f i l o ed eso f i l o d i An.melas non è t u t t a v i a un i for - me prendendo i n esame i var ian t i cromosomici i n t raspec i f i c i . I campioni esami- n a t i sono r i s u l t a t i po l imor f i c i per 5 diverse invers ion i paracentriche, due de l l e qual i molto ra re e t u t t e con frequenze car io t ip iche sostanzialmente i n accordo con l ' i p o t e s i d i una singola un i tà panmitt ica ne l l ' a rea d i studio. L' inversione 2Rn è l a p i ù frequente e quella p i ù interessante i n rapporto a l l e eterogeneità sopra menzionate. Questa inversione sembra i n f a t t i associata i n

CAMPIONI TOTALE +n/+n +"/n n/n N % N % N %

Catture notturne uomo a l1 ' in terno 225 108 48,OO 102 45,33 15 6,67 uomo a l l 'esterno 236 134 56,78 90 38,14 12 5.08 bovino a l l 'esterno 543 270 49,72 222 40,88 51 9.39

Catture diurne ne l l e ab i taz ion i sangue umano 159 81 50,94 69 43,40 9 5.66 sangue animale 152 59 38,82 73 48,03 20 13.16 ...............................................................................

2 X = 19,39 P = 0,Ol

qualche modo con una maggiore z o o f i l i a e forse anche con una maggiore endo f i l i a (vedi anche 4 e 5). I n par t ico lare i da t i r acco l t i a Ker Madi, r i p o r t a t i n e l l a Tabella 1, indicano una frequenza dei por ta to r i dell'ordinamento 2Rn meno elevata nel campione cat turato su uomo a l l 'es terno r i spe t to a l campione cat tura to su bovino ne l l e stesse condizioni e questa tendenza r i s u l t a chiaramente confermata dal confronto dei campioni ca t t u ra t i ne l l e abi tazioni e separati i n rapporto a l l ' i den t i f i caz ione del pasto d i sangue. Volendo calcolare su ciascun car io t ipo l ' i n d i c e d i puntura su uomo quento r i s u l t a par i a 0,58 negl i omoca-

n n r i o t i p i + /+ , 0.49 neg l i e te rocar io t ip i + /n e 0,31 neg l i omocariotipi n/n.

GILLIES M.T. & DE MEILLON B. (1968). The Anophelines o f A f r i ca South o f the Sahara. Publ .of The South Afr ican I n s t i t u t e f o r Medica1 Research, Johannesbura. " BRYAN J.H. (1983). Anopheles gambiae and An.melas a t Brefet, The Gambia, and t h e i r r o l e i n malaria transmission. Ann.trop.Med.Parasit. 77: 1-12. COLUZZI M., SABATINI A., PETRARCA V. -. Chromosomal d i f f e r e n t i a t i o n and adaptation t o human environments i n the Anopheles gambiae complex. Trans.Roy.Soc.trop.Med.Hyg., 73: 483-497. BRYAN J.H., PETRARCA V., D I DECO M.A., COLUZZI M. (1981). Osservazioni su Anopheles melas ne l l a Gambia e zone l imi t ro fe . Parassitologia, 23: 136-139. BRYAN J.H., PETRARCA V., 01 OECO M.A. & COLUZZI M. (1984). Mosquito behaviour studies i n The Gambia, West Afr ica. In: Proc.of Conference i n Honour o f R.H.81ack. Sydney, February, 1983. Austral ian Government Publishing Service. Canberra.1984, 157-160. BRYAN J.H., D I OECO M.A, PETRARCA V. di COLUZZI M. (1982). Inversion oolv- . - morphism and i nc ip ien t speciation i n Anopheles gambiae s.str. i n The Gambia (West Afr ica). Genetica, 59: 167-176.

Ann. 1st. Supr. W@ Voi. 22, N. 1 (1986), pp. 233-238

VALIDITA' DI UN TEST EIA NELLA DETERMINAZIONE DEGLI ANTICORPI IgG ANTT-TOXOPLASMA NELLA PREVENZIONE PRECONCEZIONALE

Servizio di Micrdbiologia, Ospedale Regionale, Treviso

Riassunto - Nell'attuale diagnostica preventiva di infezione toxoplasmica materno-fetale è importante disporre di metodi di screening di massa, da utilizzare nelle donne fertili in fase pre-grac vidica. Tra le tecniche diagnostiche 5 migliore quel test capace di discriminare i pih bassi,ma sicuri titoli anticorpali. Si è preso in considerazione un test del commercio (EZI-TOXOK) e si riferiscono prove volte ad utilizzarlo in modo migliore nella area "border-line" .

Sierological screening methods are a very important t001 for prevention of congenita1 toxoplaamosis when employed in fertil women before pregnancy.

The methods able to detect the lowest, however quite sure, anti-toxoplasma antibody levels are to prefer for this purpose.

We report our evidences regarding a new commercia1 kit (ETI- TOXOK) and its employment in bordercline range.

Introduzione

L'infezione da T.gondii è una delle più diffuse nell'uomo e negli animali, essa interessa secondo le statistiche 11 25-75$ e oltre della popolazione adulta sana.

Allo stato attuale la diagnosi di infezione toxoplasmica è compito del laboratorio e pub essere posta con : - metodi diretti che comprendono isoLamento e identificazione del protozoo dal materiale biologico - metodi indiretti a) immunologici (siero-morali, cellulari)

b) istologici In Italia, come in altri paesi, la diagnosi è fondamentalmente

sierologica e - nelle donne i campi di applicazione sono: fertili: a) profilassi preconcezionale b) controllo durante la gravidanza - nei neonati: toxoplasmosi connatale - nei soggetti di ogni età: toxoplasmosi acquisita

I1 ridotto interesse per la patologia dell'adulto, unito ad una più reale valutazione del rischio di infezione nella donna in gravidanza, hanno spostato l'interesse del microbiologo verso la toxoplasmoei materno-fetale e sua prevenzione. Cib si è tradot3.o nell'attuale aumento di richieste di esami sierologici per la profilassi gravidica ponendo la necessità di adottare sistemi di scree ning di massa in grado di rispondere a queste esigenze, di accertare prioritariamente cioè se esiste o meno uno stato acquisito di immunizzazione.

E' noto che un test di screenig deve possedere: -buona specificità -buona sensibilità per rilevare i più bassi, ma sicuri, livelli anticorpali, dovendosi evitare i falsi poaitivi non più correggibili -buona riproducibilità del dato -sempli- cità tecnica, basso costo.

Allo scopo di identificare nell'ambito delle tecniche diagnostiche,quelle più adatte a rilevare i più bassi contenuti di I& specifiche, viene preso in esame il test immunoenzimatico EIA. I1 fine è di valutare il grado di rilevamento del metodo, nel limite inferiore, delle unità sicuramente protettive che oggi è at- testato per le tecniche siero-immunologiche più comuni ancora intorno alle 30 ~.~./ml. Capacità di identificazioni più basse si riconoscono solo per il dye-test, non usato di routine.

EIA è una tecnica lineare standardizzabile, più sensibile e più specifica delle tecniche end-point, mentre precisione ed ac- curatezza sono identiche a quest'ultime.

Materiali e Metodi

Nel nostro Laboratorio da tempo è in uso, il sistemaEIA prodotto dalla Ditta Sorin Biomedica (ETI-TOXOK). L'esecuzione del test prevede la diluizione dei campioni 1:5000, e lettura dei risultati contro una curva di taratura costruita con una serie di standard da 15 a 1500 U.I./ml (TOXO-STD-SET). Accanto a ETI-TOXOK I@ è eseguito di routine il test di aggluti- nazione diretta (A.D.) per.completamento e conferma del dato. Cpmndo i risultati appaiono discordanti o non correlati il riferimento è fatto con IFA e Rye-Test.

Nel corso degli esami compiuti, è apparso evidente che il test, eseguito secondo la procedura analitica suggerita dalla ditta produttrice, mentre è correlato per i valori medio-alti, crea problemi nell'area bassa della curva, indicando unità EIA superiori al reale titolo anticorpale owero dando qualche falso negativo in confronto con il dye-test.

L'idea di poter migliorare le possibilità di questo metodo

noenzimatico nellearea bassa, si è intuita quando, per motivi d i ordine pratico (leoccasionale esaurimento dei reattivi del TOXO WD-SET per costruire la curva 15-1500 u.~./ml), si è eseguito il trwt allestendo una curva di' taratura con 3 punti dati dal contro1 - t n positivo (150 U.I./ml) e il controllo negativo forniti dalla ditta e 1 punto intermedio (30 u.~./ml) ricavato da questi,ottenen do una espansione della curva nella parte medio-bassa dei valori. Cib ci ha indotto a ritenere dopo consigli ed accordi con il gruppo di Ferrara, pervenuti per altre vie alla stessa conclusione, c!he si sarebbe ottenuta una maggiore Bifferenziazione dei campio- nx "border" variando non solo la curva standard ma anche il fatto- ce di diluizione dei sieri da esaminare 1:500. mesti accorgimenti avrebbero consentito di migliorare la sensibi- 11th del metodo con conseguente maggiore discriminazione dei sieri nellearea border-line, senza variazione della specificità.

In pratica e in accordo con gli altri operatori delleindagine policentrica, la procedura analitica al termine della sua modifica prevedeva diluizione dei sieri in esame 1:500 (anzichè 1:5000) e lettura contro una curva standard ai punti 15, 30, 75, 150 ~.~./ml. I campioni che fossero risultati fuori scala sarebbero stati rite- stati dopo opportuna diluizione con siero sicuramente negativo.

Si è concordata la raccolta di 91 sieri opportunamente selezionati nei centri di Treviso, Ferrara, Palermo con concentrazioni definite *lbordert' di IgG anti-toxoplasma (10-30 U.~./rnl) con le seguenti metodiche: IFA, AD,Dye-Test. Tutti i campioni sono stati eseminatj in cieco.

I risultati complessivi delleindagine saranno oggetto di una nota cumulativa, qui vengono riferiti solo i dati del centro di Treviso ritenuti significativi per la loro omogeneità e correlazio ne.

Risultati

I1 confronto delle curve di riferimento ottenute con la tecnica operativa fornita dalla ditta e quella qui proposta è espresso nelle figure 1-2 in cui in ordinata è riportata la klensità atti ca (D.O.)a 492 nm.ein ascissa la concentrazione degli standard e- spressa in U. 1./ml. Più in dettaglio,se consideriamo la D.O.come parametro coatante nei due &iagrammi,si osserva che nella figura 1,nelleambito del range di D.O. 0.100-1.000 si distribuiscono i valori fino a 400 U.I./ml,mentre nel grafico 2 a D.O.=1.000 corrispondono 65-70 U.I.

Per questa diversa sensibilità,nella curva costruita sugli standard 15-1500 U.I./ml,modeste differenze di D.O. comportano specie nelleambito basso: 1) non completa riproducibilith degli standard: 2) notevoli variazioni di concentrazione e quindi di significato tra i capipioni in esame.

I1 notevole ampliamento della curva ottenuto con la diluizio - ne 1:500 si traduce invece in più sicura differenziazione nello

Fig. 1 - Curva di taratura con diluizione 1:5000

Fig.

1.800 -

1.600-

1.400-

1.200 - 1.000-

10 30 50 70 90 110 130 150 U. I . 2 - Curva di taratura con diluizione 1:500

Discussione

Dalleesperienza del laboratorio di Treviso il test EIA (ETI- TOXOK), eseguito secondo i criteri previsti per una più ampia di- stinzione nelllambito dei titoli deboli di IgG specifiche (diluizione dei sieri 1:500 e curva fino a 150 U.I./ml) ha fornito buo- ni risultati in assoluto e in confronto con i test di riferimento, tale da essere proficuamente utilizzato come test di screenig.

Ci sembra tuttavia sempre consigliabile, secondo i principi generali delleindagine di massa, abbinare al test EIA un altro test per un confronto reciproco, che per nostra esperienza, identi- fichiamo con lsagglutinaeione diretta nelle sue varie modalità di impiego.

BIBLIOGRAFIA

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IWEYIONE ACCIDENTALE DA CRYPTOSPORIDIUM SP. NELL'UOMO IN LABORATORIO : SEGNALA- 'IONE DI UN NUOVO CASO

,, Visconti (a),G. Canestri-Trotti (a) & S. Pampiglione (b)

( 3 ) Istituto di Malattie Infettive,Profilassi e Polizia Veterinaria (Facoltà di Medicina Veterinaria), Università di Bologna

(h) Cattedra di Parassitologia (Facoltà di Medicina Veterinaria), Università di Bologna

giassunto.- Si descrive un caso d'infezione da Cryptosporidium sp. occorso accidentalmente in laboratorio in uno degli autori in cui si é potuto confermare la diagnosi anche mediante l'infezione sperimentale di topini a partire da oocisti eliminate dal paziente.

Summary (An accidental laboratory infection in man with Cryptosporidium sp.: a new case report).- The authors report an accidental laboratory infection of one of the authors with Cryptosporidium sp. The diagnosis has been proved with experimental infection of mice using oocysts eliminated from the patient.

Introduzione

I protozoi del genere Cryptosporidium hanno acquisito improvvisa notorietà in questi ultimi anni,dopo che alcuni autori hanno incominciato a riconoscerne il ruolo patogeno nelle diarre neonatali bovine (1) ed ora sono considerati causa di diarrea in numerose specie animali,uomo compreso.

I1 primo caso umano di criptosporidiosi é stato osservato negli Stati Uniti nel 1976 (2) e ad esso, hanno fatto seguito, fino all'ottobre 1983 le segnalazio- ni di altri 95 casi di cui 1 anche in Italia (3 ,4) .

Scopo di questa comunicazione é quello di riferire su di un caso di infezione da Cryptosporidium sp. occorso accidentalmente in laboratorio,in persona in buona salute (uno degli autori),in cui si é confermata la diagnosi anche con una infezione sperimentale realizzata in topini a partire da oocisti eliminate dal paziente.

Materiali e Metodi

La sintomatologia acuta é esplosa in un soggetto di sesso femminile 27enne dopo circa 52 ore dall'esposizione al possibile contagio (infezione accidentale durante la preparazione di campioni di feci bovine positive per Cryptosporidium sp.) ed é stata caratterizzata da :nausea,borborigrni,sonnolenza e dolori addominali molto forti,a crisi di breve durata,senza diarrea.Al ZOgiorno si é manifestato un attacco di diarrea acquosa ed essendosi subito sospettato un nesso tra diarrea

e manipolazione di feci contenenti oocisti di Cryptosporidium ad un esame delle feci e delxa formula leucocitaria,dove si é

sp. ,si é proceduto rilevata una modica

neutrofilia.Tra il Z0 e il 3"giorno si é osservato un lieve rialzo febbrile (37,2 OC)durato poche ore ed il persistere dei dolori addominali,sempre a crisi ripetute e molto intense. Alla fine della terza giornata,la sintomatologia diarroica é scomparsa e le manifestazioni dolorose si sono notevolmente attenuate. Al 4Ogior- no ogni sintomo 6 scomparso,permanendo solo un lieve stato dtinappetenza,seguito da un breve periodo di coetipazione.

Campioni fecali sono stati raccolti per 20 giorni a partire da circa 22 ore dall'inizio della sintomatologia e aa circa 74 ore dalla presunta infezione.

I campioni fecali sono stati esaminati previe arricchimento per sedimentazione e flottazione con liquido di Sheather e realizzazione di strisci di mat;e- riale fecale,arricchito per sedimentazione,colorati con metodi di Ziehl-Neelsen modificato ed Heine.

I campioni positivi,addizionati a bicromato di potassio al 2,5%.e conservati a 4OC per 103 giorni (5),sono stati impiegati per le prove d'infezione sperimen- tele in topini.Tale materiale,al momento dell'utilizzazione,é stato sottoposto a 3 ripetuti lavaggi in acqua e 0,l m1 di sedimento fecale é stato somministrato per via orale a 5 topini,appena divezzi,di una stessa nidiata,risultati fino ad allora coprologicamente negativi per oocisti di Cryptosporidium sp. Ugualmente negativi sono risultati la madre ed altri 2 topini della stessa nidiata che sono stati tenuti di controllo.Tutti i topini sono stati esaminati coprologicamente 2 volte al giorno e 7 giorni dopo l'inoculazione sono stati sacrificati.Gli inte- stini,dal duodeno al retto,sono stati immediatamente fissati in formalina tampo- nata e con essi si sono allestiti preparati istologici.

Risultati

Sono risultati positivi per oocisti di Cryptosporidium sp. i campioni di feci del soggetto colpito prelevati dal Z 0 al 7 O giorno dalla comparsa dei sintomi e ci06 dal lo giorno di manifestazioni diarroiche;rare oocisti si sono reperite nei campioni da11'8O al 14°giorno e negativi i campioni successivi.

Dei topini infettati sperimentalmente,4 sono risultati positivi per oocisti di Cryptosporidium sp. comparse nelle feci dopo 3 giorni dal pasto infettante,fino alla soppressione. Uno dei 5 topini infettati é morto circa 40 ore dopo il pasto infettante.Gli esami coprologici nei topini di controllo e nella madre si sono mantenuti negativi per tutta la durata delle prove. Gli esami istologici sono risultati positivi per 4 dei 5 topi infettati,mentre in quello morto dopo 40 ore e nei topi di controllo sono risultati negativi.

Discussione

Questo caso non si é discostato sostanzialmente nel suo decorso da quello osservato in precedenza nel nostro Istituto (4) e sembra anche avere notevoli ana- logie,per quanto riguarda le manifestazioni cliniche,con quanto riferito da altri autori,che hanno ee@mlato casi simili in persone immunocompetenti (6,7,8).

L'infezione acquisita da materiale di provenienza bovina e trasmessa a topi, ronferma la scarsa specificità di questo protozoo,almeno nei mammiferi (9).~'av- vrnutn infozione,maLgrado le norme di precauzione igieniche abituali,seguite dal iogget;t:o colpito,durante la manipolazione dei campioni fecali di bovini infetti,

<iiamstra l'estrema facilita di contagio ed impone,per chi lavora in laboratorio .:m tale parassita,estrema attenzione.

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9. LEVINE,N.D. 1984. Taxonomy and review of coccidian genus Cryptosporidium (Protozoa,Apicomplexa). J.Protozoo1. 31: 94-98.

AU MICROSCOPE OF'rIQUE. TON DE CHALVARDJIAN ET

Anrr 1st. Super. Sanità Vol. 22, N. 1 (1986). pp. 243-246

Parasitologie et Mjcologie, Facuite de decine, F - 06 034 - Nice Céàex

RESUME : La fréquence de la pnemnie à Fneumxystis carinii est liée au nanbre croissant de patients immuiodéprimés. Nous réalisons le diagnostic de certitude

par la coloration de Chalvardjian et Grawe après prélèvmt par lavage bronchc-

alvéolaire . XMWRY : Incidence of Fneumocystis carinii pnemnia is actuaily higher. This

fact is related to the more frequent patients with immuicdeficiency. The Chal-

vardjian and Grawe stain after bronchopUlm0na-y lavage is our mthcd of direct

positive diagnosis.

I M n O W r n O N

La place taxonanique de Pneumxystis carinii, Delan& et De1anc.S 1912, est

encore mai définie. La majorité des auteurs pense que c'est un protozoaire qui

vit habituellemnt dans l' alvéole puimonaire de nanbreux mcmmifères. La baisse

de lthmmité pemt sa multiplication et le rend pathcgène.

En patholcgie hwnaine, Pneumxystis carinii ccnipe une place de plus en

plus importante en raison du nanbre croissant de malades irmnuicdéprimés ( 3 ). La population à risque est constituée par les noweaux nés prématwh, les déficits immuiitaires congénitaux, surtout les cancéreux sous chimiothérapie ou radiothé-

rapie, récemnent les sujets atteints de S.I.D.A.

Le diagnostic de pdsanption est, en général sur un terrain à risque, l'ap

parition d'une insuffisance respiratoire progressive avec à la radiographie un infiltrat rétinil+ncdulaire bilatéral prédcpninant aux hiles.

Le diagnostic de certitude repose sur la mise en évidence du parasite qui se présente sous deux foms :

- des foms à paroi mince que certains appellent "trophozoltesv de très pe- tite taille (2 p de didtre ). Elles sont très difficilmt identifiables

dans un but diagnostique.

- des foms à paroi épaisse ou kystes dont il existe plusieurs aspects. C1est la mise en évidence de ces kystes qui pemt le diagnostic.

