Università degli Studi del Piemonte Orientale A. AvogadroCorso di Laurea in Medicina e Chirurgia

Appunti del Corso di Patologiae Fisiopatologia Generale del

Professor E. Albano

- PARTE 1 -

A.A. 2013/2014

INDICE PATOLOGIA

PATOLOGIA ED EZIOLOGIA........................................................................................................3Eziologia generale...........................................................................................................................4

CAUSE CHIMICHE DELLA MALATTIA.....................................................................................5Meccanismi di biotrasformazione degli xenobiotici....................................................................7

Reazioni di fase I.........................................................................................................................7Reazioni di fase II.......................................................................................................................7Attivazione metabolica degli xenobiotici..................................................................................8Polimorfismi di cyp2D6 ed alterazioni del metabolismo dei farmaci....................................9

I radicali liberi nella patogenesi delle malattie..........................................................................10La bilancia ossidativa...............................................................................................................11Stress ossidativo........................................................................................................................12Effetti citotossici dei radicali liberi.........................................................................................13

CAUSE FISICHE DI MALATTIA.................................................................................................14Patologie da trasferimento di energia elettromagnetica...........................................................14

Patologie indotte da radiazioni ionizzanti..............................................................................16Patologie indotte da radiazioni eccitanti................................................................................17

RISPOSTA DELLE CELLULE AL DANNO................................................................................19Risposta funzionale allo stress ossidativo...................................................................................20Autofagia e danno cellulare.........................................................................................................21

Malfunzionamento e insufficienza dei meccanismi di difesa................................................23Necrosi.......................................................................................................................................23Apoptosi.....................................................................................................................................26Catastrofe mitotica...................................................................................................................29

Risposta adattativa delle cellule al danno..................................................................................30La rigenerazione epatica..........................................................................................................31Caratteristiche dell’ipertrofia cardiaca..................................................................................32Metaplasia.................................................................................................................................34Displasia....................................................................................................................................34

BETA-FIBRILLOSI E MALATTIE NEURODEGENERATIVE...............................................35Amiloidosi......................................................................................................................................35

Processo di generazione della sostanza amiloide...................................................................36Conseguenze dell’amiloidosi....................................................................................................37

Malattie da prioni.........................................................................................................................37Neurofibrillosi...............................................................................................................................39

Malattia di Alzheimer(AD)......................................................................................................39Morbo di Parkinson.................................................................................................................42Morbo di Huntington...............................................................................................................43

L’INVECCHIAMENTO..................................................................................................................44Invecchiamento delle cellule perenni......................................................................................44Invecchiamento delle cellule labili..........................................................................................45Modificazioni della matrice.....................................................................................................45

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PATOLOGIA ED EZIOLOGIA

La Patologia Generale mira a comprendere i meccanismi molecolari e cellulari che sono alla basedella comparsa della malattie.Secondo l’OMS(Organizzazione Mondiale per la Sanità) la salute è “uno stato di benessere fisico,mentale e sociale completo, non l’assenza di malattia”.Per malattia s’intende qualsiasi alterazione strutturale o funzionale di un tessuto o di un organocapace di ripercuotersi sull’economia generale dell’organismo; essa è considerata l’antitesi dellostato di salute.Le malattie possono essere distinte per la loro localizzazione in:

focale: legate a specifiche aree otessuti

diffusa: che riguardano un interoorgano

disseminata: che colpisce tessutidiversi

sistemica: che interessa un interoapparato

generalizzata: comprende tuttol’organismo

Inoltre la malattia può essere studiata su diversi livelli, con approcci di vario tipo: di popolazioni(epidemiologia) di individuo(medicina clinica) di sistema o organo(fisiopatologia) di tessuto(istopatologia) di cellule(citopatologia) di organelli(biochimica) di molecola(biofisica) di geni(biologia molecolare)

I principali criteri di classificazione sono: topografico(localizzazione anatomica della zona interessata) anatomica(organo prevalentemente interessato) funzionale(sulla base della/e funzione/i maggiormente compromessa) patologico( natura della malattia) eziologico(in relazione alla causa) patogenetico(meccanismo patogenetico prevalente) epidemiologico(in relazione a dati statistici riguardanti l’incidenza).

Della malattia possiamo studiare frequenza e distribuzione, le cause determinanti, i meccanismimediante i quali si sviluppa, i sintomi e il decorso e le possibili cure.

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Eziologia generale

L’eziologia è la disciplina che studia gli stimoli patogeni o i fattori di malattia.Nei confronti dell’organismo, la malattia può essere:

determinante: se l’agente da solo può produrre malattia coadiuvante: se l’agente facilita l’azione di un'altra causa(concausa);

nei confronti della malattia, l’organismo può essere: recettivo: se subisce le conseguenze refrattario se non ne risente resistente: se si difende

I fattori eziologici possono essere: intrinseci(o genetici) ed acquisiti(fisici, chimici, alimentari obiologici); le malattie possono avere una totalità di causa intrinseca od estrinseca, ma nella maggiorparte dei casi sono multifattoriali(combinazione dei due tipi di fattore in grado variabile).

Uno dei criteri per comprendere l’influenza delcontenuto multifattoriale nella patogenesi dellamalattia è l’analisi della concordanza nellacomparsa di alcune malattie fra gemelli omo edizigoti: la concordanza è analoga per malattiead eziogenesi esclusivamente esogena(es.infezione acuta), mentre nella patologie conforte influenza genetica(es. malattiepsichiatriche come la deficienza mentale) si hasbilanciamento verso i gemelli monozigoti.

Le malattie multifattoriali, come patologie cardiovascolari, diabete e tumori, costituisco attualmenteil 90% delle cause di morte.