LE PRELGVEMENT

La mise en évidence des kystes est conditionnée par la qualité du prélève-

m t . Tous les auteurs s'accoràent pour considérer le lavage bmnchoalvéolaire

rane la technique la plus adaptée. La biopsie pulmonaire donne également de bons résultats mais nlest pas toujours réalisable. Quant aux expectorations ou

à l'aspiration bmnchique il est illusoire de vouloir y rechercher le parasite (2 1. Le prélèvement sera traité différemnent stil s'agit de biopsies ou de li- quide~. Pour les biopsies, on séparera deux fragments. L'un destiné à l 'examen histolcgique montre dans les cas pocitifs une alvéolite spécifique avec exsu-

dats en nid d'abeille ; avec l'autre fragment on pratique des appositions sui.

lame. Pour les liquides de lavage, après centrifugation à 2500 tours/mn pendant

5nm, on dépose le culot sur lame et on laisse bien sécher avant fixation. L ' IDENPIFIGATION Nous avons caparé les différentes techniques dtidentification pour déter-

miner la plus fiable, la plus facile et la plus rapide d'exécution (6). Dans ce

but nous provoquons selon le pmtocole de MOJON ( 5) une maladie expérimentale chez le rat blanc par injection d'acétate dvhydrccortisone à la dose de 125 W/ kg, 2 fois par semaine pendant 8 semaines avec addition à l'eau de boisson d'e

xytétracycline à la dose de 50 rq/100 ml d'eau.

P& les techniques décmtes nous retenons :

- la coloration de CHALVAIIDJIAN et GRAWE (1 ) dont nous rappelons la réali-

sation :

Matériel Le Réactif de sulfatation

On prépare du Wet Ether à partir de 25 m l d'éther sulfurique et de 10 ml

d'eau déminéralisée dans une ampoule à dkanter. AprPs agitation vigoureuse la séparation en deux phases s 'effectue. Après élimination de la phase aqueuse et

de quelques ml de phase éther, on obtient le Wet Ether. On dispose 25 m l de Wet

Ether dans un kipient placé dans de la glace pilée et on laisse filer très

lentement le long d'une baguette de verre 25 m l d'acide sulfurique concentr-6. On obtient ainsi le réactif de sulfatation qui se conserve plusieurs mois à +40 dans un flacon bien clos.

La solution de Bleu de Toluidine O ccsnprend :

Bleu de Toluidine O pulvérisé 32 W Eau d&ninéralisée 60 nil

Acide chlorhydrique 1 N 2 ml

Alcool absolu 140 ml

Méthcde : On colore en temps une lame thin positif

F o m l à 10 % fixation 10 mn Réactif de culfatation 5 mn

245

Eau courante - lavage 3 m Bleu de Toluidine O 3 mn Alcool isopmpylique 3 bains rapides

Xylène 2 bains

Montage au Ba~mie du Canada Apds repérage à l 'objectif 40, cfest à l 'objectif 1M) (xl000) que l'ori

visualisera l e s 2 Srpes de kystes de couleur violet pourpre sur un fond bleu.

Certains sont bien Iwids avec une zone plus scmbre, dtautres sont pluc ovalai-

res en cupule ou en croissant (cf . photo ). Les différences mrpholcgiques sont

également o b s d s avec l es techniques d'imprégnation argentique c m cel le

de ~ R I 4 E W i T (4) e t ses dérivés ( 7 ). CONCLUSION

Le diagnostic de l a pnemnie à Pne~nriocyctis car ini i repose sur un pdlè-

venent de qualité à partir de lavages alf6olaires ou éventuellement de biopsies

puIrnonaires . Nous le da l i sons a part ir de la coloration de CHALVAPDJIAN e t GRAWE qui

est fiable et facilement réalisable.

BIBLIuaZAPHIE ---- I - c;lWvAFDJIAN (A.M. ), GRAWE (L.A. ). A new procedure for the identif icat iai

of pnemxmtis camnii cysts i n tisme sectim and snearc. J. Ciin. Pathol.

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I([ CENTI ISOLAMENTI D I NAEGLERIA ED ACANTHAMOEBA SPP. PATOGENE DA UN'AREA TERMA I ! E DEFINIZIONE BIO-IMMUNOLOGICA DI NAEGLERIA AUSTRALIENSIS ITALICA (DE JONCK - IKERE ET AL., 1984)

M.Scaglia (a), R.Brustia (a), S.Gatti (a), M.Strosselli (a), A.M.Bernuzzi (a), .l.F.De Jonckheere (b)

( a ) I s t i t u t o d i C l in ica de l l e Malat t ie In fe t t i ve ; Universi tà d i Pavia - IRCCS I ~ o l i c l i n i c o "San Matteo'' - 27100 PAVIA i b ) Department o f Microbiology - I n s t i t u t e o f Hygiene and Epidemiology; Universi t y o f Bruxelles - Bruxelles (Belgium)

Amebe anfizoiche a d i f fus ione cosmopolita, appartenenti a l l a specie Naegleria fowler i ed a l genere Acantharnoeba, sono s ta te descr i t te r ispett ivamente qual i agenti e t i o l o g i c i d i forme meningoencefalitiche a decorso acuto e sub-acuto/cro nico. Recentemente una nuova specie, Naegleria austral iensis, patogena sperime; talmente, é s ta ta i d e n t i f i c a t a da De Jonckheere (1981 ) i n base a studi imnunolo g i c i ed immunoenzimatici. Nel corso d i r icerche condotte i n una stazione terma- l e del Nord I t a l i a , abbiamo i so la to 6 ceppi patogeni d i Acanthamoeba spp. e 5- apparteneti a l genere Naegleria. I campioni d i acqua e fango provenienti da 17 piscine termal i ed a l t r e t t a n t i bacini d i fango usato a scopi terapeut ic i , sono s t a t i incubat i a 37OC e 45OC, a l f i n e d i selezionare ceppi e/o specie te r rno f i l i p iù s u s c e t t i b i l i d i dimostrarsi patogeni, su NN-agar a l 3% batter izzato i n su p e r f i c i e con E.coli. I ceppi d i Acanthamoeba i s o l a t i sono s t a t i ident i f icat i , mediante studi immunoenzimatici, come apparteneti a l l e specie A.lugdunensis ( 2 ceppi 1, A.caste1 lan i , A.polyphaga (2 ceppi) ed A.hatchetti . Uno studio morfo-biologico ed imnunenzimatico p i ù approfondito é s ta to condotto, i n collaborazione con il D r . De Jonckheere, sui ceppi d i Naegleria i s o l a t i . Ta l i studi hanno permesso d i i den t i f i ca re 2 ceppi come apparteneti a l l a specie non patogena N.lovaniensis, e 2 ceppi come apparteneti a l l a specie patogena N-austra- l i ens is . Carat ter is t iche del t u t t o pecu l ia r i sono s ta te invece evidenziate per l ' u l t i m o ceppo isolato, compendiabili nel f a t t o che r i su l t ava p iù sensibi le a l l e a l t e temperature d i incubazione, ottimamente adattabi le all 'axenizzazione e dotato d i spiccata virulenza i n v ivo ed i n v i t r o . Queste carat ter is t iche, i n - sieme a l p r o f i l o imnunoenzimatico che r i ve lava una s t r e t t a somiglianza con ~ .aus t ra l i ens i s , seppu non una per fe t ta iden t i c i tà , hanno condotto a l l l i d e n t i f i cazione d i una nuova sub-specie: N.australiensis s.sp.i tal ica (De Jonckheere - e t a l .- J.Protozoo1. 31 (2) : 324-331 ; 1984). -

Acute and sub-acute/chronic meningoencephal i ti s in fect ions due t o soi l f ree- l i ving amoebae Naegleria fowler i and Acanthamoeba spp., have been reported worid - wide. Recently, De Jonckheere (1981) i d e n t i f i e d a new pathogenic species o f Naegleria, N.australiensis by immunologic and immunoenzymatic methods. Six pathogenic s t ra ins o f Acanthamoeba spp. were iso la ted during fu r ther inves t i -

gations carr ied out i n a Northern I t a l i a n spa by our group. Severa1 samples o f po l lu ted waters and mud were drawn from 17 thermal pools and 17 mud basins nor mal l y used f o r therapeutic purposes. Samples were s t r a t i f i ed onto non-nutri e n t agar 3% medium, bacterized wi th E.coli. The specimens were then incubated a t 37°C and 4 5 O C t o select only the thermophilic s t ra ins and/or species more l i k e l y t o develop pathogenicity. The Acanthamoeba s t ra ins were i den t i f i ed by imnuno - enzymatic studies as A. lugdunensis (2 s t ra ins ) , A.caste1 l ani, A.polyphaga (2 s t ra ins ) and A.hatchetti. More deta i led morpho-biologic and immunoenzymatic s tu dies were carr ied out on Naegleria isolates, i n col laborat ion w i th Dr . De ~ o n c k heere. Two pathogenic s t ra ins o f Naegleria austral iensis and two n ~ n - ~ a t h o ~ e n i c s t ra ins o f N.lovaniensis were iden t i f i ed . The l a s t s t r a i n showed very pecul iar features: s e n s i t i v i t y t o high incubation temperature; f e a s i b i l i t y o f c u l t i v a t i n g i n axenic media; high i n v ivo and i n v i t r o virulence. A s im i la r i t y , bui. not an iden t i t y , w i th N.australiensi s was revealed by the imunoenzymatic~ p r o f i - le. These features a l lowed us t o i d e n t i f y a new sub-species: N.austra1 iens i s s .sp. i ta l ica (De Jonckheere - e t a l .- J.Protozoo1. 31 (2 ) : 324-331; 1984).

AN lat . Supm MSM(td Vol. 22. N. l(1986). pp. 249-252

L. Grassi jr. (a), R. Gatti (a) & I. de Carneri (b)

(a) Ospedale Niguarda-Ca' Granda, Milano (b) Sezione d'Igiene, Dipartimento

di Medicina Preventiva, Occupazionale e di Comunità, Universita di Pavia

Riassunto.- Nel 1984 in un grande ospedale della periferia milanese la ri-

cerca dei protozoi orali mediante coltura in pazienti ricoverati per altri

motivi mostrò una prevalenza del 33% di tricomoniasi e del 56% di amebiasi

orali. Non risultarono correlazioni tra queste infezioni e parodontopatie;

ma la scarsa igiene orale poteva aver favorito la presenza dei protozoi.

Tali eventuali correlazioni andrebbero studiate in popolazioni a più accurata

igiene orale.

Summary.- (Ora1 protozooses found in 1984 at the Niguarda-Ca' Granda Hospital

in Milan). In 1984 in a large suburban milanese hospital, culture tests for

ora1 protozoa from patients admitted for other reasons showed a prevalence

of 33% trichomoniasis and 56% ora1 amoebiasis. There was no correlation

between these infections and periodontopathies, but poor ora1 hygiene may

well have favoured the presence of the protozoa. Any such correlation might

be worth investigating further in populations with better ora1 hygiene.

Materiali e Metodi

Tra fine febbraio e metà marzo 1984 abbiamo esaminato mediante coltura

a 37"C in terreno bifasico di Robinson (l), con letture microscopiche ese-

guite quotidianamente per 6 giorni, 103 pazienti ricoverati in vari reparti

delllOspedale Niguarda-Ca' Granda di Milano, per la ricerca delle protozoosi

orali. L'età variava dai 10 agli 81 anni; 60 soggetti (58%) erano maschi

e 43 (42%) femmine. L'igiene orale risultò in media scadente.

Risultati

La prevalenza di infezioni da Trichomonas risultò del 33% e

quella di Entamoeba gingivalis del 56%. Settanta soggetti (68%) risulta-

rono parassitati, per un totale di 92 infezioni: infatti il 21% aveva en-

trambi i protozoi. Le due prime tabelle mostrano le prevalenze per gruppi

di età. rispettivamente per i maschi e per le femmine: non si nota un

rapporto tra età e parassitismo orale. Dalla Tab. 3 risulta che nel no-

stro campione non v'è correlazione tra le due protozoosi, ognuna potendosi

presentare indipendentemente dalla presenza o assenza dell'altra.

Tab. 1. - Maschi

Prevalenza nei gruppi di età

amebe trichomonas a + t a m i n. n. % n. % n. %

fino a 30 13 7 54 4 3 1 2 15

31 - 40 8 5 62 3 37 2 25

41 - 50 9 6 67 4 44 3 33

5 1 - 60 15 9 60 4 27 3 20

61 e più 15 9 60 3 20 3 20

Totale 60 36 60% 18 30% 13 22%

Tab. 2. - Femmine

Prevalenza nei gruppi di età

amebe trichomonas a + t anni n. n. % n. % n. %

finoa30 7 3 43 4 57 2 29

31 - 40 8 7 87 5 62 4 50

41 - 50 7 2 29 3 43 2 29

51 - 60 8 4 50 3 37 1 12

61 e più 13 6 46 1 8 O -

Totale 43 22 52% 16 37% 9 21%

Sui 103 soggetti esaminati, 7 1 (69%) presentavano parodontopatie; 25

di questi (35%) erano parassitati da -- T. tenax e 46 (65%) da - E. gingivalis.

L'elaborazione statistica di tab. 4 mostra che le due parassitosi interes-

sano indifferentemente i soggetti sani a quelli affetti da parodontopatie.

Le infezioni doppie sono equamente distribuite tra parodontopatici (21%)

e no (21%) .

Tab. 3. Correlazione tra infezioni di amebe e trichomonas orali

E. gingivalis

+ -

T. tenax

- 36 33 69

58 45 103 2

X = 1,58 GL- 1 P>0.05 NS

Tab. 4 . Frequenza delle parodontopatie nei 58 casi di amebiasi e 34 casi

di tricomoniasi orale (totale: 92 infezioni su 70 soggetti parassitati;

in 22 di essi erano presenti entrambi i protozoi).

Parodontopatie

+ -

E. gingivalis - 46 12 58

T. tenax -- 25 9 34

Discussione

In conclusione, il nostro studio ha messo in evidenza solo un'alta pre-

valenza di queste due protozoosi orali nell'ambiente ospedaliero della pe-

riferia milanese da noi preso in considerazione, dove gran parte dei soggetti

risultò praticare un'insoddisfacente igiene orale. Forse a causa di questo

stato di cose non fu qui possibile evidenziare correlazioni tra queste due

frequenti protozoosi e le ancor più frequenti parodontopatie. Per mettere in

evidenza un'eventuale correlazione sembrerebbe più opportuno prendere in con-

siderazione popolazioni di sezioni urbane a più alto livello socioeconomico,

presumibilmente adeguatesi ad una più accurata igiene orale ma ancora caratte-

rizzate da frequenti parodontopatie.

Bibliograf ia

I. de Carneri 1984. Parassitologia Generale e Uhna. CEA. Milano, 385 p.

Ann I& Super. Sanità Vol. 22, N. 1 (1986),pp. 253-256

RILIEVI SU UN POSSIBILE RUOLO PATOGENO DI TRICAOMONAS TENAX NELLA PARADONTITE CRONICA

A. Ferrara. R. Conca, L. Grassi jr. & I. de Carneri

Sezione di Igiene, Dipartimento di Medicina Preventiva, Occupazionale

e di Comunità. Università di Pavia

Riassunto. - Uno studio delle protozoosi orali nella paradontite cronica condotto in uno studio odontoiatrico del centro di Milano mostra tendenza

ad una correlazione con Trichomonas e, il quale è invece assente nelle

gengiviti marginali. Nessuna correlazione si nota con Entamoeba gingivalis.

Summary. - (Investigation of a possible pathogenic role of Trichomonas in chronic paradontitis). Findings in chronic paradontitis in a dental surgery

in the centre of Milan indicate a tendency towards a correlation with

Trichomonas e. which on the other hand is absent in margina1 gingivitis.

No correlation is noted with Entamoeba gingivalis.

Introduzione

Mentre fioriscono gli studi di batteriologia orale. la protozoologia

orale è praticamente trascurata, nonostante l'alta prevalenza delle infezioni

da Trichomonas tenax ed Entamoeba gingivalis negli adulti. Problema priorita-

rio sarebbe il cercare correlazioni tra dette protozoosi e stato dei denti e

delle gengive.

Materiali e Metodi

Dall'ottobre 1981 al giugno 1982 furono esaminati mediante prelievo di

materiale ricavato dalla placca batterica e insemenzamento in terreno bifasi-

co di Robinson 59 soggetti tra i 25 e i 60 anni. 29 maschi e 30 femmine, pre-

sentatisi ad uno studio odontoiatrico nel centro di Milano. 14 soggetti si

potevano definire sani dal punto di vista dello stato dei tessuti di supporto

del dente, 14 erano affetti da gengivite marginale e 31 da parodontopatie.

I1 prelievo fu sempre duplice in ogni soggetto: infatti in due provette di

coltura venne apportato materiale prelevato sia dalla placca sopragengivale

sia da quella sottogengivale. In uno dei 31 soggetti con parodontopatia i

due prelievi furono ripetuti dopo un mese dall'intervento chirurgico para-

dontale. Le provette insemenzate vennero incubate a 37* per 6 giorni ed eaa-

minate quotidianamente a fresco a 100 X per la ricerca di Trichomonas

e di Entamoeba gingivalis.

Risultati

Dei 59 soggetti esaminati. 11 (18,6%). risultarono parassitati dal fla-

gellato e 33 (55,9%) dall'ameba. Le amebe risultarono presenti con prevalenze

non molto diverse nei vari gruppi di età: 40% nei 10 soggetti tra i 25 e i

30 anni. 67% nei 9 soggetti dai 31 ai 40 anni, 67% nei 21 soggetti da 41 ai

50 anni e 47% nei 19 di età compresa tra 51 e 60 anni. Invece i tricomonas

sono assenti nei due gruppi sotto i 40 anni ed hanno prevalenze del 29% e del

26% nei due gruppi di età superiore.

Non v'è correlazione statisticamente significativa tra tricomoniasi ed

amebiasi orali nei singoli soggetti (tab. l) .

Tab. 1 - Correlazione tra le due protozoosi orali in 59 pazienti di uno studio odontoiatrico del centro di Milano.

E. gingivalis - + -

+ 6 5 11

T. tenax -- - 27 2 1 48

33 26 59 - 0,055 GL- 1 NS

La tricomoniasi è assente nei casi di gengivite, è rara sei soggetti sa-

ni ed è più di 4 volte più frequente nei casi di parodontopatie che nei sog-

getti sani (tab. 2). La differenza tra i 14 soggetti sani e i 45 affetti da

gengivite e parodontopatie non è significativa (test esatto di Fisher P-0.014).

Invece l'amebiasi non mostra differenze di distribuzione tra i due gruppi (50%

tra i sani, 64.3% nel gruppo con gengiviti e 54,8% nelle parodontopatie; X 2

con correzione di Yates=O,I6, G.L. = 2, NS).

Tab. 2 - Correlazioni di supporto del dente

di Milapo. Si veda la

tra tricomoniasi e amebiasi orali e stato dei tessuti

in 59 pazienti di uno studio odontoiatrico del centro

valutazione statistica nel testo.

Soggetti Totale T. tenax E.gingivalis

n. % n. %

--

Sani* 14 l 7 . 1 7 50

Gengivite 14 O - 9 64.3

Parodontopatie 31 10 32.3 17 54.8

Totale 59 11 19% 33 56%

* dal punto di vista dei tessuti di supporto del dente Su 11 casi di tricomoniasi, 4 risultarono positivi solo in una delle

due localizzazioni studiate: in 1 caso risultò positiva solo la placca sot-

togengivale e in 3 solo quella sopragengivale. La metà (17) dei 33 casi di

amebiasi risultò positiva solo in una localizzazione: 9 nella placca sotto-

gengivale e 8 in quella sopragengivale. L'unico caso di parodontopatia con-

trollato prima e dopo l'intervento chirurgico parodontale risultò positivo

per entramb'i i protozoi in entrambe le placche prima dell'intervento, men-

tre a un mese di distanza dallo stesso risultò del tutto negativo.

Conclusioni

Trichomonas tenax non è qui implicato nelle gengiviti marginali. dove

l'ambiente risulta sfavorevole al suo attecchimento; è invece presente nel-

le parodontopatie, con frequenza più di 4 volte maggiore che nei soggetti

sani. Tuttavia questa differenza non raggiunge il livello di significativita

e solo l'aumento della casistica permetterà di chiarire la situazione ed

eventualmente di assimilare, per quanto riguarda l'ecologia di Trichomonas

tenax, i soggetti con gengivite marginale con i soggetti sani (nel qual caso

la correlazione tricomoniasi-parodontopatie qui diverrebbe significativa).

La prevalenza di Entamoeba gingivalis è qui così costante che nessuna

conclusione possiamo trarre sulla sua ecologia e sul suo eventuale ruolo

patogeno. Ricordiamo che in altri studi abbiamo mostrato l'aumento della

sua prevalenza con l'età a partire dall'infanzia. probabilmente in rapporto

al progressivo deteriorarsi dell'apparato stomatognatico.

Ann II* Super. &nM) Vol. 22, N. 1 (1986), p$. 257-260

ANCORA SULLE PSEUDO-EMOGREGARINE UMANE

I. de Carneri (a), V. Luppino (b), M. Meregalli (b) & E. Dell'Orto (b)

(a) Sezione di Igiene, Medicina Preventiva, Occupazionale e di Comunità

dell'università di Pavia, (b) Ospedale di Garbagnate

Riassunto. - In uno striscio del sangue di una contadina lombarda sono comparsi pseudoparassiti falciformi mimanti Plasmodium falciparum. sol-

levando in un primo tempo. dubbi diagnostici. Si ricordano le discussioni

di sessant'anni fa sulle pseudo-emogregarine umane.

Summary. - (More concerning pseudo-haemogragarines from man). Falciform

pseudoparasites simulating Plasmodium falciparum were found in a blood

smear taken from a farm worker. and initially gave rise to diagnostic

doubts. The discussions on pseudo-haemogregarines which took place sixty

years ago are recalled.

Introduzione

Secondo Levine (1) le emogregarine (famiglia Haemogregarinidae)

comprendono circa 400 specie di protozoi parassiti, tra le 4300 che

formano il phylum Apicomplexa: ma non vi sono emogregarine parassite

dell'uomo. La loro esistenza è stata autorevolmente esclusa da Wenyon

nel 1926 (2,pp. 1115 e segg.). Emile Brumpt (3. pp. 551 e segg.; egli

mette addirittura tra queste spurie "emogregarine" anche un reperto

che Castellani reputò - e probabilmente é - riferibile a Toxoplasma) conferma le conclusioni di Wenyon, che ci sono state recentemente

ribadite da Garnham (4) e da Corradetti (5).

Come emogregarine umane sono state descritte da vari autori degli

pseudococcidi lunghi tra 6 e 20 um (ma Raffaele, 6, nel 1928 ha descrit-

to invece cellule lunghe solo 3-5 um), arcuati, mononucleati. di norma

extracellulari. che sporadicamente, con estrema rarità, si notano negli

strisci di sangue preparati ad es. per la normale ricerca dei parassiti

malarici e colorati ad es. con Giemsa. Il'loro citoplasma si colora

in azzurro ed il nucleo, talvolta granulare, in rosso. Tipico è il

notare poche forme isolate in un preparato e il non riuscire più ad

evidenziarne altre in ripetuti prelievi ematici ed esami condotti sul-

lo stesso soggetto. La conclusione di Wenyon è che "tutte queste sup-

poste emogregarine sono in realtà cellule vegetali di origine estranea".

Si tratterebbe insomma di grossi lieviti o organismi vegetali come

Polytoma uvella, che vengono apportate sul vetrino dalle dita insuf-

ficientemente lavate del soggetto sottoposto a prelievo o che possono

contaminare ivetrini o i liquidi usati nel processo di colorazione.

Secondo Gamham. che in passato ebbe qualche perplessità di fronte a

simili reperti, queste cellule sono Gram-positive, contrariamente ai

protozoi (con l'eccezione dei mixosporidi). Ma purtroppo, dopo aver

notato qualche forma del tipo colorata secondo Giemsa, risulta di norma

impossibile riotteneme per continuare lo studio con altre colorazioni.

Materiali, metodi e risultati

I1 nostro reperto sta in uno striscio di sangue colorato secondo

Giemsa, ottenuto il 27/7/1983 nel laboratorio dell'ospedale di Garbagnate,

preparato per determinare la formula leucocitaria di B. S., contadina di

65 anni, ricoverata per ipertermia (39') ricorrente da circa un mese, di

natura da determinare, accompagnata da brividi e che regrediva spontanea-

mente dopo circa 24 ore. Non fu rilevato nessun altro sintomo: milza e fe-

gato normali. Assenza di precedenti riscontri di parassitosi. La paziente.

abitante a Solaro (Mi), non ha mai compiuto spostamenti né fuori provincia

né all'estero. Gli esami ematologici mostravano V.E.S. modicamente aumen-

tata (I.K. 22,s) e leucocitosi neutrofila (16.800 bianchi, 81% neutrofili).

Toxotest ripetuto più volte e sempre negativo; IgM as senti. anche a mesi

di distanza. Dopo il reperto microscopico sottode scritto e prima di una

approfondita valutazione parassitologica, la paziente fu ospedalizzata

per un mese con sospetto di malaria da Plasmodium falciparum; tutti gli

esami specifici risultarono però negativi. come era da attendersi in

base all'anamesi geografica del tutto inconsistente con un'infezione

malarica. ed essa venne dimessa con diagnosi di ricorrenti infezioni

delle vie urinarie (urinoculture ripetutamente positive per Klebsiella

ozaenae), risolte con ampicillina.

Le pseudo-emgregarine umane da noi messe in evidenza in questa

occasione si presentano come 4 corpi arcuati disposti a schiera

convergente, con un'estremità affusolata e l'altra ottusa, lunghi

da 8 a 10 um, larghi da 1.2 a 2 um, dal citoplasma colorato in azzurro.

I1 nucleo è sferico, di 1,2 um di diametro, colorato in rosso, situato

in 2 casi in posizione centrale e in altri 2 casi a 3/5 e a 2/3 dalla

estremità anteriore della cellula.

Discussione

E' da notare l'attività agricola cui era dedita la contadina in og-

getto. Raffaele (1928) ricorda l'origine rurale di molti dei soggetti da

lui esaminati a Roma, tra 20.000 dei quali notò un solo caso simile al

nostro. Egli ricorda anche un'osservazione di Wenyon, sulla presenza

nelle feci dei conigli di lieviti simili alle nostre pseudo-emgregarine.

Ripetuti prelievi da noi eseguiti nello stesso giorno e nelle settimane

e mesi successivi e l'allestimento di una cinquantina di preparati, nonchè

l'esame dell'acqua e dei coloranti usati, non permisero di reperire altre

forme del tipo e non fu quindi possibile sviluppare ulteriormente lo studio

di questo episodio diagnostico. Si tratta di una rara conseguenza di un

errore preanalitico. Grazie a una rinnovata informazione. i fantasmi delle

pseudo-emogregarine umane non dovrebbero più intralciare il compito del

laboratorista e del clinico.

BIBLIOGRAFIA

1. LEVINE, N.D. 1984. Protozoa of the phylum Apicomplexa. Journal of

Protozoology. 31: 22A-23A.

2. WENYON, C.M. 1926. Protozoology. 2 voll. Baillière, Tindall h Cox, London.

1536 pp.

3. BRUMPT, E. 1949. Précis de Parasitologie. 2 voll. Masson, Paris. 2138 pp.

4. GARNHAM, P.C.C. 1983. Comuhicazione personale.

5. CORRADETTI, A. 1985. Comunicazione personale.

6. RAFFAELE, G. 1928. Su un microrganismo di dubbia natura rinvenuto in un

preparato di sangue umano. Rivista di Malariologia. 7: 267-270.

A m 11t Super. Sanad Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 261.261

LA RICERCA

CONTINUATA

ROUTINARIA DELLE ELMINTIASI INTESTINALI UMANE IN ITALIA VA

ED AFFINATA

I. de Cameri & G. Rodi

Cattedra di Parassitologia, Dipartimento di Igiene, Università di Pavia

Riassunto. - Contrariamente a quanto proposto in Lussemburgo. il pur drasti- co calo delle elmintiasi umane in Italia non autorizza per ora l'abolizione

degli esami coproparassitoscopici di routine. Dal 1980 al 1984, in 18293

soggetti esaminati in 7 ospedali della fascia mediana della Lombardia, risul-

tarono tra l'altro 18 ascariasi e, in 3 degli ospedali. 14 strongiloidiasi.

Andrà anche confermato che, scomparsa la cisticercosi suina, sia stata era-

dicata anche Taenia solium nell'uomo, fonte della cisticercosi umana. Sia

questa tenia (3 casi registrati; ma nell'unico da noi ricontrollato abbiamo

trovato che si trattava di 5 sa~inata) sia Strongyloides stercoralis soprav- vivono nell'uomo anche per decenni. Anche elmintiasi esotiche sempre più

frequentemente arrivano in Italia. La Regione Lombardia ha organizzato corsi

di diagnosi parassitologica per laboratoristi ospedalieri.

Summary.- (Do not suspend routine diagnosis of human helminthiases in Italy).

Though running counter to what was proposed in Luxemburg, the abolition of

coproparasitoscopic examinations cannot be authorized by the decrease of

human helminthiases in Italy, drastic though such decrease may be. An inve-

stigation made in 7 hospitals in a strip across the middle of Lombardy shows

that out of 18,293 patients examined from 1980 to 1984, in addition to common

helminthiases there were 14 cases of strongyloidiasis in 3 o£ the hospitals.

It will also be necessary to confirm beforehand that disappearance of swine

cysticercosis is matched by an effective eradication of Taenia solium in man,

this organism being the source of human cysticercosis. Both Strongyloides

stercoralis and the aforesaid taenia can sumive in man for as long as

decades at a time. To this there has to be added the problem of exotic

helminthiases, which arrive in italy with ever-increasing frequency.

Introduzione

In Lussemburgo (1) è stato recentemente proposto di sospendere la ri-

cerca routinaria delle elmintiasi intestinali umane medianteesame copro-

parassitoscopico. Infatti l'interruzione della trasmissione sembra essere

awenuta poco prima del 1977. Tenuto conto della longevità dei parassiti

non dovrebbero esserci più nel Granducato infestazioni da nematodi (a par-

te gli ossiuri), mentre per le tenie la definitiva scomparsa è stata calco-

lata per il 1987. Nel 1983 la ricerca microscopica richiedeva già 14 ore

di lavoro per rivelare una caso positivo per ascaridi, tricocefali o Taenia

saginata: vermi pericolosi come Strongyloides stercoralis e Taenia solium

erano già scomparsi da tempo. In Lussemburgo è stato perciò richiesto ai cli-

nici di "restringere le richieste (diagnostiche) ai casi altameilte sospetti".

Possiamo prendere una simile decisione ora in Italia? Per saggiare la

situazione abbiamo rilevato nel novembre 1984 i dati disponibili per l'ulti-

mo quinquennio in 7 ospedali lombardi.

Materiali e metodi

Ci fu gentilmente permesso di rilevare i dati registrati nell'ultimo

quinquennio in 7 ospedali lombardi, situati in una fascia che attraversa la

regione da Milano a Corno. Bergamo e Brescia. Ecco qualche dato preliminare

riguardante 18.293 soggetti le cui feci vennero esaminate dal 1980 al novem-

bre 1984. Ovunque si è praticato l'esame a fresco, in 3 ospedali la concen-

trazione con MIF e in 3 la diafanizzazione di Kato (2). Si rilevò il costo

unitario addebitato dai vari ospedali.

Risultati

Va premesso che presumibilmente buona parte di questi esami venne richie-

sta perchè sussisteva qualche dubbio sulla presenza di parassiti: non si trat-

ta perciò di un campione della popolazione normale lombarda. A Rarte i proto-

zoi (271 casi di giardiasi=1.5% e 7 infezioni da Entamoeba hpstolitica-0,04%)

si trovarono 2 infestazioni importate da Schistosoma mansoni, 1 da Bymenolepis

nana, 6 importate da anchilostomi, 1 da Dipylidium caninum, 18=0.1% da ascari-

di, 77~0.4% da tricocefali. 1 da Diphyllobothrium~. 82-0.45% da Taenia

saginata, 27 da grandi tenie non meglio identificate. Vennero registrate 3 in-

festazioni da Taenia solium. ma noi, esaminando le proglottidi dell'unico stro-

bilo parzialmente conservato abbiamo constato che si trattava di- saginata.

In 3 dei 7 ospedali sono stati inoltre diagnosticati 14 casi di strongiloi-

diasi.

I1 costo addebitato per un'analisi è sorprendentemente basso, aggiran-

dosi attorno alle 5.000 lire. I1 costo per esame positivo risulta perciò di

180.000 lire. Segnaliamo che in qualcuno di questi ospedali si ricercano le

amebe anche mediante coltura. al costo di lire 20.000.

Conclusioni

Segnaliamo che durante il quinquennio considerato abbiamo anche noi tro-

vato Strongyloides stercoralis negli orticultori di Lusia in Veneto e che

esso 6 stato.evidenziato ripetutamente a Pavia nella Clinica del Prof. E.G.

Rondanelli. Non si può rinunciare ad una accurata (3) ricerca di questo nema-

tode, che può perdurare per decenni e scatenarsi in caso di immunodepressione.

Sarà anche opportuno attendere conferma dell'awenuta eradicazione di Taenia

solium nell'uomo: a questo punto ogni caso di teniasi andrebbe indagato a fon-

do per evitare confusioni tra - T. solium e saginata, possibili soprattutto

in preparati coartati per fissazione inadeguata che vengano osservati solo ma-

croscopicamnte. Ad esempio, il caso dubbio sopracitato è stato risolto solo

mediante esame iatologico.

Ricordiamo anche che la situazione in qualche areale del Sud potrebbe

essere per ora peggiore di quella evidenziata in Lombardia (4).

Bibliograf ia

1. FOX. E. LIESCH. C. & SCHNEIDER. P. 1984. Eradication of medica1 helminths

for Luxembourg in 19852 Lancet. 1: 1296.

2. de CARNERI. I. BIAGI. P.F. h GAZZOLA. E. 1968. Valutazione del metodo di

Kato nella diagnosi qualitativa e quantitativa di alcune elmintiasi.

Nuovi Annali d'Igiene e Microbiologia. 19: 369-379.

3. PELLETIER, L.L. jr. 1984. Chronic strongyloidiasis in world war I1 Far

East ex-prisoners of war. American Journal of Tropical Medicine and Hygie-

ne. 33: 55-61. - 4. de CARNERI. I. 1983. Parassitologia Generale e Umana, 8a ed. CEA, Milano

385 p.

Ann I l t Supa. %niki Vol. 22, N. 1 (1986kpp. 265.268

C. Daglio (a), L. Lombardo (b), N. Ravarino (C), I. de Carneri (d).

(a) Laboratorio di Analisi, Ospedale Mauriziano, Torino; (b) Servizio di

Endoscopia, Ospedale Mauriziano, Torino; (C) Servizio di Anatomia e Isto-

logia patologica, Ospedale Mauriziano, Torino; (d) Cattedra di Parassito-

logia, Sezione di Igiene. Medicina Preventiva, Occupazionale e di Comunità,

Università di Pavia.

Riassunto. - Si è diagnosticato a Torino un caso di schistosomiasi mansonica

acuta contratto da un tecnico italiano nel lago Kangimi, presso Kaunda. nel

nord della Nigeria. La dinamica dell'infestazione fu seguita mediante oogram-

ma. Questo metodo permise infine di documentare l'esito della terapia con

praziquantel.

Summary. - (Yet schistosomiasis from Africa). Diagnosis was made in Turin of

a case of acute Manson's schistosomiasis contracted by an Italian technician

in Lake Kangimi, near Kaunda in the northern part of Nigeria. The dynamics

of the infection was followed by oogram. Finally, this method enabled the

result o£ the therapy with praziquantel to be documented.

Introduzione

Casi non ancor diagnosticati di schistosomiasi da Schistosoma

haematobium e L mansoni, contratti in Africa. entrano sporadicamente in Italia: in turisti che vengono portati da irresponsabili organizzatori a

bagnarsi a gruppi nelle oasi sahariane (l), in singoli missionari che rien-

trano dal Sudan (2). persino in biologi in missione di ricerca che non resi-

stono alla tentazione di cercare refrigerio in qualche stagno, ecc. Descri-

viamo qui un cas.0 di febbre di Katayama o schistosomiasi acuta, che insorge

dopo 3-6 settimane dall'esposizione della pelle alle cercarie diS.japonicum

o, come nel nostro caso, di mansoni.

In Europa si manifesta quasi esclusivamente in soggetti non immuni di

ritorno da viaggi in aree endemiche tropicali (3).

Materiali. metodi e risultati

I1 18 ottobre 1983 si è presentato presso il nostro laboratorio il

signor R.F. di anni 30, con febbre e inappetenza. Era appena rientrato

in Italia da Kaduna (Nigeria Settentrionale) dove aveva soggiornato per

lavoro per due mesi e mezzo. I1 paziente presentava una leucocitosi 3 (17.000 G.B. per mm ) con spiccata eosinofilia (30%). un indice di Katz

modestamente elevato ( 24 ) , un modesto aumento degli enzimi epatici (WT-19,

GPT-43. GGTs68). una PCR intensamente positiva (+++). Risultò negativo per

malaria e positivo per Entamoeba histolytica in forma minuta nelle feci.

All'esame obiettivo il paziente presentava una modesta epatosplenome-

galia. mentre egli riferiva, oltre a febbre e sudorazione, anche perdita di

peso, inappetenza. dolori addominali, tosse secca ma non diarrea; episodi

diarroici venivano invece riferiti al soggiorno africano. i1 signor R.F.

segnalava inoltre di aver fatto il bagno (una diecina di volte) nel lago

di Kangimi, circondato a qualche distanza da pochi villaggi sparsi e

situato a una trentina di Km da Kaduna.

Un successivo esame delle feci eseguito in data 4/11/83 ha messo in

evidenza la presenza di alcune uova di S. mansoni confermate poi con un - successivo prelievo rettoscopico (con la tecnica del brushing); si osser-

vavano piccoli papillomi a livello rettale; l'oogramma ha messo in evi-

denza un piccolo numero di uova, quasi tutte vive e vitali. di - S. mansoni.

Questa tecnica, messa a punto in Brasile. consiste nel prelevare sottilis-

simi lembi di mucosa del retto e schiacciarli fra due vetrini, osservando

a fresco le uova in transito nei vari stadi di maturazione e le uova bloc-

cate nei tessuti, a vari stadi di degenerazione. L'oogramma costituisce

un sensibilissimo indice sull'epoca dell'infestazione. sulla sua evoluzione.

sul successo della terapia (scomparsa di uova fresche) e su eventuali rica-

dute per ritorno di coppie superstiti di schistosomi dalle diramazioni por-

tali epatiche alle vene mesenteriche.

I1 paziente è stato sottoposto a terapia dapprima antiamebica con Ni-

morazolo (Naxogin): 750 mg 3 volte al giorno per 10 gg; poi, dopo reperi-

mento delle uova, antischistosomica con Praziquantel (Biltricide) 60 mg/kg

suddiviso in due sonnninistrazioni in un'unica giornata.

Un controllo effettuato il giorno 15/12/83 ha evidenziato una riduzione 3 della leucocitosi (8600 GN mm ) e in misura minore della eosinofilia (20%).

come pure degli enzimi epatici (GPT-32, GGT-30) con completa negativizzazio-

ne dell'esame parassitologico delle feci.

L'indagine sierologica effettuata con emoagglutinazione indiretta con

Cellognost-Schistosomiasis (Behring) rivelava un titolo di 1/32 mentre l'esa-

me effettuato un mese prima non aveva fornito un titolo significativo.

Nello stesso giorno si ripetè l'oogramma, che mostrò solo uova

coartate e nessun uovo vitale. Un prelievo bioptico rivelò la presenza

di lesioni granulomatose a forte infiltrazione eosinofila a carico della

sottomucosa. con al centro uova vuote. semi-collassate.

Un ulteriore controllo effettuato il 4 gennaio 1984 ha evidenzia-

to una lieve diminuzione degli eosinofili (15%) mentre gli enzimi epa-

tici non hanno mostrato significative modificazioni. così come 1'E.A.I.;

negativo l'esame parassitologico delle feci. I1 paziente 2 poi ripartito

per la Nigeria dove ha ripreso la propria attività, astenendosi questa

volta da bagni del tipo sopra descritto.

Rientrato definitivamente in Italia, il 10 agosto 1984 si sentiva

soggettivamente bene; nuovi esami di controllo hanno mostrato la nor-

malizzazione dei quadri ematologici (eosinofili 3%) ed ematochimici

(GOT- 13, GPT-10, YGT 23). mentre il titolo dell'E.A.1. è sceso a 1/16.

L'andamento nel tempo di questi parametri e in particolare dèl-

l'oogramma ci ha permesso di seguire la dinamica dell'infestazione e

depone per una cura verosimilmente radicale.

BIBLIOGRAFIA

1. DE CARNERI. I. ORECCHIA, P. h PAGGI, L. 1970. Infestazione di un ceppo

sardo e di un ceppo algerino di Bulinus (Bulinus) truncatus con miracidi

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infestati a E1 Mamoun (Sud della Tunisia). Giornale di Malattie Infettive

e Parassitarie. 22: 449-450.