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CAUSE CHIMICHE DELLA MALATTIA

Le cause chimiche agiscono mediante due meccanismi principali: aspecifici: prescindono dal tessuto e riguardano le proprietà chimico-fisiche della sostanza

(es, effetto solvente di acidi e basi forti o azione degli agenti alchilanti). specifici: legati all’interazione della sostanza tossica con specifiche molecole bersaglio a

livello tissutale e cellulare(es. acido cianidrico HCN, lega il citocromo c complessandosi conil ferro del gruppo eme e blocca la catena respiratorie; es. monossido di carbonio CO chelega l’emoglobina sempre complessandosi al ferro dell’eme e determina ipossia tissutale; es.colchicina, antiblastico che interferisce con la polimerizzazione dei microtubuli bloccando iltrasporto e la mitosi)

Tra gli agenti chimici con azione dannosa sulle cellule si annoverano anche numerose tossinenaturali:

Tetrodotossina, potente neurotossina prodotta da alcuni pesci tropicali (pesce palla), cheinterrompe in pochi istanti la conduzione nervosa bloccando i canali del sodio voltaggiodipendenti.

Tossina Colerica prodotta da vibrioni, è formata da due sub unità A e B, la prima capace ditraslocare nel citosol e di legare la proteina g coinvolta nell’attivazione di adenilato ciclasi, laseconda legante uno specifico recettore sulle cellule enteriche; tramite aumentata sintesi diAMPc determina eccessiva perdita di acqua e sali e causa diarree irrefrenabili.

Tossine Botulinica e Tetanica, largamente impiegate nella cosmesi, sono prodotte da batterianaerobi in gradi di infettare i tessuti; sono proteasi in grado di tagliare proteine connesse conl’agganciamento delle vescicole nelle sinapsi; presentano tuttavia effetto diverso, poichéagiscono su bersagli differenti: la tossina botulinica è coinvolta nella sinapsi neuromuscolare, impedendo l’azione del motoneurone terminale il rilascio di acetilcolina edeterminando quindi paralisi flaccida, mentre la tossina tetanica agisce sui motoneuroni dellecorna anteriori del midollo accentuando il rilascio di acetilcolina e determinando paralisispastica.

Affinché i tossici possano svolgere il loro ruolo è essenziale il loro ingresso nell’organismo.Possono penetrare in diversi modi, a seconda della struttura della sostanza tossica stessa(trattogastrointestinale, polmoni, cute e annessi, via parenterale); le sostanze ricircolano poi in sangue elinfa e subisco una serie di trasformazioni che ne permettono l’immagazzinamento(in ossa, tessuto

adiposo e tessuti molli) o l’eliminazione(tramite feci,urina, aria espirata, secrezioni e latte). La concentrazionedi queste sostanze nel sangue è in equilibrio con laconcentrazione sul bersaglio molecolare.L’azione lesiva degli agenti chimici è influenzata dallecaratteristiche chimico-fisiche del composto, dalla dose,dal sito di somministrazione e dalla duratadell’esposizione, dalla distribuzione tissutale, dallatrasformazione metabolica subita, dall’eliminazione edalla modalità del danno.

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Il rapporto tra la dose e la risposta alla sostanza èimportante per valutarne la tossicità.La dose soglia corrisponde all’ultimo valore peril quale non si hanno effetti; la dose efficace 50 èla quantità che determina una risposta nel 50%degli animali trattati, mentre la dose disaturazione equivale alla dose massimale, per cuianche aumentando la quantità somministrata nonsi ha variazione della risposta poiché tutti inrecettori sono occupati. Sulla base della dose letale 50(DL50) è possibile

definire una scala di tossicità,che dimostra come tutte le sostanze siano tossiche a determinate dosi.Si nota come molte sostanze naturali siano tossiche: ciò dimostra come l’origine non da indicazionisulla lesività. La tossicità può essere acuta o cronica secondo la modalità tramite la quale si esplica.La tossicità acuta origina da un rapido assorbimento di sostanze tossiche in dosi elevate, di solitosingole; i sintomi che ne derivano sono il risultato dell’interazione del tossico con specifichefunzioni cellulari, hanno una rapida insorgenza e una rapida evoluzione verso la morte o laguarigione.es. il fungo Amanita Phalloides contiene peptidi ciclici del gruppo fallotossine e amatossine checausano danni importanti a carico del fegato, fino a necrosi epatica, anche se la sintomatologia ètardiva; sono sufficienti 100g di funghi freschi ad uccidere un uomo di 75kg di peso.La tossicità cronica deriva da ripetute esposizioni per un prolungato periodo di tempo ad unasostanza che ha tendenza ad accumularsi nell’organismo in quanto la cinetica di assorbimentoaccede la capacità di eliminazione o perché causa un accumulo progressivo di danni a livello deitessuti bersaglio.es. intossicazione cronica da piombo, definita saturnismo, che dà luogo ad anemia ed emolisi, oltreche a coliche intestinali, neuropatie periferiche ed acidosi tubulare renale(Sindrome di Fanconi),quadro sintomatologico dovuto a d interazione della sostanza, accumulata principalmente a livelloosseo, con i gruppi –SH delle proteine; nei bambini determina anche la comparsa di strie da piomboipofisarie ed encefalopatia.Per alcune sostanze sono possibili entrambe le azioni: l’alcool ad esempio, può causare effettipsicotropi dati dall’assunzione acuta, quali disinibizione, rallentamento dei riflessi, torpore,incoordinazione dei movimenti e depressione dei centri respiratori, ma è anche responsabile dieffetti organici conseguenti ad assunzione cronica, i quali coinvolgono sistema nervoso, fegato,pancreas, apparato digerente, cuore, muscoli e ghiandole endocrine. Discorso analogo è quellorelativo ad intossicazioni da micotossine: i funghi del genere Aspergillus possono contaminare isemi immagazzinati di cereali e legumi tramite liberazione di aflatossine b e g ad attivitàepatotossica, ma possono anche concorrere all’insorgenza di tumori.