2. DE CARNERI. I. BUSSOLATI, C. h CASTELLINO, S. 1966. Tentativi di inibire

con anticoncenzionali l'ovoposizione di Schistosoma mansoni per la tera-

pia della schistosomiasi del topo e dell'uomo. Atti della Società Pelori-

tana di Scienze Fisiche, Matematiche e Naturali. 12: 431-434.

3. STUIVER, P.C. 1984. Acute schistosomiasis (Katayama fever). British

Medica1 Journal. 288: 221-222.

Ann I*. Supar. h i t d VoL 22, N. 1 (1986). pp. 269.270

CISTICERCOSI SPINALE: DESCRIZIONE DI UN CASO CLINICO TRATTATO CON PRAZIQUANTEL

Istituto di Clinica delle Malattie Infettive; Università di Pavia - IRCCS Policlinico "San Matteo" - 27100 PAVIA

Nonostante la cisticercosi rappresenti la verminosi larvale che nell'uomo più frequentemente colpisce il SNC, l'interessamento spinale di tale elmintiasi costituisce un evento di eccezionale rarità. Gli Autori riportano un caso, osservato nel luglio 1984, occorso in una donna di 60 anni proveniente da zona rurale della provincia di Agrigento, caratterizzato dalla presenza di cisticerchi in sede subaracnoidea. La paziente riferiva consumo di carni crude o poco cotte, ma negava di aver mai compiuto soggiorni a distanza dalla propria residenza. Nell'agosto 1983 il medico curante le aveva diagnosticato un'infestazione da "verme solitario". Dal marzo 1984 lamentava lombosciatalgie, parestesie, diffi- coltà alla marcia e presentava tetraiperriflessia osteotendinea. La mielografia e l'esame TAC midollare rivelavano numerose immagini di nel mezzo di contrasto, mobili nello spazio subaracnoideo,'interpretate come forme cistiche di assai verosimile natura parassitaria~ si riscontravano anche chiari segni radio- logici di circostante meningite. L'esame radiologico degli arti inferiori propo- neva, nel contesto delle parti molli, immagini radiopache "a sigarof', ritenute patognomoniche di cisticercosi muscolare. Pur in assenza di conferma diagnostica sierologica, si instaurava specifica terapia anti-C.cellulosae con praziquan- te1 (17 mg/Kg/die t.i.d., per 14 g g . ) assciato a ciesametasone ( 4 mg t.i.d., per

14 g g . ) , che in poche settimane conseguiva completa remissione della sindrome nervosa. Si sottolinea, oltre alla rarità di tale condizione morbosa, l'origine autoctona, il riconoscimento esclusivamente radiologico ed il trattamento di successo mediante praziquantel.

Cysticercosis is the most common larva1 helminthiasis affecting human CNS, nevertheless its spinal localization seems to be an occurrence particularly rare. The Authors report the second italian case of spinal cysticercosis, recognized in a 60-year-old woman from Agrigento (Sicily), admitted to hospital in July 1984. It represents the first example of subarachnoideal helminthic larvae ever seen in our Country. The patient lived in a rural area, admitted she was used to eat raw pork and denied stays away from the native district. In August 1983 the diagnosi6 of taeniasis was taken into consideration by her family phy- sician. Since March 1984 she complained lombosciatalgia, paresthesiae and gait impairment. Hyperactive tendon reflexes could be noted, too. Myelography and spinal CAT scan showed multiple spheroidal lumps floating in the subarachnoideal

space, considered a s p a r a s i t i c c y s t s . Nearby radio logic f ea tu res o f meningeal inflarnmation were dernonstrated. X-rays of both th ighs showed c iga r - l ike s t ruc - t u r e s , he ld pathognornonic of muscular cys t i ce rcos i s . Despite negat ive se ro log ic r e s u l t s , t h e p a t i e n t was put on s p e c i f i c therapy with praziquantel (17 rng/Kg/die t . i . d . fo r 14 days) and dexarnethasone (4 mg t . i . d . f o r 14 days ) , which a t t a i n e d a t o t a l recovery within few weeks. I n conclusion, the Authors poin t o u t , a s well as t h e pecul iar r a r i t y of t h i s case, its autochthonous o r i g i n , s o l e l y r ad io log ic diagnosis and successfu l treatment with praziquantel .

A m In SUFU. Sonitù Voi. 22, N. 1 (1986A pp. 2'71-272

UN VECCHIO, MA SEMPRE AGGUERRITO NEMICO. CONSIDERA - ZIONI SU 275 CASI AUTOCTONI DIAGNOSTICATI NEL PERIODO 1977-1984

I s t i t u t o d i C l i n i c a d e l l e M a l a t t i e I n f e t t i v e ; Un ive rs i t à d i Pavia - IRCCS P o l i c l i n i c o "San Matteo" - 27100 PAVIA

Strongylo ides s t e r c o r a l i s é un nematode responsabi le d i una sindrome c a r a t t e r i 2 - zata da mani festaz ioni gastro-enter iche, r e s p i r a t o r i e ed a l le rg iche, d i f f u s a s o p r a t t u t t o i n zone t r o p i c a l i e s u b - t r o p i c a l i a c l ima caldo-umido. Tut tav ia, sac - che d i endemici tà c o s l come cas i sporad ic i sono s t a t i segna la t i anche i n aree temperate. La Pianura Padana, ed i n p a r t i c o l a r e il Pavese, cont inua a r i v e l a r s i zona ad a l t o r i s c h i o con numerosi cas i d i a g n o s t i c a t i annualmente (Scag l ia e t a l . 1984). Nel presente s tud io sono esaminate l e c a r a t t e r i s t i c h e epidemiologico-cl i niche, nonché l e imp l i caz ion i te rapeut iche d i 275 cas i autoctoni d iagnost ica t i - ne l per iodo 1977-1984 presso l ' I s t i t u t o d i C l i n i c a d e l l e M a l a t t i e I n f e t t i v e d i Pavi a. I sogget t i maggiormente c o l p i t i r i s u l t a n o essere maschi (74.5%), d i e t à compresa t r a i 21 e 50 anni (58.1%) e r e s i d e n t i i n ambiente r u r a l e (60.4%). E ' importante so t to1 ineare l a f requente associ azione t r a s t rong i l o i d o s i ed imnu nodepressione; i n f a t t i il 10% de i p a z i e n t i da no i cons ide ra t i e r a p o r t a t o r e d i - un d e f i c i t imnun i ta r i o secondario a cause pato logiche e/o i atrogene. La sintomatologia, presente i n c i r c a 1'80% de i casi, é essenzialmente a c a r i c o d e l l 'apparato gas t ro -enter ico (71.6%) e r e s p i r a t o r i o (32%), mentre man i fes taz io - n i a l l e r g i c h e o r t i c a r i o i d i ed epatomegalia sono present i i n o l t r e l a metà de i cas i (52.3%). La t e r a p i a d i e lez ione é rappresentata da l t iabendazolo (25 mg/Kg/ / d i e ogni 48 h per 3 s o n i n i s t r a z i o n i ) che s i é r i v e l a t o e f f i c a c e i n o l t r e il 95% de i casi , mentre il mebendazolo (1 g /d ie per 10 gg) s i é d imostrato totalmen - t e i n a t t i v o . L 'albendazolo ha d imostrato d i possedere buone capac i tà te rapeu t i che ( 8 p a z i e n t i g u a r i t i su 13 t r a t t a t i ) a l l e dosi d i 400 mg/die per 3 gg, e s i propone per tan to come farmaco a l t e r n a t i v o .

The disease due t o Strongylo ides s t e r c o r a l i s i s character ized by gas t ro -enter ic , r e s p i r a t o r y and a l l e r g i c mani festat ions. This nematode i s endemic i n t r o p i c a l and sub- t rop ica l Countries, nevertheless endemic areas, as w e l l as sporadic ca ses, are repor ted worldwide. The d i s t r i c t of Pavia (Lombardia Region, I t a l y ) 7 s an h igh r i s k area accounting f o r severa1 cases diagnosed every year (Scag l ia e t al., 1984). ~ ~ i d e m i o l o ~ i c a l and c l i n i co - the rapeu t i c issues concerning 275 autochthonous cases diagnosed a t t h e Department o f I n f e c t i o u s Diseases - Univer s i t y o f Pavia from 1977 through 1984, were examined. Males (74.5%.), aged between 21 and 50 years (58.1%) and l i v i n g and/or working i n r u r a l areas (60.4%), were found t o be a t h ighest r i s k . The assoc ia t ion between s t rongy lo idos is and under -

l y i n g immunological defects because o f pathologic and/or therapeut ic causes, was r a t h e r frequent (10% o f o v e r a l l cases). Gastro-enter ic symptoms (71.6%), r e s p i r a t o r y signs (32%), creeping erupt ions and a l l e r g i c d i seases (52%) and epatomegaly (52.3%) were t h e most comnon c l i n i c a 1 mani festat ions o f symptomatic p a t i e n t s (80% o f o v e r a l l cases). Thiabendazole (25 mglKglday every other day i n a week) was e f f e c t i v e i n over 95% o f cases. Mebendazole (1 g/day per 10 days) was unef fec t ive . The new drug albendazole (400 mglday per 3 days) proved t o be a v a l i d a l t e r n a t i v e drug (8/13 p a t i ents recovered) .

A m 1st Supm. Sanità Vol. 22, N. 1 (1986). pp. 273-276

INDAGINE EPIDEMIOLOGICA SULLE PARASSITOSI INTESTINALI IN UNA COMUNITA' CHIUSA IN SOMAL1A:PREVALENWL DI TRICHURIS TRICHIURA,ANCYLOSTOMA E GIARDIA INTESTINALIS

I I a d i Shukri C. Shiddo, Abdullahi S.Hussein, Hassan H. Moxamed, Khalif Bi- le M., A. Sebastiani, G. Bianchini e G.Amiconi

Istituti di Malattie infettive,di Clinica Malattie tropicali e infettive e di Chimica, Facolta di Medicina, Università degli Studi "La Sapienzal',Roma(Italia) Facoltà di Medicina, Università Nazionale Somala, Mogadiscio ( Somalia)

Riassunto- Sono riportati i risultati di una ricerca epidemiologica fatta nel- l'autunno del 1983 sulle parassitosi intestinali di una popolazione di giovani maschi (da 6 a 20 anni) in un collegio vicino a Mogadiscio (Somalia). I1 91% degli ospiti è risultato infestato da uno o più parassiti. Trichuris trichiura era presente in oltre il 66% dei campioni esaminati e il 12% di questi conteneva più di 3000 uova del parassita per grammo di feci. Siurniary- A survey of intestina1 parasitic infection in a community of young male people (6 to 20 years old) living in an orphanage near Mogadishu, Somalia, was conducted from October through November 1983. Stools were submitted by 816 individuals, representing 96 percent of the population present in the orphanage, and 91 percent of the samples examined were positive for one or more parssites. Trichuris trichiura was detected in more than 66% of the samples and about 12% of these had egg counts above 3,000 per gram of feces. Other relevant infection rates were 48% for hookworm and 36% for Giardia intestinalis.The highest prevalente and intensity of worm infection were found in the younger groups, with considerable reduction after 15 years of age.

Introduzione All'inizio del 1983 la Facoltà di Medicina dell'università Nazionale Somala

stese un programma di ricerche parassitologiche da svolgere in istituzioni pub- bliche ed in comunità rurali. Uno degli scopi era quello di stabilire un sicuro punto di riferimento per giudicare tutti i cambiamenti,qualitativi e quantitati- vi, che si sarebbero potuti verificare in seguito a: 1. miglioramento di strutture igienico-sanitarie; 2. intensa educazione sanitaria; 3. trattamenti medica- mentosi a scopo curativo e profilattico. Come studio-pilota dell'intero programma si scelse di determinare la prevalenza e l'intensità dei parassiti intestinali dei giovani residenti in un collegio maschile situato a 15 Km a sud di Moga- discio, chiamato Lafoole. Questa comunicazione riassume alcuni dei risultati più salienti della ricerca epidemiologica condotta tra 1'0tth-e ed il novembre 1983. Materiali e metodi

Per ogni ospite del collegio è stato esaminato al microscopio ottico un solo campione di feci a) dopo diluizione con soluzione fisiologica, b) dopo colorazione con soluzione di Lugol e C ) dopo concentrazione delle uova di elminti con la tecnica di Kato. In quest'ultimo caso sono stati esaminati circa 50 mg di feci. I campioni sono stati osservati entro sei ore dalla raccolta. Non è

stato fatto alcun tentativo per identificare le specie di ancylostoma. Risultati

La popolazione del collegio era costituita da giovani maschi di età compresa tra 6 a 20 anni, di cui il 20% fra 6 e 10 anni, il 40% fra 11 e 15 anni ed il rimanente 40% fra 16 e 20 anni. Di tutti i campioni esaminati il 90.7% conteneva almeno un tipo di uova di elminti e/o protozoi, ma oltre la metà degli individui era affetta da poliparassitosi. La tabella 1 riporta la prevalenza globale dei vari parassiti, mentre la tabella 2 indica lo stato di poliparassitosi. TABBLLA 1. Prevalenza di parassiti intestinali (740 individui positivi/816 in-

dividui esaminati). PARASSITA CAMPIONI POSITIVI

Numero totale Percentuale Trichuris trichiura 491 66,3 Ancylostoma 356 48,l Giardia intestinalis 267 36,l Entamoeba histolytica 114 15,4 Ascaris lumbricoides 83 11,2 Strongyloides stercoralis 16 2 ~ 2 Hymenolepis nana 3 0 9 4

TABELLA 2. Mono- e poli-parassitosi

Numero di specie di 1

parassiti per soggetto 2 3 4 5

Numero di soggetti 218 286 183 47 6 Percentuale sul totale 29,5% 38.6% 24.8% 6,3% 0,840 Un'analisi della distribuzione delle infestazioni secondo gruppi di età (vedi Tabella 3) mostra che la prevalenza più alta è associata con l'età più giovane, eccetto per Entamoeba histolytica che sembra diffusa in modo omogeneo su tutta la popolazione del collegio. Parallelamente alla relazione osservata tra età e prevalenza, l'intensità dell'infestazione risulta maggiore negli individui più giovani (vedi Tabella 4). Discussione

Poche sono le informazioni precise sulla prevalenza di parassiti intestinali in Somalia e, per quanto a conoscenza degli autori, questo è il primo studio quantitativo su tale problema. La limitazione principale di questa indagine è legata all'esame di un singolo campione di feci, raccolte con defecazione spontanea: E' stato detto (1) che in tal modo si osservano solo la metà delle infestazioni da protozoi e sfugge una frazione di elmintiasi; pertanto è probabile che l'intera popolazione del collegio sia affetta da parassitosi intestinali. Questa altissima incidenza è, fra l'altro,correlabile cen la mancata utilizzazione dei servizi igienici (sia per abitudine che per difettoso funzionamento), con conseguente intensa fecalizzazione dell'ambiente. In quelle aree tropicali dove prevalgono condizioni socio-sanitarie poco soddisfacenti, è stata molto spesso descritta un'alta incidenza sia di Trichuris trichiura che di Ascaris lumbricoides. Nel nostro caso la bassa endemicità di ascaridiasi può essere imputata alle condizioni climatiche (brevi periodi di pioggia seguiti da lunghi periodi secchi) e al terreno sabbioso:& noto che queste caratteristiche favoriscono una migliore soprawivenza dell'ancylostoma rispetto all'ascaride

( 2 ) , evidenza ben chiara nei dati sopra riportati. Infine la omogenea distribu- rione di Entamoeba histolytica su tutto il campione può trovare una spiegazione nella facilità di trasmissione di questo protozoo nelle comunità chiuse,che può rimanere costante per anni anche a seguito di notevoli miglioramenti delle condizioni ambientali (3). TABKLLA 3. Prevalenza secondo l9età.(0gni tripletta di numeri indica, andando dall'alto in basso, il numero totale di individui, la percentuale per età ri- ,$petto al parassita e la percentuale per parassita rispetto all'età). Abbreviazioni:Tt=Trichuris trichiura; A=Ancylostoma; Gi=Giardia intestinalis; ;ti=Entamoeba histolytica; Al-Ascaris lumbricoides;Ss=Strongyloides stercoralis. :'ARASSITA ETAa(in anni) PARASSITA ETA' (in ami)

22,% 42% 35,a 17,5% 43,3% 42,2% 79,6% 68,246 58,5% 14,696 15,2% 15,9%

i\ 72 162 122 Al 21 35 27 20,2% 45,5% 34,396 25,s 42,2% 32,5% 52,5% 53,6% 40,5% 15,s 11.6% 8 , s

(; i 67 120 80 Ss 6 8 2 25,1% 4 4 , s 304: 37,5% 50% 12.5% 4899% 39,7% 26,6% 4,496 2,6% 6,7%

- TABELLA 4. Numero di uova di vari elminti per g di feci riferito All'età (la percentuale è stata calcolata rispetto al totale di individui affetti dal parassita per ogni classe di eta). -

TRICHURIS TRICHIURA ,< 10 anni 11-15 anni 3 16 anni

,"L000 uova 30(35,8%) 100(48,5%) 129(73,3%) 1001-3000 uova 49(44,9%) 79(38.4%) 36(20,4%) >3000 uova 21(19,3%) 27(13,1%) 11(6,3%)

ANCYLOSTOMA ,< 10 anni 11-15 anni >. 16 anni

$1000 uova 18(25%) 48(29,8%) 65(53,3%) 1001-3000 uova 30(54,2%) 79(49,1%) 42(34,4%) y3000 uova 15(20,8%) 34(21,1%) 15(12,3%)

ASCARIS LUMBRICOIDES

$1000 uova < 10 anni 11-15 anni 3 16 anni 7(33,3%) 14(40%) 17(62,9%)

1001-3000 uova 8(38,1%) 16(45,7%) 7(25,9%) >3000 uova 6(28,6%) 15(14,3%) 3(11,2%)

BIBLIOGRAFIA 1. Andrews, J. 1934. The diagnosis of intestina1 protozoa from purges and nor-

mally passed stoo1s.J. Parasitol. 20:253-254. 2. Beaver,P.C. 1952.0bservatiomon the epidemiology of ascariasis in a region

of high hookworm endemicity. J.Parasito1. 38:445-453. 3. Jeffery, G.M. 1960.A three-year epidemiological study of intestina1 parasi-

tes in a selected group of menta1 patients. Am.J.Hyg. 71:l-8.

Ann In Super. SanW VoL 22, N. 1 (19%). pp. 277.278

INDAGINE PARASSITOLOGICA A TANGUIETA: RICERCA COPRO-URINOMICROSCOPICA E SIERO- LOGICA

M.L. Ricciardi (a) & L. Bossi (b)

(a) Centro Ricerche Farmitalia Carlo Erba, Nerviano, Milano (b) Istituto di Jgiene dell'università e Laboratorio Centrale, Ospedale

Maggiore, Milano

Una indagine parassitologica condotta tra gli allievi di una scuola elementare del nord del Benin (Repubblica popolare) e tra gli insegnanti della scuola e i loro familiari ha messo in luce una situazione ambientale di particolare gravità. I1 100% dei ragazzi risulta parassitato, con preponderanza delle parassitosi protozoarie-elmintiche (75,47%) su quelle sostenute da soli protozoi (11,32%) o da soli elminti (13,21%). La prevalenza di S. mansoni, in particolare, risulta del 75.47% e pure S. haematobium, recentemente introdotto nella zona, appare nel 3,77% dei ragazzi. Meno drammatico. ma pure sempre importante, risulta il quandro parassitologico nelle famiglie dei maestri. dimostrando come le migliori condizioni socio-economiche non bastino a proteggere dalla contaminazione ambientale. I1 90% dei componenti il gruppo risulta infatti parassitato, con prevalenza delle parassitosi sostenute da soli protozoi (50%) su quelle sostenute da soli elminti (22,22%) e da associazioni protozoarie-elmintiche (27.78%); in particolare S. mansoni compare soltanto nel 22,22% dei soggetti.

La grande diffusione dei protozoi, patogeni o apatogeni, sicuramente non legata a consumo di verdura cruda. che non rientra nelle abitudini alimentari degli autoctoni. dimostra la inevitabilità del contagio oro-fecale interumano diretto in un ambiente ove anche l'adozione delle misure igieniche più elemen- tari è ritardata dalla estrema carenza di acque. Carenza di acque che trova poi buon gioco nella diffusione della schistosomiasi tra gli abitanti della zona obbligati ad utilizzare le scarse raccolte idriche stagnanti, infestate da molluschi vettori. Risultati inferiori alle nostre aspettative ha dato il test IHA (emoagglutinazione indiretta) nelle sierodiagnosi di amebiasi e di schistosomiasi, che abbiamo potuto eseguire soltanto nel gruppo degli allievi e degli insegnanti. Se anticorpi anti-E. histolytica sono comparsi in tutti i soggetti parassitati da E. histolytica ed in un soggetto in cui l'esame delle feci non aveva rivelato la presenza del protozoo, i titoli sono tuttavia modesti, variando da 1/64 a 11256.

Titoli decisamente marcati, varianti da 11128 ai 1116304, sono invece comparsi nella sierodiagnosi di schistosomiasi, comparsi, comunque. solo su 16 dei 40 soggetti parassitati da Schistosoma e su 1 soggetto in cui la ricerca di Schistosoma era risultata negativa sia nelle feci che nelle urine. Tenendo presente questo risultato ci si ripromette, in indagini future, di esaminare possibili relazioni.tra carica parassitaria ed entita della risposta anticorpale, almeno per quanto riguarda la schistosomiasi.

A m In. Super. Sonitù Vol. 22, N. l(1986). pp. 279-280

M.L. Ricciardi (a) & L. Bossi (b)

(SI) Centro Ricerche Farmitalia Carlo Erba, Nerviano, Milano (b) Istituto di Igiene dellfUniversità e Laboratorio Centrale, Ospedale

Maggiore, Milano

Una indagine copromicroscopica è stata condotta in due comunità infantili delllAtakorà (Repubblica popolare del Benin), comunità che accolgono, con bambini ipo- e malnutriti, di età variabile dai 3 mesi ai 10 anni. anche le madri dei piccoli o altre parenti adulte. allo scopo di mantenere i legami affettivi necessari all'evoluzione psichica del bambino ed al suo reinserimento nell'ambito familiare, ma anche e soprattutto al fine di educare le accompagnatrici nelle esigenze alimentari infantili. La ricerca ha rivelato parassitosi che non risparmiano neppure i bambini più piccoli e aumentano quantitativamente e qualitativamente con il procedere delle varie fasce di età. aggravando ulteriormente il precario equilibrio metabolico. Viene suggerito di eseguire controlli copromicroscopici sistematici. non solo all'atto della ammissione dei bambini e delle accompagnatrici, ma ripetuti ad intervalli regolari per tutta la durata del soggiorno, controlli owiamente seguiti da trattamento terapeutico, quando l'analisi riveli la presenza di parassiti. Ciò o1 fine di evitare le reintroduzione nella comunità di parassitosi, così facile a realizzarsi in ambiente tropicale. Viene infine auspicata un'opera di educazione sanitaria, volta a contenere queste evenienze, che potrebbe risultare utilissi- ma per le comunità rurali alle quali le donne. una volta dimesse con i loro bambini, faranno ritorno con questo nuovo bagaglio culturale.

Anrr h. Super. Sanitd Vol. 22, N. l(1986). bp. 281184

ANALISI DELLA SPECIE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS IN RELAZIONE ALLA SITUAZIONE EPIZOC IOCICA ED EPIDEMIOLOGICA DELL'ECHINOCOCCOSI-IDATIDOSI IN SOMALIA ,

t,, Macchioni (a), A. Marconcini (a), F. Testi (b), T. Balbo (e), P. Lanfranchi ( C ) , M.A. Abdullatif (d)

l a ) Dipartimento di Patologia Animale, Profilassi e Igiene degli Alimenti, Uni- versita di Pisa, Pisa

* h ) Istituto di Patologia Generale e Anatomia Patologica Veterinaria, Università di Bologna, Bologna

t e ) Istituto di Patologia Speciale e Clinica Medica Veterinaria, Universitb di Torino, Torino

i d ) Dipartimento Infettivistico e Parassitologico Veterinario, Universitb di Mo- gadiscio, Mogadiscio

Riassunto. - Indagini epizoologiche in Somalia hanno evidenziato una elevata fre - quenza dell'idatidosi nel dromedario (14,82%), bassa nel bovino (1,75%), e pres- sochè nulla nell'ovino e caprino. La discordanza tra l'alta incidenza dell'echinococcosi nel cane (23,4076) e l'assenza dell'idatidosi nell'uomo viene analizza- ta in relazione all'ambiente ed alle variazioni intraapecifiche di Echinococcus granulosus.

Summary (Epizoological and epiderniological aspects of Echinococcosis-Hydatidosis in Somalia). - Hydatid cysts were found in 142 (14.82%) of 958 camels, in 28 (1.75%) of 1598 cattle, in 1 (0.07%) of 1359 sheep and in O of ,1937 goats in Co- malia. The high incidence of Echinococcosis in the dog (23.40%) and the absence of Hydatidosis in man are analysed with reference to the environment and the in- traspecific variations of E. granulosus.

Gli studi epidemiologici hanno dimostrato che nei paesi in cui esiste il ci - clo cane/pecora, il ceppo di Echinococcus granulosus coinvolto risulta infestan- te per l'uomo. La situazione epidemiologica è molto meno chiara quando nel ciclo biologico intervengono altre specie animali quali equini, suini, dromedari, etc., come ospiti intermedi.

In Somalia, doye praticamente si concentra un terzo di tutta la popolazione cammellina del mondo (l), in un'indagine condotta a Merka è stato osservato (2) che la malattia è presente nel dromedario con una frequenza del 23,40%; sorprendentemente bassa è risultata invece l'infestione nel bovino (0,912) e nel caprino (0,5876); l'esame parassitologico dei cani infine ha registrato una positivitb del 276.

Negli anni 1980-84 presso i Macelli di Mogadiscio, Merka e Kisimaio abbiamo

esaminato per idatidosi 958 dromedari, 1598 bovini, 1359 ovini e 1937 caprini. Mentre nel dromedario sono state rilevate cisti idatidee in 142 animali pari al 14,82%, nel bovino solo28animali sono risultati infestati con una frequenza dei- lt1,75%; un caso soltanto (pari allo 0,07%) è stato osservato nell'ovino e nessuno nel caprino. Contemporaneamente l'indagine è stata estesa ai cani randagi di Mogadiscio: su 47 animali sottoposti a necroscopia 11 presentavano in sede in testinale esemplari adulti di E. granulosus con un'incidenza pari al 23,40%.

Data una cosl elevata diffusione dell'echinococcosi nel cane, si dovrebbe ritenere frequente anche l'idatidosi nell'uomo. Invece l'infestione umana in So - malia non risulta sia mai stata riportata in letteratura se si esclude un caso d'idatidosi orbitaria in una donna somala segnalato da un medico italiano a Pel- legrini e Sobrero nel 1960 (2). Da informazioni assunte presso l'ambiente medico di Mogadiscio non risultano accertati casi d'idatidosi, neppure in questi ultimi dieci anni in cui si è assistito ad un notevole.miglioramento dei servizi sani- ri per la presenza di numerosi esperti in Cooperazione Tecnica.

La discordanza tra l'elevato grado di parassitismo nel cane e l'assenza del - la malattia nell'uomo costituisce un problema epidemiologico assai interessante, che merita di essere attentamente analizzato al fine di individuare le cause del fenomeno, non comune nell'epidemiologia dell'idatidosi.

Sul potere contagiante del cane i fattori che maggiormente influiscono sono il rapporto cane/uomo e l'ambiente. Prendendo come campione Mogadiscio, città nella quale abbiamo controllato la diffusione dell'echinococcosi nel cane, osse2 viamo temperature relativamente costanti, con minime sui 24°C e massime sui 30°C, ed umidith relativa costantemente abbastanza elevata (74-792 di media). Esistono pertanto le condizioni per una lunga sopravvivenza delle uova di E. qranulosus nell'ambiente: uova che possono essere ingerite, soprattutto in conseguenza delle cattive condizioni igieniche, tramite alimenti non accuratamente puliti elor- dati da animali vettori quali mosche, blatte, roditori. Un altro fattore che può favorire la contaminazione dell'ambiente è rappresentato dalle piogge che perio- dicamente si abbattono sulla citth; non esistendo fognature le acque scorronolu! go le strade formando nei punti piii bassi pozze o veri e propri laghetti, dove si possono concentrare le uova disseminate per la citth dai cani infestati e dove spesso si vedono giocare i ragazzi.

Nonostante che i Somali non tocchino il cane per motivi religiosi, esiste ugualmente per chiunque l'occasione di contrarre l'infestione per trasmissione indiretta; il fatto, invece, che l'idatidosi non rappresenti per la Somalia un problema sociale ci fa ritenere l'uomo non recettivo al ceppo di E. granulosus presente nel Paese.

La tendenza alla diversificazione in popolazioni distinte fino alla sotto- speciazione da parte di E. granulosus è un dato ormai accertato; tale variabili- tà, rilevabile non tanto sul piano morfologico quanto sul piano biologico e bio- chimico, risulta favorita sia dai processi di autofecondazione che sembrano ve- ficarsi nel cestode adulto che è ermafrodita, sia dalla poliembrionia caratteristica della forma larvale. L'autofecondazione favorisce la fissazione e l'espres - sione di mutanti, ciascuno dei quali ha la possibilità di aumentare rapidamente di numero, ciob di clonare, a seguito della moltiplicazione asessuata che si osserva nella fase cistica. I1 risultato è la selezione di ceppi (o popolazioni) differenti con cicli mantenuti in natura in ospiti recettivi d&ersi per situazioni ecologiche.

Mediante prove biochimiche (3) ed isoenzimatiche (4) in Kenia è stata dimo-

ta una stretta affinità della forma umana con quella ovina del parassita e, ,t misura minore, con quella caprina così da far ritenere molto simile il ceppo

presente in questi tre ospiti intermedi. La situazione dell'idatidosi del drome- ditrio e del bovino rimane invece oscura dal momento che il ceppo responsabiledel- In malattia in questi animali differisce sotto l'aspetto iaoenzimatico e biochi- wieo da quello precedente. Non sappiamo se il ceppo somalo sia simile a quello &,i dromedari e dei' bovini kenioti; è però ammissibile ritenerlo per la vicinan- rrr dei due paesi e per il frequente passaggio del confine da parte di mandriegui date da nomadi somali in cerca di pascoli migliori e di mercati più favorevoli.

La situazione epizoologica ed epidemiologica dell'idatidosi in Somalia, del t t i t to particolare rispetto a quella delle altre regioni, offre una chiara dimo- .titrazione della molto probabile mancanza di recettività dell'uomo ad un ceppo di T . granuloaus; pone però il problema se inserire semplicemente tale ceppo tra i varianti popolazioniatici della specie o se prendere in considerazione la possi- t>ilità di una differenziazione a livello specifico.

BIBLIOGRAFIA

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nulosus of human and anima1 origin from Kenya. J. Helminth. 55: 2-27 4. MACPHERSON, C.N.L. & McMANUS, D.P. 1982. A comparative study of Echinococ-

cus granulosus from human and anima1 hosts in Kenya uaing isoelectric focu- sing and isoenzyme analysis. Intern. J. Parasit. 12: 515-521.

Ann, 1st Supa. h i t à Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 285-288

Sessione 111

TNDAGINI SULLA RESISTENZA AGLI ESTERI FOSFORICI IN POPOLAZIONI ITALIANE DI CULEX PIPIENS *-

. Villani, R. Romi, L. Cuoci e G. Majori

tstituto Superiore di Sanità, Roma

RIASSUNTO- Nella presente nota viene segnalata la presenza in Italia di una popolazione di Culex pipiens resistente agli esteri fosforici. I risultatft dell'analisi elettroforetica hanno evidenziato la presenza dell'allele Est-3 con la frequenza del 70%. Prove effettuate con sinergici (DEF e PB) sembrano indicare tuttavia che tali esterasi non svolgano in questa popolazione un ruolo primario nella determinazione della resistenza.

SUMMARY In the present comunication the presence of an organophosphate resistant population of Culex pipiens in Italy is reported. The results of the elect o horetic analysis of non-specific esterases showed that the allele X P Est-3 was present with a frequency of 70%. However, tests carried out with cinergists (DEF and PB) seem to indicate that those esterases do not play the primary role in developing resistance.

Nell'ambito di ricerche svolte in Italia su pipiens, aventi lo obiettivo di valutare i livelli di sensibilità agli esteri fosforici e di verificare la correlazione tra resistenza a tale classe di insetticidi e esterasi particolarmente attive, € stato saggiato un campione di z. pipiens di Lucca proveniente da canali di scolo urbani epigei.

Gruppi di 20 larve al 3"-4" stadio sono stati esposti per 24 ore a diverse concentrazioni di Chlorpyrifos, Malathion, Fenthion e Temephos seguendo la tecnica descritta dall'0.M.S. (1).

I risultati di tali saggi sono stati confrontati con quelli gi21 precedentemente riportati da Villani s, 1982 (2). I valori di LC , LC g0 e R/S, ci05 rapporto tra la LC del campione saggiato e la LC 50del ceppo 50 sensibile di riferimento, vengono riportati in Tab. 1.Dall'esame agi valori di R/S, risulta che il campione LUCCA presenta un livello di resistenza notevolmente pio elevato rispetto agli altri (R/S pari a 42,9 per il Malathion e 146,l per il Chlorpyrifos) e valori di LC mai osservati finora in Italia. 50

Sullo stesso campione LUCCA € stato condotto uno studio elettroforetico per evidenziare la presenza di esterasi con elevata attività e verificare l'esistenza della correlazione, già riportata da altri autori (3,4,5), tra queste e il livello di resistenza agli esteri fosforici. L'elettroforesi su gel di amido è stata effettuata seguendo la metodica descritta da Villani o g (1983) (5) utilizzando zanzare adulte di 3-4 giorni.

I risultati dell'analisi elettroforetica su LUCCA hanno evidenziato un certo grado di polimorfismo del locus Est-3 con una frequenza dell'allele A Est-3 pari a 0.70 ed una non chiara correlazione <Àon il livello di resistenza osservato. Infatti la presenza dell'allele Est-3 nel 70% degli individui saggiati, non giustifica un cosi elevato livello di resistenza. Inoltre tale frequenza non differisce significativamente da quella osservata in LATINA (60%) (2) nonostante questo ultimo ceppo risulti marcatamente meno resistente di quello di Lucca.

Tab. 1 Confronto tra i valori di LC 10

e R/5 tra il campione di 2 ~ipiens di LUCCA e altri cepp di x. pipiens italiano. , -

Localita LC 90 R/S

CHLORPYRIMS Palo Laziale Grosseto Roma Castel Giorgio Latina Lucca S (ceppo di rif .) MALATHION Palo Laziale Grosseto Roma Castel Giorgio Latina Lucca C (ceppo di rif.) FENTHION Palo Laziale Roma Latina Lucca S (ceppo di rif .)

Grosseto Rcma Latina Lucca S (ceppo di rif.)

Tab. 2- Percentuali di mortalita osservate dopo 24 ore nel campione di Culex pipiens di LUCCA trattato con Chlorpyrifos, Chlorpyrifos t DEF (2,5mg/l) e Chlorpyrifos + PB (5mg/l).

CONCENTRAZIONE % MORTALITA' (24h) (&l) Chlorpyrifos + DEF +PB

Allo scopo di chiarire se la resistenza di LUCCA fosse comunque dovuta ad una azione esterasica, magari modificata da qualche gene regolatore, o se altri nnzimi o altri meccanismi fossero coinvolti in questo fenomeno, sono state effettuate alcune prove tossicologiche implicanti l'uso di sinergici, ci08 inibitori di particolari enzimi. Come sinergici sono stati usati DEF (S,S,S- Tributilfosforotioato) inibitore di esterasi e PB (piperonilbutossido) inibitore di ossidasi, enzimi che possono svolgere un'azione secondaria nel processo di degradazione dei fosforganici e quindi essere parzialmente coinvolti nello sviluppo della resistenza a tali insetticidi (6).

Gruppi di 20 larve al 3O-4O stadio del ceppo LUCCA sono state esposte alle concentrazioni subletali di 5 mg/l per il PB e 2,s mg/l per il DEF, 4 ore prima 4ell1aggiunta dell'insetticida (Chlorpyrifos). Dopo 24 ore. sono state registrate le percentuali di mortalita osservate nei campioni trattati con DEF o con PB e confrontate con quelle del controllo.

I risultati di tali prove, riportati in Tab.2 hanno mostrato solo una parziale riduzione del livello di resistenza nel campione trattato con DEF e nessuno effetto apprezzabile del PB. Da questi dati si pub quindi concludere che nel ceppo di Lucca, sia le esterasi che le ossidasi non sembrano svolgere un ruolo primario nella determinazione di un così elevato livello di resistenza. Pertanto & necessario ricercare tra gli altri possibili meccanismi d'azione quello che possa spiegare questo fenomeno.

Una delle ipotesi pia probabili 6 che lo sviluppo della resistenza agli esteri fosforici possa essere dovuto ad un variante dell'enzima ace- tilcolinesterasi, soggetto ad un minor grado di inibizione da parte del- l'insetticida. Tale meccanismo @ stato finora ritenuto il responsabile primario della resistenza agli esteri fosforici in domestica (7) e in Anopheles albimanus (8). In 5 pipiens @ stato finora evidenziato il coinvolgimento dell'esterasi nella resistenza agli esteri fosforici,tuttavia non si pub escludere che mutazioni indipendenti interessanti altri geni possano determinare la formazione di un variante enzhatico capace di neutralizzare l'azione tossica dell'insetticida utilizzando un meccanismo diverso da quello dell'esterasi.

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Ann I* Super. S<initù Vol. 22. N. l(1986). pp. 289-292

i' $' S. Pampiglione (a), G. Majori (b), G. ~etrangeli (C), R. R0mi (b) b

(a) Istituto Malattie Infettive, Profilassi e Polizia Veterinaria, Cattedra di Parassitologia, Università di Bologna

(b) Laboratorio di Parassitologia, Istituto Superiore di Sanita, Roma (C) Istituto di Parassitologia, Università di Roma

Riassunto: E' stata saggiata l'azione insetticida dell'avermectina(MK-933) nei confronti di zanzare adulte nutrite con soluzione zuccherina o con sangue contenente il farmaco.

Sono state saggiate tre specie, Anopheles stephensi, Aedes aegypti e Culex guinquefasciatus, ottenendo una mortalità del 100% dopo 60 ore ad una dose in soluzione zuccherina di 2.8 mq di p.a./ litro; le prove effettuate nutrendo le zanzare su topi trattati pe; via-sottocutanea coi varie dosi di avermectina hanno dimostrato una eleveta attività tossica contro gli ectoparassiti; aila dose di 28 mg di p.a./Kg di peso corporeo si 6 avuta una percentuale di mor- talità dopo 36 ore del 100% per Anopheles stephensi, del 60% per Aedes aegypti e del 50% per Culex guinquefasciatus.

L'elevata attività per via sistemica dell'avermectina sembra offrire nuove possibilità di lotta contro le malattie trasmesse da artropodi.

Summary: The avermectin (MK933) was shown to have lethal effects when fed to adult female mosquitoes in sucrose solution or in blood. Anopheles stephensi, Aedes p aegypti and Culex guinquefasciatus underwent complete mortality with m- 933 at 2,s mg e.i./l in sucrose solution within 60 hours. When female mosquitoes engorged blood from mice injected subcutaneously with avermectin at 28 mg a.i./Kg of body weight, mortality rates after 36 hours were 100% £or Anopheles stephensi, over 60% Aedes aegypti and over 50% for Culex guinquefasciatus.

The systemic insecticidal effect was very high, particularly against & stephensi.

INTRODmIONE Le avermectine costituiscono un nuovo srupw di sostanze antiparassitarie - - -

isolate dalla fermentazione delllactinomicete Streptomyces avermitilis (4). L'azione dell'avermectina si esplica a livello del sistema nervoso in-

terferendo con la liberazione del neurotrasmettitore GABA ( acido gamma- amino-butirrico ) .

L'elevato effetto letale dimostrato dall'avermectina e derivati a dosaggi minimi su una vasta ganmia di artropodi (9,7,1,2,8,4) associato ad una bas- sissima tossicita per gli animali vertebrati ci ha fatto pensare all'indubbio interesse che un farmaco del genere potrebbe avere nella lotta contro le malattie trasmesse da artropodi. Per gli artropodi ematofagi, infatti, l'as- sunzione del pasto di sangue da vertebrati trattati con avermectina potrebbe risultare letale se nel sangue vi fosse una dose sufficiente del farmaco. Alcune esperienze su zecche e su glossine parrebbero convalidare tale possibilità (8.7). Ed 5 evidente come la scministrazione all'ospite vertebrato di avermec-

tina nelle stagioni di trasmissione potrebbe influire notevolmente sul contatto tra vettore e ospite, selezionando popolazioni di vettori zoofili e antropofili o addirittura interrompendo il ciclo di trasmissione.

Con questo obiettivo abbiamo voluto sperimentare in via preliminare l'azione di una avermectina su Anopheles stephensi, Aedes aegypti e quinquefasciatus.