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Meccanismi di biotrasformazione degli xenobiotici

Spesso l’azione dei tossici coincide con quella degli xenobiotici, intesi come qualsiasi sostanzaestranea all’organismo.Gli xenobiotici devono subire processi ditrasformazione per poter essere accumulatiod eliminati. I meccanismi di trasformazionedipendono dalle caratteristiche delloxenobiotico stesso: se è idrofilo la via dieliminazione sarà prevalentemente quellagastroenterica o urinaria, mentre se èlipofilico tende ad accumularsi nel tessutoadiposo. La maggior parte sono lipo-idrosolubili, e sono eliminati con reazioni di fase1 o di funzionalizzazione e di fase 2 o diconiugazione. Reazioni di fase ISono reazioni che introducono in una molecola gruppi polari che ne modificano la strutturaaumentandone la polarità. Sono catalizzate da enzimi diversi con differenti specificità(monoammineossidasi, aromatasi, monossigenasi, alcool deidrogenasi); il ruolo più importante è svolto damonossigenasi citocromo P450 dipendenti e FAD dipendenti che operano nel reticoloendoplasmatico, poiché catalizzano molte reazioni diverse e sono parte di sistemi costituenti catenedi trasporto, aventi come donatore NADPH e come accettore flavoproteine; il citocromo P450contiene un atomo di ferro nel gruppo prostatico eme che lega l’ossigeno e il substrato; il flussoelettronico prende inizio dal NADPH e attraverso la flavo proteina NADPH-CitP450 reduttasi)arriva al citocromo. Gli elettroni vengono trasferiti uno alla volta: il primo riduce il ferro da ferroso(Fe2+) a ferrico(Fe3+) e permette il legame con l’ossigeno, mentre il secondo scinde la molecola diossigeno dando luogo a specie instabili che portano all’introduzione di un atomo di ossigeno nelsito reattivo con rilascio, infine, di acqua. La reazione può essere così schematizzata: R + O2 + NADPH2 ROH + H2O + NADP+ Le molecole che si legano al sito attivo sono molto eterogenee; esistono infatti una famiglia dienzimi che presentano stessa struttura, ma specificità diversa, e sono classificati in sottofamigliesulla base della sequenza amminoacidica(l’uomo ne possiede circa 150 isoforme diverse).Il metabolismo degli xenobiotici è mediato essenzialmente dalle prime quattro famiglie(localizzateprincipalmente in fegato, cute, rene e polmone); inoltre, questi enzimi, sono inducibili, ossia la loroattività aumenta in risposta alla disponibilità di substrato(questo giustifica l’aumento di tollerabilitàdovuta ad esposizioni piccole e continue es. metabolismo di etanolo, caffeina e paracetamolo).

Reazioni di fase III prodotti degli enzimi di fase 1 e i composti idrosolubili possono essere trattati da enzimi di fase 2,i quali legano una molecola endogena al substrato.Le reazioni di coniugazione sono molto diverse e per ognuna esiste un preciso gruppo di enzimi.es. il benzene viene trattato da citP450 con aggiunta di –OH e formazione di un fenolo; nel fegatoviene addizionato all’acido uridindifosfoglucuronico ad opera dell’enzima UDP glucuroniltransferasi che lo rende molto idrosolubile e facilmente eliminabile con l’urina.es. il clorobenzene(o il bromobenzene) viene trasformato in epossido da enzimi citP450 dipendenti;successivamente è aperto e coniugato al glutatione ad opera dell’enzima glutatione transferasi sui

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residui di cisteina, che spesso vengo spezzati per abbassare il peso molecolare ed eliminati comemercaptoderivati.

Le reazioni di fase 2 si svolgono in parallelo alle reazioni di fase 1 e spesso gli enzimi vengonoindotti insieme. Più gli enzimi sono attivi, più l’eliminazione xenobiotica è efficace. A livello cellulare un altro meccanismo di difesa è legato alla presenza di specifici trasportatori,quali gli MDR(Multi Drug Resistence), che utilizzando ATP allontanano molecole dalla cellula esono coinvolti nella difesa per molteplici antiblastici usati come chemioterapici(come taxolo,vinblastina ecc..).

Attivazione metabolica degli xenobioticiQuando, durante la modificazione dello xenobiotico, un enzima di fase 1 produce molecole piùreattive di quella originaria si parla di attivazione dello xenobiotico.Un esempio può essere dato dal paracetamolo, principio attivo di numerosi antinfiammatori e

antidolorifici, che per l’80% viene eliminato conreazioni di solfatazione o glucuronazione da parte dienzimi di fase 2; tuttavia, una piccola parte, circa il5%, è metabolizzato da enzimi citP450dipendenti(enzimi di fase 1) che generano uncomposto di ossidazione, la benzodionemina, moltoreattivo, il quale si combina con proteine e lipidiformando comporti di addizione. Il paracetamolo inalcune condizioni diventa particolarmente tossico: ladose fisiologica è di circa 4-6 mg al die, e intorno ai10mg diventa letale; una buona parte è infattieliminata con la glutatione transferasi, ma se presentein quantitativi così elevati non è sufficiente; provocaquindi necrosi cellulare, soprattutto a livello epatico,dove si determina un’intossicazione da paracetamolocon insufficienza epatica acuta. L’antidoto è la Nacetil cisteina, che sostituisce il glutatione, madev’essere somministrata in alte dose nelle prime fasi

di intossicazione. Oltre alla tossicità dovuta la sovradosaggio, il paracetamolo può diventare tossico

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anche in caso di malnutrizione, ossia quando gli enzimi di fase 2 non funzionano correttamente percarenza di substrati. Negli alcolisti la via del citocromo P450 è molto attiva.La tossicità di un farmaco può quindi essere legata all’equilibrio che si instaura tra enzimi di fase 1ed enzimi di fase 2.I processi di attivazione metabolica hanno un ruolo importante nella cancerogenesi. Il benzopirene èuna molecola stabile, ma diventa cancerogena a causa di un intermedio elettrofilo, l’epossido 7,8,prodotto dall’azione successiva di un enzima citP450 dipendente, di una epossido idrasi enuovamente del P450 dipendente; questo si lega al DNA e può provocare tumore(soprattuttoriguardante cute e polmone). Anche inquesta condizione esistono specificienzimi di fase 2 che esercitano protezionedai metaboliti reattivi(riduconol’insorgenza di carcinomi negli esposti).In alcuni casi i metaboliti reattivi possonoscatenare reazioni allergiche tramitegenerazione di addotti con leproteine(molecole self viste come non self,contro le quali viene prodotta unarisposta).es. l’adotano(anestetico generale): una piccola quota può essere attivata con distacco del residuo dibromo e con formazione di un metabolita che lega i gruppi –NH3 delle proteine e può essere causadi epatiti autoimmuni.

Polimorfismi di cyp2D6 ed alterazioni del metabolismo dei farmaci

Il metabolismo dei farmaci può presentare grande variabilità nei diversi individui, per questo ildosaggio di molti farmaci deve essere “personalizzato”.Coinvolti in questi meccanismi sono appunti gli enzimi deputati alla trasformazione deglixenobiotici.es. Valutando la risposta alla somministrazione di farmaci antipertensivi nella popolazione si notacome ogni paziente reagisca in modo diverso; è possibile, in particolare, distinguere i soggetti in tregruppi principali: la maggioranza è composta dai cosiddetti metabolizzatori veloci, ossia da coloronei quali è possibile valutare un certo abbassamento pressorio; un gruppo minore è invece quellocostituito dai metabolizzatori lenti, per i quali sono sufficienti quantità di farmaco inferiori; il terzo,piccolo, gruppo è invece quello dei metabolizzatori molto rapidi, ai quali sarà necessariosomministrare dosi di farmaco aumentate, data la bassa risposta alla dose consigliata.Spesso risulta essenziale verificare l’appartenenza del soggetto ad una delle categorie diverse daimetabolizzatori veloci prima dell’inizio della terapia.I metabolizzatori lenti sono portatori di modificazioni puntiformi sul gene di cyp2D6, mentre imetabolizzatori molto rapidi presentano duplicazioni che interessano sempre lo stesso gene.

Osservando quest’ultima mutazione si è notato comeessa abbia una particolare distribuzione geografica, conalta frequenza nel Sudan, nel Corno d’Africa e nellaPenisola Arabica; si è quindi supposto come taleduplicazione possa essere il risultato di un adattamentoad abitudini dietetiche con alto consumo di alcaloidi, ilcui metabolismo coinvolge appunto cyp2D6.Esistono anche alterazioni del metabolismo dell’etanolo,dovute a polimorfismi del cytP450: questo composto èsubstrato prima di un enzima di fase 1, l’alcooldeidrogenasi ADH, che lo trasforma in acetaldeide, la

quale diventa a sua volta bersaglio di acetaldeide deidrogenasi ALDH, enzima di fase 2. Nei PaesiOrientali è frequente una mutazione del gene che codifica per l’ALDH, che si associa ad

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ipofunzionalità dell’enzima; questo provoca un accumulo di acetaldeide nel sangue con insorgenzadi una patologia conosciuta come Flushing Syndrome, caratterizzata da arrossamenti cutanei, nauseae vomito.I polimorfismi possono infine riguardare anche enzimi coinvolti nel metabolismo di alcuni farmacimiorilassanti, come la pseudosuccinilcolina esterasi.

I radicali liberi nella patogenesi delle malattie

I radicali liberi sono atomi o molecole presentanti un elettrone spaiatonell’orbitale esterno; godono quindi di estrema reattività(alcuni sonoperò stabili, come la melanina nei capelli) ed emivita molto breve. Sonoindicati con R∙.Questo elettrone in eccesso o in difetto conferisce caratteristiche diparamagneticità(i radicali sono infatti rilevabili come magneti).I radicali liberi si formano mediante meccanismi diversi:

rottura di un legame covalente (es. radiazioni ionizzanti) A-----B A∙ + B∙ reazioni redox (es. emoglobina metaemoglobina) Hb-Fe2+ Hb-Fe3+ + O2∙ interazione con un radicale preesistente (reazioni conservative) A∙ + BH AH + B∙

Le reazioni radicali che implicano perdita o acquisizione di un solo elettrone, a differenza delleredox dove ne vengono scambiati due, quindi i radicali tendono a privilegiare reazioni checoinvolgono molecole in grado di cedere un solo elettrone, come metalli di transizione,ossigeno(con formazione di perossidi) e molecole organiche.Se due radicali reagiscono tra di loro si hanno reazioni di terminazione, da cui non si originano piùcomposti radicalici.

Le reazioni che coinvolgono l’ossigeno sono particolarmente favorite dai radicali a causa dellaconfigurazione dell’elemento stesso allo stato basale, detta a tripletto, che è infatti un diradicalelibero, poiché possiede due elettroni spaiati nello strato più esterno. Esso può essere trasformato inacqua attraverso diversi passaggi che coinvolgono un solo elettrone alla volta, poiché i due elettronipiù esterni presentano spin analogo e nessuna molecola è in grado di cedergli due elettroni; la

presenza di ossigeno nell’atmosfera coincide, inquesto senso, con lo sviluppo dei microrganismi, chesfruttano il salto energetico tra ossigeno ed acqua.Tuttavia, per quanto concerne questa trasformazione,si ha un inconveniente esercitato del fatto che nelprocesso di passaggio degli elettroni si possonogenerare intermedi fortemente reattivi(specie reattivedell’ossigeno, ROS): la riduzione di un elettroneforma l’anione superossido O2-∙ mentre la riduzionedi due elettroni non forma un radicale, bensì lo ioneperossile O2

2-, che è però un’importante fonte dispecie reattive. Ancor maggiore reattività presental’ossigeno singoletto, il quale non presenta

limitazione di spin.L’acqua ossigenata può essere prodotta a partire da due ioni superossido O2- + O2- H2O2 , laquale può dare origine ad uno ione ossidrile OH- per degradazione in presenza di metalli ditransizione, seguendo la reazione di Fenton H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OH∙ ; si può poiriottenere il metallo di transizione usato in questo procedimento secondo la reazione di Haber- Weis

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O2- + Fe3+ Fe2+ + O2 ; il complesso di reazioni prende il nome di complesso di Fenton- Haber-Weis.Le fonti di ROS a livello cellulare sono numerose:

La catena respiratoria mitocondriale: nel passaggio dal complesso II al complesso III e delleproteine leganti il ferro fino al citocromo c. In alcune condizioni, come la sindrome diriperfusione o le infezioni da HIV, i danni dei ROS sono molto elevati.