MATERIALE E METODI I1 prodotto saggiato in laboratorio è stato la 22, 23 diidro avermectina

B1 ( MI(-933 della Merck Sharp & Dohme, Rahway, New Jersey, U.S.A.). Allo scopo di determinare la soprawivenza di zanzare ingorgate con sangue contenente aver mectina, sono state inoculate per via sottocutanea dei topi del peso medio di 35 g con diverse concentrazioni di prodotto diluito in soluzione fisiologica. Le dosi ,somministrate una sola volta, variavano da 5 a 2.000 ug di principio attivo/topo, equivalente a 0,14 - 28 mg di p.a. / Kg di peso co 4 poreo.

In un caso solo & stato inoculato una dose di 56 mg/Kg allo scopo di rilevare una attività insetticida non manifestata alla dose immediatamente inferiore.

Sono state adoperate zanzare femmine di 3-4 giorni di 3 specie allevate in laboratorio: & stephensi, Ae. aegypti e Cx. guinquefasciatus. La temperatura durante le prove è stata mantenuta costantemente a 26 + 1°C e l'umidita relativa al 70%. Gruppi di 50 zanzare sono state alimentate su topi dopo 12 ore dal- l'inoculazione. Le zanzare ingorgate sono state poste in gabbiette di tulle ed è stata rilevata la percentuale di mprawivenza dopo 12, 24, 36, 48, 60, 72 ore dal pasto di sangue. 50 zanzare nutrite su topo non trattato sono state adopera te come controllo.

In un'altra serie di prove, le zanzare sono state nutrite su cotone im- pregnato con una soluzione al 5% di glucosio contenente differenti concentrazioni (0.14-28 mq. di p.a./l) di avermectina. L'esperimento è stato ripetuto due volte. RISULTATI E DISCUSSIONE

I risultati dell'attività dell'avermectina delle 3 specie di zanzare sono riportati nei grafici 1-6. L'attività del farmaco è stata nettamente superiore nelle prove con soluzione zuccherina che in quelle su topo. Le dosi 2.8 mq. di p.a./l sono risultate sempre letali per tutte e tre le specie di zanzare nu- tritesi,in un tempo che non ha mai superato le 60 ore, mentre dosi maggiori hanno abbreviato tale periodo a 24-48 ore.

Nelle prove su topo la specie pia sensibile e stata A. stephensi. Infatti, per tale specie si è registrata una soprawivenza dello oralla dose di 2.8 mq di p.a./Kg dopo 36 ore.

Per *. aegypti, dimostratasi la specie meno sensibile, si è dovuto aumentare la dose a 56 mq per ottenere una soprawivenza di poco inferiore al 50%.

La minore attività del farmaco assunto attraverso il sangue di topo, a confronto con quella della soluzione zuccherina, si è manifestata in tutte e tre le specie ed in modo pitì accentuato in Cx.quinquefasciatus.

L'attività meno elevata della avermectina sonmiinistrata per via sistemica nel topo pu6 essere dovuta alla sua metabolizzazione nell'organismo vivente del vertebrato, con parziale neutralizzazione dei siti attivi e/o all'assorbimento nei tessuti animali, data la spiccata liposolubilità del prodotto.

I risultati ottenuti ci sembrano interessanti, avendo dimostrato una netta azione del farmaco sulle specie considerate, anche se la diversa sensibilità delle varie specie non ci permette di azzardare generalizzazioni affrettate. L'effetto drammatico su A.stephensi ci autorizza a pensare che altre specie di Anopheles vettrici di malaria possano risultare ugualmente sensibili al farmaco.

O I sono incoraggianti per proseguire su questo filone di ricerca che potrebbe rappresentare un nuovo tipo di approccio al p m b l e m della lotta alle malattie trasmesse da artropodi ematofagi, quali la malaria, la leishmaniosi, l'oncocercosi, la theileriosi, e simili.

Fig. 1

r CONTROL A 0.14 rnpa.i.11 m 0.28 e - o 2.8 . W

2 8. - .

Fig. 3

Fig. 2

a CONTROL n 0.20 rngail Xg 0 2 8

28. e

56. " .

I Fig. 5 Fig. 6

Figg. 1-6. Soprawivenza (%) di zanzare femmine adulte di A.stephensi, Ae.aegypti, e Cx.quinquefasciatus nutrite con soluzione zuccherina al 5% contenente varie concentrazioni di avermectina (Fig. 1,3,5), o alimentate su topo trattato per via sottocutanea con avermectina (Fig. 2,4,6).

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soprawivenza dei virus nel lungo periodo di diapausa larvale. E' importante inoltre notare che gli insetti infettati transovaricamente

hanno gli stessi bassi livelli di virus ritrovati nei flebotomi infettati sperimentalmente o nei flebotomi raccolti infetti in natura (3). Possiamo perciò ipotizzare che sia caratteristica di queste associazioni virus-flebotomo una bassa concentrazione virale che sarebbe tuttavia sufficiente a permetterne la trasmissione ad un vertebrato.

Ringraziamenti: Gli autori esprimono il loro ringraziamento al Sig. G. Caricati per la preziosa assistenza editoriale. I1 lavoro è stato in parte eseguito con contributi del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Progetto Finalizzato "Con- crollo delle Malattie da Infezione" (No. 84.03102.52) e del W.H.O. T.S.A.(B) Keg. file V/2/181/189.

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EFFEi'TI DI ALCUNI SOLFURì SULLA RIPRODUZIONE E SUGLI STADI LARVALI IN AEDEC

AEGYPTI E IN CULEX PIPIENS

C . Dojmi di De1upi.S (a), S. Costantini (h) e R. Giordano

(a) Laboratorio di Tossicologia Comparata ed Ecotossicologia, Istituto Superiore di Sanità, Rama

(h) Laboratorio di Tossicologia Applicata Istituto Superiore di Sanità, Roma

Riassunto - Sono stati messi a punto due modelli sperimentali per studiare gli effetti di solfuri solubili ed insolubili sulla deposizione e vitalita delle uova e sulla soprawivenza delle larve di Culicidae (Aedes aegypti e Culex pipiens molestus).

Summary - Two experimental uwdels have been carried out t0 study the effects of soluble and insoluble sulfides on oviposition, eggs and larvae in Culicidae (Aedes aegypti and Culex pipiens molestus) . Introduzione

Al fine di iniziare uno studio sugli effetti della presenza di solfuri nelle acque sui Culicidi, sono stati messi a punto due modelli sperimentali.

L'enorme abbondanza di larve di Culex pipiens riscontrata in acque solfuree naturali (1) e l'osservazione fatta in laboratorio sulla facilita per e aegypti nel deporre le uova su campioni delle stesse acque, hanno condotto ad escogitare un modello sperimentale adatto allo studio degli effetti di solfuri in soluzione sulla deposizione di uova di Culicidi e sulla loro vitalita.

La constatazione dello sversamento, con notevole diffusione, di solfuri insolubili in acque superficiali, causato da industrie estattive di produzione dell'antimonio ( 2 ) , ha condotto alla messa a punto di un secondo modello sperimentale diretto allo studio di possibili effetti su larve di Culicidi.

Materiali e metodi

Nel primo modello sperimentale, realizzato con due esperimenti, fenmiine di Aedes aegypti, alimentate con un pasto su cavia, sono state collocate in una gabbia di dimensioni 60 x 40 x 40 cm. In essa sono stati posti in fila ed in posizione randomizzata t) becher da 100 ml, di cui uno contenente 50 m l di acqua distillata e gli altri 8 la stessa quantita di soluzioni di solfuro di sodio (Na2S.9H20) a concentrazioni variabili da 1 g/l (0.00416 M) a 8 g/l, ad intervalli di unità. Le femmine venivano lasciate a deporre le uova pia volte in un periÒdo di 5-6 giorni a 25'~. Le soluzioni utilizzate venivano rinnovate ogni giorno.

Nel secondo modello sperimentale,circa 100 larve al quarto stadio di Culex pipiens molestus sono state collocate in un contenitore con circa 500 m1 di acqua a 250C,sul fondo del quale sono state poste delle masserelle algali a forma di

lamine composte da fitti intrecci di filamenti(Cianoficee).Queste lamine sono state previamente poste a contatto con un solEuro insolubile ,nel caso specifico trisolfuro di antimonio,il quale,fatto depositare sul fondo del recipiente con acqua,ha potuto impregnare con il suo fine particolato(setacciato con setaccio a 400 mesh) le masse algali,penetrando tra i filamenti.Dopo il trattamento,alcune larve sono state osservate al microscopio e dopo'4 giorni è stata controllata la mortalità larvale mediante confronto con altro lotto costituito dallo stesso nu-

mero di larve poste però a contatto con sole a1ghe;su di un gruppo di 31 larve è stato determinato il contenuto di antimonio mediante spettrofotometria di assorbimento atomico a fornace di grafite.

Risultati

Nel primo modello sperimentale i. conteggi delle uova deposte mettono in evidenza che solo in corrispondenza delle concentrazioni di 3 e 4 g/l vi è una marcata diminuzione delle uova (0.46 - 5.55 % delle uova deposte in tutte le soluzioni contro i.1 37.22 - 55.13 % rappresentato dalle uova deposte in acqua distillata). A concentrazioni più elevate non ne appaiono più.

Costanzialmente,le uova fornivano larve solo nella soluzione a concentrazione di 1 g/l,ove questlultime,in numero notevolmente inferiore rispetto alla

acqua distillata,morivano tutte se si rinnovava la soluzione.In corrispondenza delle concentrazioni di 3 e 4 g/l le uova sono state trovate tutte sul fondo;in esse veniva a mancare il processo di annerimento dell'endocorion,che in aegypti normalmente awiene entro circa 2 ore dalla loro deposizione.

Nel secondo modello ~perimentale~appare che la mortalità delle larve in presenza di trisolfuro di antimonio è più di tre volte maggiore (78%) di quella riscontrata nel contro1lo.Le larve,attratte dalle alghe,ingerivano in notevole quantità le particelle della sostanza in studio,come appariva dall'esame microscopico del loro intestino. I1 loro contenuto di antimonio è stato di 34 mg/g di peso secco.

Discussione

Il primo modello sperimentale dimostra una scarsa selettività in e aegypti nel deporre le uova su acqua o soluzioni di solfuro di sodio,contrariamente a quanto awiene tra i Culicidi nei riguardi di altre sostanze tossiche (metallj. pesanti) scartate dalle femmine nella deposizione delle uova anche a bassissime concentrazioni(3).

Le uova deposte però,per la maggior parte,non sono vitali: nel brevissimo periodo di 2 ore dopo la deposizione,le uova di Aedes aegypti sono permeabili all'acqua e sono quindi presumibilmente meno protette dall'aggressione di sostanze tossiche.La tossicità del solfuro di sodio in soluzione per uova e 1arve.puÒ

attribuirsi alla complessa sequenza di reazioni che i solfuri possono provocare in mezzo acquoso (4).La mortalità delle 1arve.riscontrata appena si rinnovava la

soluzione.puÒ essere spiegata con l'ipotesi di una maggiore partecipazione del gruppo tra i prodotti di queste reazioni,ad una azione tossica combinata.

Esperimenti sono in corso per l'applicazione di questo modello sperimentali. a * pjpiens'al fine di effettuare un confronto tra le due specie.

11 secondo modello sperimentale,applicabile anche ad altre sostanze tossi- <he,conduce a considerazioni di carattere generale,in quanto mette in luce la importanza dell'azione tossica del sedimento,anche quando la colonna d'acqua so- vrastante sia priva di sostanze tossiche in soluzione. Nel caso che più comune- rernte si può verificare in acque superficia1i.i.n cui la probabilità d'incontro ton le particelle tossiche,prodotta dall'attrazione verso il cibo, sia sufficien- temente bassa da non avere conseguenze letali,le larve di questa specie possono <<,munque diffondere e veicolare sostanze tossiche nella colonna d'acqua o in se- ni, a catene trofiche.

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G . Dojmi di Delupis & V. Rotondo

Inboratorio di Tossicologia Comparata ed Ecotossicologia. Istituto Superiore di 'hnità, Roma

Riassunto. - I1 solfato di rame (240 mg/l) inibisce progressivamente l'attività locomotoria di larve al I stadio di Culex pipiens molestus misurata con conteg- g i delle larve che passano attraverso una linea disegnata in apposito contenitore.

Summary. - The effects of copper sulphate (247 mgll) on the locomotory activity of first instar larvae of Culex pipiens molestus were measured by counting the larvae crossing a line on container bottom and showed a time depending inhibi- t ion.

Introduzione

Utilizzando larve al I stadio di zanzare (Aedes aegypti) per tests ecotossicologici, con particolare apparecchio, Simonet e coll. (l), hanno riscontrato che il rame (solfato di rame in soluzione) inibisce la fototassi. L'inibizione della risposta fototattica può essere dovuta a semplice riduzione dell'attività locomotoria, oppure può essere riferibile ad un più complesso livello comportamentale, ossia alla perdita dell'orientamento del movimento. Nel presente lavoro è stata presa in considerazione l'attività locomotoria di larve di Culex pipiens, specie che, com'è noto, è largamente diffusa sia in acque inquinate che pulite.

Materiali e metodi

Alcuni esperimenti preliminari diretti allo studio del comportamento fototattico realizzati sia con l'apparecchio di Simonet che con un apparecchio montabile su microscopio stereo, costituito da due camere divise da tramezzo mobile e collegato mediante finestra in perspex ad una lampada a fibra ottica, che ai è rilevato adatto all'osservazione della fototassi in Aedes aegypti. non hanno dimostrato fototassi in larve al I stadio di Culex pipiens molestus. Al microscopio. comunque. si notava che in presenza di solfato di rame le larve tendevano ad essere immobili.

Una quantificazione dell'osservazione eseguita riguardo la tendenza all'immobilità delle larve in presenza di solfato di rame è stata raggiunta con la seguente tecnica: in un contenitore cilindrico in perspex sul fondo del quale era disegnata una linea rossa lungo i1 diametro di 4 cm, venivano collocate in 7 m1 di soluzione di 240 mg/l di CuS04. 5H20 larve di Culex pipiens molestus a 25 C. A determinati intervalli di tempo venivano conteggiati entro 5 - minuti rutti i passaggi delle larve che. spostandosi, attraversavano la linea rossa.

I1 conteggio era eseguito al microscopio a ingrandimento di 60x: a tale

ingrandimento la linea era totalmente visibile, essendo quasi coincidente con il diametro del campo microscopico. Ci si aspetta che la sostanza tossica influisca sul movimento di ogni larva e quindi sulla probabilità di questa di attraversare la linea una o più volte.

Perciò questo metodo di quantificazione dell'effetto tossico non è basato su una risposta "tutto o niente" di ogni singolo individuo, ma sulla integra- zione delle risposte graduate degli individui.

Risultati

In uno degli esperimenti eseguiti con tale metodo si notava una progressi- va diminuzione dell'attività locomotoria determinata a intervalli di 30 minuti (da O a 150 minuti) su un lotto di 50 larve di circa 24 ore di età (conteggi dei passaggi delle larve in successione: 155, 91, 81. 50, 14).

Alla caduta finale contribuisce una certa mortalitl (circa 38%) che si verifica dopo 150 minuti. Si nota, inoltre, man mano che diminuisce l'attività locomotoria, l'insorgere di movimenti vibratori in parecchie larve.

Discussione

In conclusione si può dire che questo risultato convaliderebbe l'ipotesi di Simonet e coll. secondo i quali l'azione tossica di quei composti di metalli pesanti, che essendo osmoticamente attivi, penetrano attraverso le papille anali, si verificherebbe, nelle larve, a livello della respirazione. Ciò si tradurrebbe. almeno per quanto riguarda il rame, in una riduzione dell'attività locomotoria. Tale riduzione starebbe alla base della perdita della risposta fototattica nella specie e negli stadi larvali caratterizzati da fototassi.

Esperimenti in corso. che dimostrano finora fototassi negativa in larve di Culex pipiens al I1 stadio, si aggiungeranno a quelli descritti per completare una ricerca, il cui fine ultimo è di accertare se Culex pipiens può validamente aggiungersi ad Aedes aegypti in tests ecotossicologici.

BIBLIOGRAFIA

1. SIMONET, D.E., KNAUSEMBERG, W.I., TOWNSEND, L.B. Jr & TORNER, E.C. Jr. 1978. A biomonitoring procedure utilizing negative phototaxis o£ first instar Aedes aegypti larvae. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 7: 339-347.

Ann 1st Super. Sanità Voi. 22. N. l(1986). pp. 311-314

EtI?YELLENZA DI ALCUNI INSETTICIDI SU MUSCA DOMESTICA

n. Scirocchi (a) e A. Milita (b)

[a) Ser~iZio Interzonale Disinfezione Disinfestazione USL Roma 16 ( h ) USL Latina 3

':- - Laboratory studies were made to determine if some insecticides were repellent to four strains of Musca domestica; 10 flies were introduced in a t ubic cage with only half walls treated. The degree of repellency was assessed hy counting the nuniber of flies present on the walls treated at the end of each two minutes during eighty minutes (forty replicates). The results are reported m d discussed. Riassunto. Sono state eseguite ricerche di laboratorio per detenninare la repellenza di alcuni insetticidi contro 4 ceppi di domestica; 10 mosche erano introdotte in una gabbia con meta delle pareti trattate. I1 grado di xepellenza era valutata contando il numero di mosche presenti sulle pareti t.rattate ogni due minuti per un periodo di 8 minuti (10 repliche). I risultati vengono presentati analiticamente e discussi.

L ritroduzione

1x1 questo lavoro sono stati studiati alcuni aspetti delle capacita delle mosche di awertire la presenza di un insetticida su una superficie trattata e conse- quentemente di evitarne il prolungato contatto. Si B cercato quindi di valutare se il fenomeno della repellenza, studiato da altri autori su differenti specie di insetti ma non conosciuto per la mosca domestica, giuochi un ruolo importante sull'efficacia di un trattamento contro questo insetto e se la pressione operata dagli insetticidi selezioni ceppi di mosche particolarmente sensibili all'azione repellente dei tossici.

Materiali e metodi.

Sono state usate delle gabbie cubiche con telaio inox e parti in tutte delle dimensione di cm 25x30~30. Dopo aver teoricamente suddiviso le gabbie in due parti uguali con una sezione longitudinale, ed aver verificato che alle condizioni sperimentali, lintrodotte nelle gabbie si appoggiavano indifferentemente sulle due parti, una semigabbia di ogni gabbia veniva trattata con una delle seguenti soluzioni insettivide in acetone: Malathion 0,125%; DDT 0,125%; Fenthion 0,125%; Propoxur 0.00125%; Permetrina 0,00125%; Cipermetrina 0,00125%. Inoltre come prodotto di riferimento era impiegato il repellente N-N-dietilto- Luamide 0,5% (alle concentrazioni prescelte, le mosche non presentavano sintomi di intossicazione durante le prove). Le mosche usate erano femmine di una settimana di età dei ceppi: - CEPPO SENSIBILE: fornito dall'Istituto Lazzaro Spallanzani di Pavia; - CEPW LATINA F (1) : originato da mosche raccolte in natura in una zona

della Provincia di Latina, ampiamente trattata con insetticidi per uso sia agricolo che sanitario (1);

- CEPPO LATINA F (2) : selezionato per 5 generazioni con l'N-N-dietiltoluamide partendo dal CEPPO LATINA;

- CEPPO LATINA F (B,5): selezionato per 5 generazioni lartendo dal CEPPO LATINA F (A,4) ;

I CEPPI LATINA F (A,4) ed (A,5) erano selezionati offrendo loro contemporaneamente esche zuccherine trattate e non trattate. La progressione di tale selezione 6 riportata in Tabella 1.Ad ogni prova venivano introdotte nelle gab bie 10 mosche. Ogni gabbia era ruotata di 9O0ogni 2'con allontanamento delle mo sche appoggiate fino a compiere una rotazione completa attorno al suo asse in 8'. Le mosche appoggiate sulle due semigabbie erano contate manualmente ogni Z'.Con ogni prodotto venivano effettuate l0 repliche per un totale complessivo di 80'di sperimentazione. I1 controllo era effettuato con le due semigabbie non trattate.

Risultati e conclusioni.