La catena respiratoria microsomiale del cit P450 nel metabolismo degli xenobiotici, dovel’ossigeno accetta elettroni sia nella normale catalisi, ma anche in assenza di substrato percerti enzimi; la via può per esempio generare radicali nel caso del metabolismo di alcunixenobiotici, quali il tetracloruro di carbonio CCl4.

Anche l’alcool può essere trasformato in radicale durante la metabolizzazioneepatica(insorgenza della epatopatia alcolica) CH3CH2OH CH3CH∙OH

Alcuni composti come erbicidi o antiblastici sono in grado di indurre la formazione di ROS,in quanto vanno incontro a cicli ossido riduttivi e passano da chinoni semiridotti concaratteristiche radicaliche che sono poi in grado di attivare l’ossigeno ad anione superossido.

Le cellule fagocitarie durante l’infiammazione rispondono con la produzione di ROS causatodal massiccio incremento del consumo di ossigeno indipendente dalla respirazione, dovutoall’aggregazione in membrana del complesso NADPH ossidasi con funzioni regolatorie e concapacità di trasporto degli elettroni per generare anione superossido usando NADPH derivatodal ciclo dei pentosi; i ROS prodotti in questo contesto sono responsabili dei danni tissutalitipici dell’infiammazione, da cui derivano malattie infiammatorie croniche e acute distresssyndrom.

Fattori che regolano il tono vasale, come il monossido d’azoto NO che è formato da uncomplesso enzimatico di cui esistono 3 isoforme, costitutiva, epiteliale e inducibile; NO puòinteragire con l’anione superossido e formare nitroperossidi(NOO∙).

I radicali sono però molto importanti perché svolgono numerose funzioni fisiologiche all’internodella cellula:

difesa da patogeni segnalazione intracellulare regolazione del tono vascolare regolazione dell’adesione piastrinica regolazione di emopoiesi e angiogenesi sintesi di prostaglandine e di leucotrieni attivazione della risposta immunitaria

La bilancia ossidativaEsiste un preciso equilibrio tra formazione di ROS e sistemi antiossidanti.Le difese possono essere distinte in enzimatiche e non enzimatiche.Le difese non enzimatiche sono piccole molecole presenti nei liquidi e nelle membrane, chepossono cedere elettroliti ai radicali inattivandoli(l’antiossidante è sufficientemente stabile da nonreagire con altri sistemi); queste possono essere a loro volta classificate in idrosolubili,comprendenti ad esempio glutatione, acido ascorbico e acido urico(la concentrazione diquest’ultimo è molto elevata nel plasma umano proprio per la sua attività antiossidante) e inliposolubili, come la vitamina E(svolge funzione antiossidante per i residui di –OH e si localizzanelle membrane grazie alla catena idrofobica ed agisce eliminando radicali generati nelle catene diacidi grassi polinsaturi), i carotenoidi, l’ubichinone e la bilirubina. Interagiscono tutte con lemolecole radicaliche nei siti in cui vengono prodotte e la loro efficacia dipende dalla concentrazionee dai meccanismi tramite cui vengono sintetizzate.Le difese enzimatiche sono invece costituite da diversi enzimi:

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superossido dismutasi, di cui esistono 3 isoforme: quella citoplasmatica contiene zinco emagnesio, quella mitocondriale contiene manganese e quella extracellulare che contienezinco. Elimina i superossidi, ma produce acqua ossigenata, che deve essere comunqueeliminata.2O2- + 2H+ O2 + H2O2

catalasi, che presenta Km molto elevata e quindi, viste le alte concentrazioni di acqua ossigenata in tutti i distretti, è poco efficace. 2H2O2 O2+ 2H2O

glutatione perossidasi, la quale esiste in due isoforme, citoplasmatica e di membrana, e chepresenta elevata affinità anche a concentrazioni molto basse. E’ strettamente dipendente dalladisponibilità di glutatione; è quindi necessario un enzima per riossidarlo.ROOH + GSH ROH + GSSG + H2O

glutatione reduttasi GSSG + 2NADPH 2GSH + NADP+

Strettamente legata a questi enzimi è unapatologia conosciuta con il nome di favismo.Essa è causata da una mutazione a carico delgene che codifica per l’enzima glucosio 6fosfato deidrogenasi G6PD; i soggetti affetti daquesto deficit presentano, in seguitoall’ingestione di fave, crisi emolitiche conanemia acuta e emoglobinuria(con conseguentidanni renali). Le fave contengono infatti ladivicina, glucoside che se ingerito subisce ciclidi ossidoriduzione e forma lo ione superossido,il quale viene convertito in acqua ossigenata;non è tuttavia possibile rigenerare il glutationenecessario alla glutatione perossidasi, permancanza del substrato NADPH dellareduttasi, che normalmente viene riformato daG6PD, di cui in questo caso si ha

malfunzionamento.A questi sistemi principali se ne aggiungono altri:

tioredoxina, molto importante a livello cutaneo per i danni indotti dai raggi ionizzanti.Prot-S-S + 2GSH Prot-SH + GSSG

emeossigenasi, che si occupa della degradazione dell’eme, il quale sarebbe molto più reattivodel ferro libero.