Dal quoziente di repellenza (Tab. 21, dato dal rapporto del numero di mosche posate sulla parete non trattata e sulla parete trattata si evidenzia la repellenza dei differenti prodotti sui ceppi saggiati. Nella Tab. 3 si evidenzia che tutti i ceppi mostrano repellenza per 1'N-N- dietiltoluamide mentre solo il ceppo selezionato con DM: mostra repellenza per il DDT. Inoltre apprezzabili risposte di repellenza si hanno nei confronti dei vari principi attivi con significativita però inferiore al 99%. Dalla Tab. 4 si evidenzia oltre all'omogeneitti dei controlli, che conferma la rispondenza del metodo usato, che N-N-dietiltoluamide ha selezionato in poche generazioni, un ceppo che risulta molto pia sensibile all'azione repellente di questo prodotto sia del ceppo di origine che del CEPPO SENSIBILE. Ci ha inoltre il mantenimento di significativita di repellenza allo N-N-dietiltoluamide nel CEPPO F (B,5) dopo 5 generazioni prive di pressione selettiva con questo prodotto. I1 CEPPO F (8.5) selezionato con DDT ha repellenza sia per il DDT che per la Pennetrina.

Tabella 1.- Soprawivenza in percentuale delle mosche delle generazioni indicate del CEPPO LATINA, sottoposte a pressione selettiva per la repellenza allo N-N-dietiltoluamide F (A,1-4) ed al DDT F (B, 1-5).

GENERAZIONI SOPRAWISSUTE % GENERAZIONI SOPRAVVISSUTE %

F (A,1) 45.5 F (B,1) 20.0 F (A,2) 75.0 F (B,2) 30.0 F (A,3) 96.0 F (B,3) 50.0 F (A.4) 97.5 F (B.4) 76.0

Tabella 2.- Quozienti di repellenzar Rapporto del numero di mosche poggiate sulla superficie non trattata e trattata.

INSETTICIDA CEPPO SENSIBILE CEPPO LATINA CEPPO LATINA CEPPO LATINA F (1) I' (A,4) F (Bt5)

Controllo 0.97 1 ,O3 1.03 0.96 N-N-dietiltol. 2,33 1,94 6,14 3.93 Malathion 1,26 1 ,l1 1.65 1,70 Fenthion 1.27 1,25 1,53 1.33 Permetrina 1,27 1,12 1,28 1,35 ~ropoxur 1,46 1,20 1,68 1,66 Cipektrina 1,33 1,11 1,35 1,39 DDT 1,61 1,51 1,71 3,93

'K'dbella 3.- Confronto della repellenza nelle gabbie trattate con i vari insetticidi e le gabbie di controllo non trattate sui quattro ceppi saggiati. Test del Chi (P.EO.01 significatività 99%).

CEPPO SENSIBILE CEPPO LATINA CEPPO LATINA CEPPO LATINA F (1) F (At4) F (Bt5)

Controllo chi2 GxL P Chi GxL P Chi2 GxL P chi2 GxL P 2

N-N-dietiltoluam. 9.82 1 0.01 11.3 1 0.01 30.3 1 0.01 21.9 1 0.01 Malathion 1.22 1 0.30 0.3 10.80 1.3 10.30 1.5 10.30 Fenthion 1.20 1 0.30 0.3 10.80 1.3 10.30 1.2 10.55 Permetrina 1.20 1 0.30 0.4 1 0.50 0.771 0.50 2.1 1 0.10 uropoxur 1.63 1 0.20 0.5 10.50 1.4 10.20 2.2 10.10 Cipermetrina 1.62 1 0.20 0.4 10.50 0.8 10.40 1.0 10.30 DDT 3.16 1 0.50 2.0 1 0.30 2.5 1 0.10 21.91 0.01

Tabella 4.- Confronto della repellenza dei2ceppi saggiati nei confronti dei differenti prodotti insetticidi. Test del chi (P=0.01 significativita 99%).

Controllo N-N-dietiltol. Malathion

chi2 GXL P chi2 GXL P chi2 GXL P SENSIBILE-LT F (1) 0.180 1 0.70 1.47 1 0.25 0.72 1 0.40 SENSIBILE-LT F (A,4) 0.180 1 0.70 29.83 1 0.01 3.4 1 0.05 SEXSIBILE-LTF(B,5) 0.005 1 0.95 10.10 1 0.01 4.35 1 0.04 LT F (1)-LT F (Ap4) 0.001 1 0.95 43.86 1 0.01 4.38 1 0.04 LTF(1)-LTF(B,5) 0.24 1 0.80 19.12 1 0.01 4.61 1 0.04 LT F (A,4)-LT F (B,5) 0.24 1 0.80 5.50 1 0.02 0.04 1 0.90

Fenthion Permetrina Cipermetrina

chi2 G ~ L P chi2 G ~ L P chi2 GXL P SENSIBILE-LT F (1) 0.05 1 0.90 1.29 1 0.30 1.84 1 0.20 SENSIBILE-LT F (A,4) 1.85 1 0.30 0.04 1 0.90 0.88 1 0.50 SENSIBILE-LTF(B,5) 3.50 1 0.05 3.80 1 0.05 0.75 1 0.50 LT F (1)-LT F (A,4) 3.77 1 0.05 0.85 1 0.40 5.28 1 0.02 LT F (1)-LT F (B,5) 3.77 1 0.05 9.51 1 0.01 4.95 1 0.05 LT F (A,4)-LT F (B,5) 0.33 1 0.70 4.66 1 0.05 0.05 1 0.90

~ r o p o w r DDT

chi2 GXL P chi2 G ~ L P SENSIBILE-LT F (1) 1.46 1 0.30 1.87 1 0.30 SENSIBILE-LT F (A,4) 0.005 1 0.95 0.77 1 0.70 SENSIBILE-LTF(B,5) 1.49 1 0.30 31.31 1 0.01 LT F (1)-LT F (A,4) 1.63 1 0.20 5.04 1 0.02 LT F (1)-LT F (B,5) 5.90 1 0.02 47.87 1 0.01 LT F (A,4)-LT F (B,5) 1.32 1 0.30 22.44 1 0.01

BIBLIOGRAFIA

1. SCIROCCHI A. h DELLA ROCCA M. 1981. Il controiio della mosca domestica in provincia di Latina. Rivista di Parassitologia, : 307-320.

Ann. 1st. Super. h i t à Vol. 22, N. l(1986). pp. 315-318

WSPOSTE COMPORTAMENTALI DI MUCCA OOMESTICA IN PRESENZA DI SUPERFICI TRATTATE < i >N XNSETPICIDI

A, Scirocchi (a) e A. Milita (b)

(a ) Servizio Interzonale Disinfezione Disinfestazioni USLA Roma 16 :b) USL Latina 3

'7iumnary.- Laboratory tests have been carried out in order to investigate tbe z<~pellency exercised by N-N-dietiltoluamide, Malathion, Fenthion, Permetrina, i'ropoxur, Cipermetrina and DDT towarp domestica. The test techniques was f h e same described in a previous work . The response of four strains of flies to vnrious chemicals is reported and discussed.

Riassunto.- Con una metodologia del tutto simile a quella illustrata nel prece dente lavoro e con gli stessi ceppi di mosche, è stato ulteriormente studiaio il fenomeno della repellenza di alcuni prodotti insetticidi su M 3 domestica . Materiali e metodi.

1x1 questa serie di prove si è proweduto ad introdurre nelle gabbie una mosca alla volta. La gabbia veniva ruotata di 90' ogni 2' per quattro volte, allonta- nando ogni volta la mosca appoggiata sulle pareti. Ogni prodotto è stato saggia- to in 25 prove successive valutando con un poligrafo a pia canali per la regi- strazione degli eventi i seguenti parametri: 1) Tempi di appoggio della mosca sulle superfici trattate e non trattate; 2) Tempi di cammino della mosca su dette superfici; 3) Tempi di volo.

i risultati sono illustrati nelle Tabelle 1,2,3 e 4.

Nella Tab. 1 risulta che le mosche del CEPPO SENSIBILE awertono la presenza dell'insetticida, che produce uno stimo al moto ed al volo, e restano meno tempo appoggiate sulla superficie trattata, con una significativita del 99% per i1 N-N-dietiltoluamide, il Propoxur ed il DDT; inoltre camminano di pia sulla superficie trattata e volano maggiormente rispetto al controllo.

te mosche del CEPPO LATINA, Tab. 2, raccolte in natura e quindi p selezionate dall'ambiente trattato con insetticidi d'uso agricolo e sanitario , restano meno tempo &ggiate sulla superficie trattata che su quella non trattata: significa- tività del 99% per tutti gli insetticidi, tranne che per la Permetrina che presenta una significatività del 95%.

r,e mosche del CEPPO F (A ,4 ) , Tab. 3, awertono La presenza degli insetticidi e restano meno tempo poggiate sulla semigabbia trattata. La massima repellenza si ha con N-N-dietiltoluamide, Propoxur e DDT con una significativita del 99%.

Tabella 1.- CEPPO SENSIBILE: Confronto della risposte comportamentali di Musca domestica nelle gabbie con pareti non trattate (controllo) e trattate.

Controllo-trattamento Ferme super- Cammino super- Volo ficie trattata ficie trattata

chi2 GxL P chi2 GxL P chi2 GxL P N-N-dietiltol~amide 28.57 1 0.01 5.11 1 0.05 5.67 1 0.02 Malathion 1.04 1 0.30 0.22 1 0.70 4.00 1 0.05 Fenthion 1.68 1 0.20 2.20 1 0.20 1.03 1 0.30 Permetrina 4.22 1 0.05 5.97 1 0.02 0.06 1 0.80 Propoxur 13.61 1 0.01 3.61 1 0.05 0.11 1 0.70 Cipennetrina 1.65 1 0.20 5.92 1 0.02 0.33 1 0.70 DDT 11.79 1 0.01 4.28 1 0.05 0.05 1 0.90

Tabella 2.- CEPPO LATINA: Confronto della risposte canportamentali di domestica nelle gabbie con pareti non trattate (controllo) e trattate.

Controllo-trattamento Ferme super- Camino super- Volo ficie trattata ficie trattata

Malathion 10.45 1 0.01 2.36 1 0.10 1.06 1 0.30 Fenthion 6.66 1 0.01 2.67 1 0.10 3.59 1 0.05 Permetrina 4.95 1 0.05 9.58 1 0.01 1.90 1 0.30 ~ropoxur 13.69 1 0.01 10.88 1 0.01 0.77 1 0.80 Cipermetrina 7.13 1 0.01 1.81 1 0.30 0.97 1 0.70 DDT 14.69 1 0.01 14.41 1 0.01 6.23 1 0.01

Tabella 3.- CEPPO F (A,4)Confronto della risposte comportamentali di domestica nelle gabbie con pareti non trattate (controllo) e trattate.

Controllo-trattamento Ferme super- Cammino super- Volo ficie trattata ficie trattata

chi2 GxL P chi2 GxL P chi2 GxL P N-N-dietiltoluamide 31.91 1 0.01 5.55 1 0.02 0.81 1 0.30 Malathion 5.55 1 0.02 0.70 1 0.50 0.08 1 0.90 Fenthion 4.96 1 0.05 1.36 1 0.30 0.04 1 0.95 Permetrina 5.26 1 0.02 3.87 1 0.05 0.001 1 0.95 Propoxur 12.981 0.01 5.57 1 0 . 0 2 0.17 1 0.70 Cipermetrina 2.53 1 0.10 6.44 1 0.01 0.02 1 0.80 DDT 9.82 1 0.01 3.01 1 0.05 0.15 1 0.70

'Tabella 4.- CEPPO F (B,5):Confronto della risposte comportamentali di Musca <lr~mestica .. nelle gabbie con pareti non trattate (controllo) e trattate.

?ontrollo-trattamento Ferme super- Cammino super- Volo ficie trattata ficie trattata

chiL GxL P chiL GxL P chiL GxL P N-N-dietiltoluamide 24.57 1 0.01 4.52 1 0.05 0.18 1 0.70 Malathion 3.06 1 0.05 0.84 1 0.50 0.15 1 0.70 E'enthion 2.45 1 0.01 0.99 1 0.50 0.058 1 0.80 Permetrina 3.83 1 0.05 5.28 1 0.02 0.05 1 0.95 ~'ropoxur 14.73 1 0.01 5.72 1 0.02 0.08 1 0.90 Cipermetrina 1.05 1 0.30 4.44 1 0.05 0.13 1 0.60 DDT 18.42 1 0.01 9.22 1 0.01 0.66 1 0.40

Le mosche camminano di pih sulla superficie trattata con significatività del 99% per la Cipermetrina. Le mosche del CEPPO F (B,5) awertono la presenza degli insetticidi e restano meno tempo appoggiate sulle superfici trattate. Significa- tivita del 99% con N-N-dietiltoluamide, Propoxur e DDT. Camminano di pih silla superficie trattata, significatività del 99%, per il DDT.

Questi dati confermano la capacità delle mosche di awertire la presenza dei tossici e di evitarne un contatto prolungato, evidenziando la capacità selettiva per la repellenza, di un ambiente naturale trattato con insetticidi, e la rapidita con cui alcuni prodotti sono in grado di selezionare ceppi repellenti in poche generazioni. Inoltre, viene evidenziata la stabilita della repellenza nei ceppi selezionati, per pib generazioni, e la possibilità di repellenza crociata tra differenti prodotti.

BIBLIOGRAFIA

1. SCHIROCCHI A. & MILITA A. 1984. Repellenze di alcuni insetticidi du Musca- domestica. Atti del XIII Congresso della Societa Italiana di Parassitolo- gia, Roma, 3-5 Dicembre 1984.

2. SCIROCCHI A. & DFZLA ROCCA M. 1981. I1 controllo della mosca domestica in provincia di Latina. Rivista di Parassitologia, 42: 307-320.

3. SACCA' G., MAGRONE R. & SCIROCCHI A. 1965. Sulla repellenza esercitata da alcuni chemosterilanti verso Musca domestica L. Rivista di Parassitologia, 26: 61-66.

Ana 1% Super. Snnihi Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 319-322

1:ONTROLLO DELLA MALARIA: LUCI ED OMBRE

M. Maffi

t:ctvi, Genova

Kiassunto - Alla luce del costante e travolgente progresso scientifico vengono valutati alcuni aspetti e prospettate alcune necessità nel controllo della malaria.

Cumary - Taking into account the constant and impetuous scientific progress, some aspects of malaria contro1 campaigns are revised and some suggestions inade.

Oltre ad awicinarci alle verits prime, gli enormi progressi conoscitivi ottenuti in campo scientifico negli ultimi decenni - grazie al moltiplicarsi ed affinarsi dei mezzi d'indagine - hanno messo anche in evidenza la frequenza e l'ampiezza delle differenze. Sottolineando quanto sia grande il ventaglio delle realtà, e quanto frequentemente queste abbiano valore solo temporaneo.

Nell'ambito della malaria umana. questo aspetto - delle differenze - si è rivelato ampio e variegato: in effetti, i continui ed importanti contributi nei campi della genetica, delle immunità, delle terapie. degli insetticidi - campi tutti in movimento -, ed i progressi nell'ecologia ed etologia, hanno facilita- to l'analisi approfondita e permesso più esatte valutazioni dei fattori in gioco - il parassita, il vettore, l'uomo, l'ambiente -, del loro vario intrec- cio, della risultante malattia. Oggi parliamo di un parassita a due generi, a specie composte da un crescente numero di ceppi, di ipnozoiti. Parliamo di specie vettrici frazionate in complessi. E vediamo crescere il numero, la varietà e la variabilità degli ambienti sia naturali che legati all'uomo; mentre differenziazioni, instabilità, resistenze incidono sul comportamento di tutti: vettore, uomo e persino parassita.

Ne risulta una tale gamma di differenze - singole o composite - che pare legittimo chiederci se non sia scientificamente più corretto pensare e parlare in termini di malarie umane. al plurale, al di là degli schemi oggi in uso.

Questo progressivo e costante processo di acquisizioni scientifiche sulla malaria, e di conseguente revisione della realtà nosologica, non poteva non ripercuotersi, in campo pratico, sull'azione di lotta antimalarica che si va svolgendo nel mondo. E' infatti logico che ci si ponesse la domanda se, alla luce delle nuove conoscenze. i metodi di lotta risultassero aggiornati e razionali.

E' noto che decenni fa la lotta contro la malaria fu impostata - su basi economiche e validissime, allora - in maniera univoca, con un comando centra- lizzato, ideatore e mandante di una strategia uniforme, applicata sul terreno dalle forze operative e basata sull'interruzione della trasmissione, valendosi degli insetticidi ad azione residua in applicazione intradomiciliare. Uno schema organizzativo e operativo da esercito in guerra. Con un obiettivo da tempi bellici: l'eradicazione della malaria. Obiettivo finale, da realizzarsi a breve scadenza.

La validità di tale impostazione nella lotta antimalarica è stata ampiamente dimostrata dal successo ottenuto in vaste aree del globo: la lotta è stata coronata dall'awenuta eradicazione della malaria. soprattutto nei paesi

a sviluppo avanzato ed al di fuori delle fascie dei tropici. Non a livello globale, dunque, ma a livello di quelle aree dove esisteva una corrispondenza fra la malaria locale la strategia usata.

Dove il successo totale è mancato lo smacco è stato attribuito a varie ragioni - tecniche. amministrative, operazionali, sociali, ecc. -; e talvolta si è duramente lottato per perfezionarsi, sempre nello spirito dell'originale strategia. In realtà - in retrospettiva - è assai probabile che gli smacchi fossero da attribuire semplicemente all'inadeguatezza della strategia usata. In ,realtà, le malarie esistenti in queste aree del globo non erano passibili di "eradicazione" secondo lo schema fisso previsto. Erano malarie differenti - come le indagini continuano a mettere in evidenza -, e come tali andavano e vanno valutate ed affrontate, volta a volta, con spirito scientifico sì, ma flessibile e realistico.

Mentre un tempo si era affrontata la malaria come se fosse stato un esercito invasore a strategia fissa, e perciò ci si era valsi dell'organizza- zione a tipo di esercito di cui detto, ora ci si rendeva conto di trovarsi di fronte a bande di criminali - limitate o vaste - che operavano con strategie varie e variabili. E che l'unico modo realistico ed efficace per affrontarle era di creare delle forze dell'ordine. Da un obiettivo finale e globale di "eradicazione" della malaria umana, ottenuta grazie ad una strategia unica, si passava ad una azione discontinua e continuativa, illimitata nel tempo, condotta con tempismo. flessibilità e prammatismo, variando nella predilezione dei metodi, e puntando ad un efficiente "controllo" delle malarie. Le forze del- l'ordine contro i criminali. E qui è bene sottolineare subito alcuni punti fondamentali.

Il primo è che - per quanto risulta da quanto detto sopra - vi è un netto divario concettuale e di esecuzione fra "eradicazione" e "c~ntrollo'~. E che è assai lontano dalla realtà delle cose chi pensi che il controllo sia una sottospecie di eradicazione, e che consista nel praticare qualche spruzzamento intradomiciliare - magari eseguito scadentemente, da personale raffezzonato - nel caso di epidemie incombenti; o, peggio, già in corso. Gli spruzzamenti intradomiciliari con insetticidi ad azione residua - purché eseguiti corretta- mente - sono certamente, in taluni casi, una delle armi valide nelle lotte di "controllo" della malaria; ma sono semplicemente una delle armi.

Il secondo punto è che l'organizzare una lotta di controllo della malaria - ed intendo l'organizzarla come si deve - è certamente assai piit difficile e complesso che organizzare quella di etadicazione. Esattamente come è assai più difficile preparare le forze dell'ordine che le fanterie, ed apprestare i mezzi per quelle in pace che per quest'ultime in guerra. Infatti, $e campagne di controllo richiedono una varietà di interventi che devono sì essere indicati ad alto livello da autorità del ramo, ma che devono poi essere scelti ed applicati sul terreno, rapidamente, in strategie varie e mutevoli, dal personale nazionale dei quadri intermedi - soprattutto - ed inferiori. Questo deve essere motivato, selezionato, preparato, epidemiologicamente ferrato sulla realtà locale, capace di agire in notevole autonomia; e sempre in termini di stretta e fiduciosa collaborazione con gli esponenti locali delle altre strutture econo- mico-sociali, con il pubblico. e con le forze sanitarie, delle quali è parte integrante.

Non vi è nulla di particolarmente originale in quanto detto - che è stato sottolineato dal1'0M~ sin da anni (1.2); ma visioni globali del futuro e relative necessità (3) e visioni più specifiche (4) giustificano un richiamo.

In una campagna di controllo i quadri. soprattutto gli intermedi, devono avere un livello culturale conoscitivo di buon livello, nel campo specifico. Strettamente nazionale, il personale applicherà in un ambiente che è il suo ciò che ha appreso in corsi di preparazione assai più ampi di quanto non fossero neceasari per attivita di eradicazione. Molto è stato fatto in questo campo dalle organizzazioni internazionali ed in sede nazionale: ma molto resta da fare, se 8i considera il continuo flusso di contributi scientifici, e la loro

E' questo un terzo punto fondamentale: il trasferimento in termini sempli- <'L delle acquisizioni ad alto livello, in modo che vengano assimilate e appli- cate alla realtà locale, giudiziosamente. E' cosa certa che un controllo efficace dipende da come il personale nazionale imposta l'azione sul terreno: e c i 6 dipende da quanto gli è stato fornito in cognizioni specifiche, e come. E' dunque fondamentale. ripetiamo, allenare i quadri nazionali per il controllo, l'nrnirli di informazione recente ed adeguata - in maniera comprensibile -, ed iisercitare un costante lavoro di valutazione.