Nel sangue, inoltre, sono presenti diversi fattori protettivi, quali: aptoglobina/emopessina che legano emoglobina e mioglobina transferrina che lega ioni ferro albumina che lega ioni rame acido urico che ha importante funzione di scavenger bilirubina, prodotta dal metabolismo dell’eme, e che si associa alla riduzione degli acidi

grassi

Stress ossidativoSi ha stress ossidativo quando si determina uno squilibrionella bilancia ossidativa, per eccesso della produzione diROS o per la riduzione di difese antiossidanti, che

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determina l’insorgenza di un danno cellulare. Se il danno è moderato può essere riportatol’equilibrio, mentre se è forte e cronico si determina morte cellulare.A livello cellulare, i radicali agiscono su tre strutture principali:- proteine, su cui inducono frammentazione, aggregazione e ossidazione dei gruppi –SH; parte diquesti danni possono essere riparati da enzimi, altri sono controllati dalle foldrine, ma più spesso leproteine modificate sono denaturate e accumulate nel citosol a formare aggregati.- acidi nucleici, su cui determinano ossidazione, dimerizzazione di basi e ossidazione delloscheletro fosfocarbossilico. I danni possono essere riparati mediante riassemblaggio casuale perquanto concerne il DNA, mentre sulle basi intervengono MER e BER; possono produrre dannigenotossici, alla base dello sviluppo di numerose neoplasie.- acidi grassi polinsaturi, contenuti in tutti gli alimenti, tendono a ossidarsi spontaneamente; perquesto motivo gli antiossidanti sono usati come conservanti. Tale ossidazione spontanea vienedefinita perossidazione lipidica ed è una reazione autocatalitica per la quale si crea una particolarestruttura(doppi legami intervallati da carboni metilici) facilmente modificabile con sottrazione di un

idrogeno e trasformazione in un radicale libero. Tale radicalelipidico tende a cambiare conformazione ed ad addizionarel’ossigeno; si forma un radicale lipoperossilico estremamentereattivo, che coinvolge i lipidi vicini e si trasforma inlipoperossido, molecola instabile che va incontro ariarrangiamenti generando prodotti di reazione a basso pesomolecolare e contenenti ossigeno, quali aldeidi,chetoni,chetoidrossiacidi e cicloidroperossidi. Alcuni di questi compostipossono diffondere lontano dal sito di produzione: un esempio ciè dato dalle elevate concentrazioni di tali prodotti nel siero disoggetti con abuso di alcool. Nelle membrane la vitamina Epreviene questo processo, interrompendolo; se il meccanismo nonviene controllato, i danni per la membrana sono cospicui: si puòavere inserimento di cariche polari portate all’esterno,alternazione della fluidità od ossidazione delle proteine sullamembrana.

Possono crearsi addotti per l’interazione tra proteine e prodotti della perossidazione lipidica, chepossono reagire con DNA e RNA modificandoli(agenti genotossici di tipo mutageno).

Effetti citotossici dei radicali liberiInteragendo con i tre bersagli prima descritti causano danni primari che danno luogo ad una serie dieffetti secondari con conseguenzegravi per i mitocondri, per ilcitoscheletro ecc, che possono esitarein danni cellulari irreversibili.

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CAUSE FISICHE DI MALATTIA

Le patologie possono generare da trasferimento di energia sotto diverse forme(meccanica, elettrica,termica, elettromagnetica o da variazione della pressione).I danni dipendo dalla quantità di energia trasferita, dalla durata del trasferimento e dalla capacità deltessuto di disperdere energia.

Patologie da trasferimento di energia elettromagnetica

La superficie terrestre, e su di essa Uomo e altre specie viventi, è continuamente esposta a vari tipidi radiazioni che provengono da sorgenti naturali, alle quali si aggiungono quelle provenienti dafonti artificiali.In base ai loro effetti si distinguono due tipi di radiazioni:

ionizzanti, forme di radiazione che hanno energia maggiore di 10eV(energia necessaria perallontanare un elettrone dall’orbitale più esterno della molecola e formare uno ione) e conlunghezza d’onda minore di 100nm.

eccitanti, forme di radiazioni che hanno energia inferiore di 10eV; tra questi figurano anche iraggi ultravioletti(100-400nm).

Le radiazioni ionizzanti sono ulteriormente in corpuscolate, in particolare elettroni, protoni,neutroni, positroni, deutroni e particelle α, ed elettromagnetiche, che comprendono raggi γ, raggi xmedi-molli-duri, ultraviolette, luce visibile, infrarosse e herziane. Nella collisione con la materia, le radiazioni cedono tutta o parte dell’energia alle molecole ed agliatomi che la assorbono, con conseguenze che variano a seconda della quantità di energia spostata.Infatti, quando una radiazione, intesa come quanto di energia, sia corpuscolata che di origineelettromagnetica, colpisce i tessuti può interferire con due bersagli:

macromolecole della cellula o della matrice: in questo caso le strutture sono ionizzate, per lamaggior parte in formaradicalica(stessi effettiprovocati dai radicali). Questeinterazioni sono dette dirette;tuttavia, la probabilità che unamacromolecola venga colpitedipende dalla sua dimensione,quindi è molto bassa. Essendocostituiti i tessuti per il 70% diacqua è più probabile chevenga colpita una di queste

molecole. RH + hv e- + RH+ R∙+ H+

molecole di acqua: la ionizzazione da luogo a diverse reazioni chimiche, H2O + radiazione H2O++ e- oppure H2O + e- H2O- Gli ioni così generati possono essere scissi nei lorocomponenti, con formazione di radicali. Per ogni 10-5J di energia trasferiti all’acqua sigenerano 2,6 e-, 2,6 OH∙, 0,4 H∙. Questo effetto è detto indiretto.

A livello cellulare, la quantità di radicali formati dipende dalla frequenza delle interazioni. Lacapacità di trasferire energia è definita LET(Linear Energy Transfer) ed è direttamenteproporzionale alla carica ed alla massa della particella ed inversamente proporzionale alla sua

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energia. La dimensione delle particelle influenza infatti la probabilità che avvengano collisioni,mentre l’energia è rilevante poiché le particelle con alta energia interagiscono meno con itessuti( questa peculiarità è molto sfruttata nei trattamenti contro i tumori).LET, in particolare, corrisponde alla quantità di energia persa per unità di tragitto (KeV/μm); esisteinoltre un fattore qualitativo Q che permette il confronto tra radiazioni a LET diverso.Altri due indici molto importanti sono

dose assorbita, quantità di energia erogata per unità di massa di tessuto indipendentementedal tipo di radiazione, e si misura in Grey(J/Kg).

dose equivalente, prodotto della dose assorbita per il fattore Q, che esprime la capacità diindurre un danno da parte di radiazioni con diverso LET: si misura in Sievert.

Ogni organismo è esposto a radiazioni(radioattività del terreno), fattore preso in considerazione daEBR.

L’effetto a livello di acidi nucleici, proteine e lipidi è analogo a quello visto per i radicali.

Il tipo di morte cellulare può avere caratteristiche diverse che possono essere influenzate dalla dosedi radiazione; infatti, da 300 a 1000R la cellula muore per apoptosi, mentre con un valore maggioredi 2000R la cellula muore per necrosi.Anche la sensibilità dei tessuti alle radiazioni è diversa è ed influenzata da diversi fattori. Avremoquindi tessuti radiosensibili, che presentano cellule con elevato turnover ed elevata frequenza dimitosi(come comparti emopoietico, linfoide, germinale e le cellule tumorali) e tessuti

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radioresistenti, i quali cessano la loro attività replicativi subito dopo lo sviluppo fetale. Ladifferenza sostanziale è la presenza o meno di difese antiossidanti.

Patologie indotte da radiazioni ionizzantiGli effetti delle radiazioni ionizzanti a livello tissutale dipendono da dose assorbita e areainteressata e possono essere classificati in somatici, al loro volta suddivisibili in stocastici e nonstocastici, e in genetici, che possono essere solo stocastici.Gli effetti stocastici compaiono con una relazione dose-effetto e aumentano laprobabilità che l’effetto si manifesti. Compaiono anche per basse dosi diradiazione e hanno un lungo periodo di latenza(anni, decenni). Sonomanifestazioni irreversibili e possono essere causate anche da altri agentieziologici. Gli effetti più frequenti sono tumori solidi(linfomi) e leucemie.

Gli effetti non stocastici sono causati da esposizioniad alte dosi di radiazione e sono legati alla loroazione citotossica. La curva che descrive l’incidenza dell’insorgenzadella patologia a seguito di esposizione a determinate dose è di tiposigmoide: è possibile osservare una dose soglia al di sotto della qualenon si evidenzia effetto, una dose lineare ed una dose di saturazione perla quale, pur aumentando la dose, non aumenta l’incidenza. Gli effetti,inoltre, variano molto a seconda del metodo di esposizione alle dose; seun topo viene irradiato con una dose di 2 Gray in una solasomministrazione, gli effetti sono più marcati rispetto al topo irradiatocon la stessa dose, ma in modo dilazionato nel tempo; in questo secondocaso infatti, l’organismo riesce a rispondere alla radiazione riparando idanni indotti dalla stessa. Con un’esposizione in brevi gradi quindi, glieffetti insorgono precocemente e sono abbastanza prevedibili. Questomeccanismo si trova alla base dei criteri di radioprotezione. I diversi tessuti rispondono in modo variabile alle radiazioni: il sistemanervoso centrale, ad esempio, viene colpito solo ad altissime dosi.

Patologie indotte da radiazioni ionizzanti, quindi eventuali complicazioni della radioterapia, sono: radiodermite, caratterizzata dalla morte delle cellule epiteliali(le cellule basali dell’epitelio

sono radiosensibili), cataratta, atrofia ovarica o testicolare, fibrosi polmonare e del miocardio stenosi di esofago ed intestino tenue aplasia midollare, ossia scomparsa delle cellule progenitrici, ridotta produzione di globuli

rossi, cellule leucocitarie e piastrine che determinano quindi leucopenie, piastrinopenie ecc.Il quadro clinico più grave legato all’irradiazione è quello relativo alla SIA(Sindrome daIrradiazione Acuta), dovuta a somministrazioni di dosi cospicue molto ravvicinate(es. esplosione diordigni nucleari e conseguente diffusione delle polveri nei centri abitati); la gradazione dellasintomatologia è legata alla quantità di radiazioni a cui si è esposti ed è inversamente proporzionaleal tempo impiegato per manifestazione acuta della malattia; infatti, mentre manifestazioni gravi

compaiono poco tempo dopol’esposizione, i sintomi più gravi sievidenziano anche dopo diversesettimane. Se la radiazione a cuil’individuo è stato sottoposto èinferiore e 2 Gray, la prognosi è del100% di sopravvivenza ed in questo

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caso avremo una manifestazione della malattia detta subclinica, caratterizzata da nausea, vomito elinfocitopenia; tra 2 e 6 Gray si determina manifestazione emopoietica che consiste in nausea,vomito, petecchie ed emorragie, carenza importante di neutrofili e piastrine e linfocitopenia ed esitain infezioni di vario tipo ed atrofia midollare che può necessitare di trapianto; tra i 6 e i 10 Gray sievidenzia una manifestazione di tipo gastrointestinale caratterizzata da nausea, vomito, diarrea,emorragie ed infezioni, carenza di piastrine e neutrofili e linfocitopenia, con prognosi di shock esuccessiva morte in circa 10-14 giorni anche in caso di trattamento con terapia di sostegno; sopra i10 Gray di ha coinvolgimento anche del sistema nervoso centrale, quindi manifestazione SNC, consonnolenza, convulsioni e coma in 15 minuti-3 ore che esita nella morte in poche ore.