In quest'ottica è opportuno elencare alcuni campi, soprattutto a sfondo pratico, per i quali è sentita la necessità di soluzioni precise e mirate.

1) Indagare su metodi di colorazione che eliminino il dubbio - sentito in pcticolare a livello d'ospedale - se preferire lo striscio o la goccia spessa. Oggi, quest'ultima è spesso scartata perché lenta ad asciugare, e quindi tioggetta a staccarsi quando la si lava dopo colorazione.

2) Arricchire l'armamentario diagnostico del personale con l'insegnare al personale a palpare la milza. Ciò favorirebbe il reperto di- e E.

3) Chiarire. una volta per tutte, che ogni malarico ha diritto alla cura. 4) Definire un peso univoco - invece dell'attuale dicotomia fra peso

"hase" e peso "totale" - per taluni antimalarici (5). 5) Produrre, a livello ditte, gli antimalarici per gruppi di età - o di

peso - in strisce protettive. a colori diversi. fissi. Ai governi l'aggiungere scritte e/o disegni emblematici di gruppo d'età ( 5 ) .

6) Chiarire definitivamente la pericolosità o no, e la posologia degli n-aminochinolinici.

7) Aumentare l'informazione sulle misure di difesa complementari: retine, zanzariere (impregnate), lotta biologica, larvicidi chimici, variazioni d'am- hiente, pozzi e/o cisterne coperte, giornate secche, ecc.

8) Creare istituti e/o individui qualificati d'appoggio per i casi più complessi. Soprastrutture, dunque, sia scientifiche che ospitaliere. Tutto questo contribuirà ad una più valida lotta di controllo della malaria.

BIBLIOGRAFIA

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INDAGINE ENTOMOLOGICA SUI POTENZIALI VETTORI DI BLUE-TONGUE NELL'ITALIA CENTRO MERIDIONALE ED INSULARE

C. Gallo (a), V. Guercio (a), S. Caracappa (a), D. Rutili (b) e P.J. Wilkinson (C)

(a) Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Palermo (b) Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'umbria e delle Marche, Perugia (C) The Anima1 Virus Research Institute, Pirbright

Riassunto. - Gli M. hanno eseguito una indagine entomologica sulla potenzia- le presenza di vettori del virus Blue-tongue nelltItalia centro meridionale e insulare.

Summary (Entornological investigation on the presence of potential Bluetongue vectors in southern and insular Italy). - Authors made an entomological inve stigation on the presence of Bluetongue virus vectors in southern and insular Italy.

Introduzione

La Blue-tongue o febbre catarrale dei ruminanti è una malattia infet- tiva. non contagiosa, dei ruminanti domestici e selvatici, trasmessa da artropodi vettori. I1 virus appartiene alla famiglia Reoviridae genere orbivirus R.N.A. 69 mn 32 capsumeri (2-13).

La malattia dopo essere stata per secoli circoscritta ad alcune Regioni delltAfrica Australe (3), in questi ultimi anni si è diffusa in tutti i conti - nenti (4-5-6).

Nel Bacino del Mediterraneo quasi tutti i Paesi ne sono venuti a contatto sia direttamente che indirettamente. Questo dovuto ai sempre pia frequenti scambi commerciali con i Paesi ove la malattia è endemica.Le Regioni centro meridionali ed insulari della nostra Penisola sono considerate zone ad alto rischio (10) o zone epidemiche secondo la suddivisione geografica di Seller (12).

Constatato che in Italia si hanno pochi dati sulla diffusione dei vettori del virus Blue-tongue, abbiamo eseguito un monitoraggio per individuare gli insetti responsabili (11).

Materiali e Metodi

I Culicoides spp venivano presi con una trappola a luce, con motore aspirante in grado di attirare e trascinare gli insetti in recipienti con soluzione detergente.

La trappola si collocava, al tramonto, al riparo di correnti d'aria, in vicinanza di stalle o recinti con animali. Essa restava montata tutta la

notte e al mattino seguente gli insetti catturati venivano prelevati e conservati in contenitori. a temperatura ambiente, con aggiunta di formalina al 5%. Una prima selezione si effettuava nel nostro Istituto; i Culicoides spp erano inviati allVAnimal Virus Research Institute of Pirbright per l'iden - - tif icazione.

Risultati e Conclusioni

Sono stati effettuati 30 campionamenti in varie zone della Penisola i cui risultati sono riportati nella Tab. 1.

La diffusione dei flebotomi è risultata costante in tutte le localita esaminate, con delle concentrazioni maggiori nelle località costiere.

Sono stati identificati 14 Culicoides con presenza quasi costante di C. obsoletus, C. newstadi e C. pulicaris; C. obsoletus è ritenuto vettore del virus Blue-tongue a Cipro (8-9-1); non è stato messo in evidenza C.imico- la, vettore classico. - Tabella 1 - Specie di vettori,numero di campionamenti e localita considerate

Localita Numero Flebotomi a> C U L I C O I D E S ua

campioni più diffusi

obsoletus newstadi pulicaris

UMBRIA

Perugia 6 37 115 8 61

CALABRIA

Cosenza 4 2 104 49 6 Catanzaro 4 2005 235 35 16

SICILIA

Agrigento 3 12480 71 198 3 CL 3 332 5 208 2 Palermo 1 7 77 2 - Ragusa 5 4 30 40 - Trapani 5 263 1 9 1

Tabella 2 - Specie di Culicoides catturati nelle 30 localita Presenza costante Presenza sporadica C. obsoletus O C. coluzii C. newstadi + C. geigelensis C. pulicaris + C. kurensis C. circumscriptus C. pictipennis C. lailae C. rnaritirnus + Vettore Filaria C. catanei C. seifadinei O " Bluetongue e

C. tauricus Peste Equina C. parroti +

BIBLIOGRAFIA

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10 - Poli G.. (1982). Bluetongue: una malattia esotica ma fino a quando? Praxis vet.. - 2. 5

11 - RIVOSECCHI L. (1977) Gruppi di vettori di maggiore importanza sanitaria in Italia, Parassitologia Vol. XIX no 3

12 - SELLER R.F.. TAYLOR W.P. (1980). Epidemiology of Bluetongue and the import and export of livestock, semen and embryos. Bull. O.I.E.. - 92. 587

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Ann I* Supa. Sanai) Vol. 22, N. 1 (1986), pp. 327-330

I BIOTOFI LARVALI E L'ISOLAMENTO DEGLI STADI PREIMAGINALI DI LEPTOCONOPS (HOLOCONOPS) GALLICIIS CLASTRIER, 1973 (DIPTERA, CERATOPOGONIDAE)

M. Cocchi, D. Menichetti. E. Vichi & A. Tamburro

Sezione di Zoologia Medica, 1I.S.L. no 28. Grosseto

Riassunto. - Si riportano i dati sul primo isolamento, per l'Italia. degli stadi preimaginali di Leptoconops (Holoconops) gallicus Clastrier, 1973. La

specie. sembra completare almeno due generazioni annuali.

Summary. - Data on the first isolation, for Italy. of the preimaginal phases of Leptoconops (Holoconops) gallicus Clastrier, 1973. are reported. This species seems to complete two annua1 generations at least.

Introduzione

In relazione ai problemi igienico-sanitari ed economici spesso arrecati. nella stagione estiva. dalla presenza massiva di Ceratopogonidi del genere Leptoconops Skuse, 1980, soprattutto nella zona litoranea del grossetano, la Sezione di Zoologia Medica ha intrapreso dal 1980, un programma di ricerca per acquisire nuove conoscenze sulla biologia delle specie, anche al fine di valutare possibili strategie per il controllo "ecologico" delle pia moleste.

Si B stabilito di puntare. in primo luogo, al reperimento degli stadi preimaginali ed adulti di "Leptoconops (Holoconops) Kerteszi". ritenendo che

in Italia, di contro agli studi condotti in altri Paesi 1 3 , ne fossero stati identificati con minore precisione. i luoghi di sviluppo (4, 5).

Le indagini sono state incentrate su uno degli invasi salmastri retroduna- li, a nord della foce del fiume Ombrone. denominati "chiari" o "bozzi". prima di allora mai ispezionati a fondo per Leptoconops spp..

Materiali e metodi

Tra il 10 maggio (oltre un mese dopo i primi sfarfallamenti osservati sul territorio) ed il 30 agosto 1980, su distinti punti di sponda del "chiaro", sono stati collocati 4 gruppi di trappole di sfarfallamento ( 6 ) . ognuno formato da 4 unità. Le ispezioni alle casse sono state eseguite quotidianamente. sino al loro ritiro. il 15 novembre. Entro quest'ultima data. a partire dal 19 maggio, abbiamo inoltre prelevato sabbia per 521,5 Kg..mediante campioni profondi 15 cm e del peso di Kg.1, i quali venivano flottati in laboratorio en-

tro 30 ore dal prelievo, secondo una tecnica adattata da Clastrier (7). Degli adulti e degli stadi preimaginali reperiti, conservati in alcool a

70°, si è solitamente proceduto al montaggio in liquido di Faure. Per la classificazione delle alate, si è seguita la recente revisione

sistematica del sottogenere Holoconops (8, 9) con la quale si attribuiscono a specie distinte, esemplari finora raggruppati sotto la generica dizione: "L. - (H.) Kerteszi". -

Risultati

La ricerca degli stadi preimaginali, pur eseguita nelle 4 zone con diversa periodicità e numero di campionamenti, ha consentito d'isolare, sin dal 18 maggio '80, forme larvali e ninfali di Leptoconops (Holoconops) gallicus Clastrier. 1973 (71, le cui lunghezze medie, stabilite rispettivamente

su un lotto di 50 larve di IV stadio e di 50 ninfe, sono risultate: 3,38 e 2,06 mm. In totale, sono stati recuperati 3327 esemplari; I stadio: 114 (3,4%); I1 st.: 515 (15.4%); I11 st.: 1013 (30,4%); IV st.: 1259 (37,8%); ninfe: 436 (l3,lO%).

La cattura nelle trappole ha fornito 195 alate (98 bd e 97 W), con una media di oltre 21 esemplari per ciascuna delle 9 trappole positive, tutte collocate su suolo sabbioso variabilmente misto a limo e materiale organico finemen- te decomposto, pressochè privo di vegetazione macroscopica. Tratti prevalente-

mente argillosi, o depressioni umide entro il giuncheto, hanno dato costantemente esito negativo.

Discussione

Nell'area pifi frequentemente esaminata per l'isolamento degli stadi preima-

ginali, si è osservata, dopo il 15 luglio, la scomparsa di primi stadi e ninfe; queste, sono poi state reperite da settembre alla metà di ottobre, mentre l'isolamento dei primi stadi è risultato di nuovo quantitativamente

apprezzabile alla fine di settembre. In particolare, i risultati di 8 campionamenti, eseguiti tra il 5 settembre ed il 15 novembre, hanno espresso significa-

tivamente come, al calo numerico dei quarti stadi, si siano succeduti, con evidente connessione causale, l'incremento della popolazione ninfale e la comparsa dei primi stadi. Ciò fa ritenere estremamente probabile, l'avvenuto sviluppo di una seconda generazione annuale di L.gallicus dai bordi sabbiosi - del "chiaro", rimasti scoperti per il progressivo ritirarsi delle acque nella

stagione estiva, bordi che possono ben definirsi "nuove zone di schiusa" (3). Dall'esame delle catture effettuate dalle trappole, si perviene ad analo-

ghe conclusioni: l'unica cassa positiva, tra quelle posizionate il 10 maggio, ha reperito alate dal 19 seguente sino al 10 luglio, data che probabilmente rappresenta il termine del primo, (se non del secondo) nucleo annuale di sfarfallamenti, rimanendo il terreno coperto dalla trappola, escluso da ulteriori ovodeposizioni e successive emergenze.

Le casse posizionate in periodi posteriori (19 luglio e 30 agosto). hanno concentrato le catture in settembre (ultima cattura il 15 ottobre), reperendo alate evidentemente provenienti da un successivo ciclo di sviluppo; fatto,

questo, che testimonia la circostanza di almeno 2 generazioni annuali, pur non perfettamente individualizzabili, per la sovrapposizione scalare dei tempi di ovodeposizione e degli sfarfallamenti, nei differenti microhabitats.

La "scomparsa" degli adulti nel pieno del periodo estivo, menzionata da alcuni autori (4, S ) , viene cosl notevolmente a ridimensionarsi, potendo essere riconducibile al massivo passaggio generazionale ipotizzato.

E' lecito chiedersi se i due picchi di densita massima di - L. gallicus (uno in primavera, l'altro tra la fine dell'estate e l'inizio d'autunno) aiano stati gia in tempi storici, caratteristici della specie, od adattamenti biologici recenti, onde limitare, nei mesi caldi, la competizione con 4. irritans per la pia favorevole ricerca d'ospite.

I1 notevole numero di femmine catturate nelle trappole con uova a vario grado di maturazione (83 esemplari su 100), depone a favore di una sviluppata capacità autogenica, almeno per il primo ciclo gonotrofico (5).

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Ann I d . Supsr. S ~ i t d Vd. 22, N. I (1986),'pp. 331334

COMPOSIZIONE E DISTRIBIIZIONE DI UNA POPOLAZIONE LARVALE NATIIRALE DI LEPTOCONOPS

(HOLOCONOPS) GALLICIIS CLASTRIER, 1973 (DIPTERA, CERATOPOGONIDAE)

M. Cocchi (a), D. Menichetti (a), E. Vichi (a), A. Tamburro (a) & L. Gatti (b)

(a) Sezione di Zoologia Medica. I1.S.L. no 28. Grosseto (b) Ufficio Ambiente, Amministrazione Provinciale. Grosseto

Riassunto. - Vengono brevemente descritti i risultati di un a m o di ricerche sullo sviluppo di una popolazione larvale naturale di Leptoconops (Holoconops) gallicus Clastrier, 1973, che colonizza i bordi sabbiosi di un laghetto costiero in provincia di Grosseto. I dati raccolti, confermano la successione di due o più generazioni annuali della specie e forniscono ulteriori notizie sulla sua biologia.

Summary. - The results from an annual research about the development of one natura1 larva1 population of Leptoconops (~oloconops) gallicus Clastrier, 1973, colonizing the sand edges of a little coastal lake, in the province of Grosseto, are briefly described. Collected data confirm the succession of two or more annual generations of this species, reporting also further notes on its biology.

Introduzione

Con la prosecuzione delle indagini che avevano portato all'identificazione di alcuni biotopi larvali, ed all'isolamento degli stadi preimaginali di *- conops (Holoconops) gallicus Clastrier, 1973 (vrf. la nostra precedente comunicazione), abbiamo inteso trovare conferma alle osservazioni che indicavano il susseguirsi di almeno due cicli biologici completi della specie, la quale al pari di altre, fino a poco tempo fa. era genericamente denominata: "L. - (H.) kerteszi" e ritenuta univoltina.

La ricerca è stata intrapresa dal 18 aprile 1981 al 17 aprile 1982, sulla riva di un laghetto di circa 0,3 ha di superficie, situato ad un'ottantina di metri dalla battigia, in zona interdunale, 3 Km a nord della foce del fiume Ombrone. Esso si era formato da alcuni anni, letteralmente "scavato" da violen- te mareggiate che avevano smantellato la duna costiera; la sua origine differi- va perciò da quella dei vicini "chiari", specchi d'acqua salmastrosa, provenienti dai ristagni seguiti, nella zona deltizia, alle periodiche inondazioni del fiuqe, in tempi storici.

mente sulle interlabia, presenti nel prim genere, assenti nel secondo. Ciò porta all'inclusione nel genere Contracaecum di specie assai differenziate quanto a ciclo biologico per avere cane ospiti definitivi uccelli che si nutrono di pesci ( per es.C.rudolphii) , oppure foche ( per es.C.osculatum) - . Inoltre la scoperta di una specie con interlabia ridotte: P.cystophorae, porta a riesaminare il significato tassonanico del carattere "pr~senza/assenza delle interlabia". Ik1 1963 (1) uno di noi (Jkrland) -dava la diagnosi del genere Phocascaris e vi includeva tutte le specie di Contractcaecum aventi cane ospiti definitivi le foche, indi&mdentemente dalla morfologia delle interlabia, mentre attribuiva al genere Contracpecum unicamente le specie il cui ospite definitivo è rappresentato da uccelli. Questa proposta non è stata finora accettata; tuttavia il problema di una definizione filogeneticamnte attendibile dei generi Contracaecum e Phocascaris E rimasto aperto. Per contribuire alla sua soluzione abbiano iniziato lo studio carparativo della struttura genetica di specie attribuite a questi due generi, aventi i due tipi di ciclo biologico e differente nurfologia delle interlabia.

Cono state studiate quattro specie di Contracaecinae: C.rudolphii (interlabia presenti, ospiti definitivi uccelli), P.cystophorae (Gterlabia ridotte, ospiti definitivi foche), e le due specie g&lle C-osculatum A e C.osculatum B (interlabia presenti,ospiti definitivi foche), da Koi recentemnte individuate e differenziate (2). I1 confronto della struttura genetica di queste specie è stato condotto mdiante analisi elettroforetica di 21 loci enzimatici: - Ldh, Mdh-l, Mdh-2, Mdh-3, E, 6-Pgdh, G3@, Sod, Np, Got, Adk-l, Adk-2, -1, Pgm2, &t-l, Est-2, Acph-l, Lap-l, Ca, PJ& e q-. Per tutti i loci sono stati -- saggiati individualmnte, n-ediante eiettroforesi orizzontale su gel d'amido, 86 esaiplari di C.rudolphii (raccolti in Phalacrocorax aristotelis e P-carbo), 92

T-

di ~.osculat& A (in Erignathus barbatus) , 191 di C.osculatum B (in Pagophilus cjro&landicus e - E.barbatus) e 8 di P.cystophorae Tiri Cystophora cristata e P. groenlandi-) . Per le tecniche utilizzate vedi (2). I1 differenziamento gen-e- tico delle specie studiate è stato stimato mdiante le formule propte da Nei (3) per il calcolo dell'identit2 genetica standard (I, v da O a 1) e della distanza genetica (D - = -1og I).

e-

Risultati

I valori di identità e distanza genetica tra le specie studiate,calcolati sulla base delle frequenze alleliche ai 21 loci analizzati, sono riportati nella Tabella 1. Le specie più affini risultano - C.osculatum A e C.occulatum B (I = 0,6l), quelle piu lontane C.rudolphii e Pxystophorae (I = 5) . Quasi al- trettanto differenziato è - c.rudolphii dai due A r i del'canpl&o - C.osculatum (I - = 0,00003 e 0,00121).

Discussione

I r i s u l t a t i o t tenut i dimostrano inequivocabihnte l 'e terogenei tà de l yenere Contracaecum,come def in i to s u l l a base de l l a rmrfologia de l l e inter labia . In questo genere vengono i n f a t t i a coesistere specie con iden t i t à genetica prossima a O ( p r a t i c a ~ n t e nessun a l l e l e canune i n t u t t i i 21 loc i s t u d i a t i ) , caie C.rudolphii r i spe t to a C.osculatum A e C.osculatum B. A1 contrar io =o- cascar is cystophorae r i s u l t a notevolvente aff ine a l l e due specie g a l l e di C.osculatum ( t u t t e e tre aventi c m o s p i t i de f in i t i v i specie d i foche), rnentre l a sua ident i tà genetica è nulla r i spe t to a C.rudolphii, che ha come o s p i t i de- f i n i t i v i ucce l l i che si nutrono d i pesci. Questi &ti saibrano confenme l'i- potesi di Berlmd ( l ) , che basa il differenziamento dei generi Contracaecum e Phocascaris su l l 'osp i te def ini t ivo (rispettivamente uccel l i e foche) piut tosto che su l l a itwrfolcgia de l le inter labia .

Tabella 1.- Valori d i i den t i t à (sopra l a diagonale) e distanza genetica ( so t to l a diagonale) t r a C.ruclolphii (KUD) , C.osculatuni A (OSA), C.osculatum B (OSB) e g.cystophorae (CYS).

i<UD OSA OSB CY S

RUD - o , O00 0,001 0,000 OSA 10,307 - O , 610 0,469 OSB 6,718 0,494 - 0,522 CYS ou 0,757 O , 650 -

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