Patologie indotte da radiazioni eccitantiLe radiazioni eccitanti sono radiazioni elettromagnetiche nello spettro delle ultraviolette (UV), conlunghezza d’onda λ compresa tra 100 e 400 nm, in grado di interagire direttamente con la materiavivente, in quanto vengono assorbite da specifiche molecole inducendo il passaggio di un elettronead un orbitale con energia superiore(stato eccitato) che aumenta notevolmente la reattività chimica.Gli effetti biologici sull’uomo consistono prevalentemente in lesioni cutanee e dell’apparato visivodata la scarsa penetranza nei tessuti, conseguenza di azioni dirette ed indirette. Non tutte lemolecole sono in grado di assorbire le radiazioni, e comunque presentano specificità per una datalunghezza d’onda: gli amminoacidi, ad esempio, assorbono a 210-270 nm, quindi, onde presentantilunghezze maggiori o minori non hanno effetto. Si parla in questo caso di spettro di assorbimento.Gli UV possono essere classificati in base alla lunghezza d’onda in:

UVc, con λ pari a 200-300 nm. Presentano alta energia e sono assorbite dagli acidi nucleici;hanno quindi azione mutagena e possono arrivare fino al derma, ma vengono in realtà filtratedagli strati cheratinici, che fungono da protezione per gli strati sottostanti(da evidenziarecome la cheratina sia una proteina, e quindipresenti spettro di assorbimento analogo aquello degli amminoacidi). Buona parte degliUVc vengono filtrati dallo strato Sdell’atmosfera e quindi arrivano sulla superficiterrestre in scarsa quantità. Per questo motivo,nonostante siano i più citotossici, il contributodi questi raggi nella patologia umana è moltoscarso.

UVb, con λ pari a 300 nm. Hanno energiaminore degli UVc, sono meno filtrate dagli strati cheratinici e possono quindi raggiungere glistrati basali dell’epitelio. A questa categoria si devono gran parte degli effetti mutageni degliUV.

UVa, con λ pari a 300-400 nm. Sono caratterizzati da bassa energia, ma sono scarsamenteassorbiti da amminoacidi e acidi nucleici, anche se dal punto di vista teorico, potrebberopenetrare in profondità.

Gli effetti delle radiazioni eccitanti si distinguono, come già detto, in diretti ed indiretti.Gli effetti diretti sono esercitati su amminoacidi ed acidi nucleici, in grado di assorbire laradiazione, e rendono la molecola capace di reazioni improprie. Le radiazioni UV possono romperei legami chimici tra le basi pirimidiniche(es. timina) favorendo la formazione di nuovi legami, cheuniscono tali basi in dimeri. Alla replicazione i dimeri pirimidinici si accoppieranno in manieraerrata, dando luogo, tramite le replicazioni successive, a mutazioni di transizione permanenti. Idanni genotossici possono essere compatibili con la sopravvivenza cellulare, e determinanoprincipalmente mutazioni a livello somatico. Le lesioni provocate dagli effetti diretti delleradiazioni eccitanti riguardanti la cute sono simili a quelle provocate dal calore e comprendono

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eritema, edema, lesioni bollose e danni necrotizzanti; si parla in questo caso di dermatite attinica,suddivisibile in tre diversi gradi di gravità:

I°grado= iperemia dermica II°grado= aumento della permeabilità dei vasi che genera edema, con conseguente

scollamento degli strati cheratinizzati e formazione di flittemi(bolle) III°grado= lesioni epidermiche gravi.

Le lesioni meno gravi possono esitare in ipercheratosi e iperpigmentazione. Lesioni a caricodell’apparato visivo invece determinano, nei casi meno gravi congiuntivite attinica(infiammazionedella congiuntiva), o, nei casi più gravi, ulcerazioni della cornea, cataratta e danni degenerativialla cornea stessa. Esistono una serie di meccanismi che proteggono cute e apparato visivo daidanni indotti dalle radiazioni eccitanti con effetto diretto; in particolare tale compito è svolto dallacheratina e dalla melanina, che assorbono le radiazione e ne limitano l’approfondamento. Inoltre, latioredoxina che utilizza come cofattore il glutatione, riduce i ponti disolfuro delle proteine,fungendo da protezione per i danni ossidativi da UV. I filtri solari delle creme sfruttano proprio lapresenza di molecole capaci di assorbire la radiazione.Gli effetti indiretti delle UV sono invece dovute ad interazione delle radiazioni con altre molecolechimiche, in particolare con sostanze fotosensibilizzanti, che non sono in grado di assorbirel’energia, ma la trasferiscono ad altre molecole. Si parla in particolare di reazioni fotodinamiche chepossono essere di due tipologie diverse:

Diversi composti chimici(origine esogena) provocano reazioni fotosensibili nell’uomo, tra i qualiantibiotici, sulfonamidi, contraccettivi orali, cosmetici… utilizzando entrambi i meccanismi edeterminando, nel primo caso trasferimento di energia ad amminoacidi ed acidi nucleici, e nelsecondo caso, coinvolgimento dell’ossigeno che assume configurazione di singoletto e che puòquindi, non avendo più limitazioni di spin, interagire con varie sostanze, tra cui lipidi colesterolo eacidi nucleici, che amplificano i danni ossidativi esponendo i tessuti anche ai danni da Uva, a cuinormalmente non sono suscettibili. Le sostanze fotosensibilizzanti possono essere anche di origine endogena, quali le porfirine, che, seaccumulate per carenza di enzimi nella catena di sintesi dell’eme, determinano assorbimento a 400nm circa, lunghezza d’onda dove normalmente non si ha interazione con le sostanze. Le onde radio non sembrano avere invece effetti sull’insorgenza di patologie gravi, ma determinanosolo riscaldamento dei tessuti.

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RISPOSTA DELLE CELLULE AL DANNO

L’induzione di effetti genotossici causamodificazioni nel genoma, quali sostituzioni,inserzioni, delezioni, duplicazioni e inversioni,quindi mutazioni puntiformi. La cellula risponde aldanno tramite diversi meccanismi deputati almantenimento dell’integrità del proprio materialegenetico:

trasferimento alchilico: molti agentimutageni devono i loro effettiall’alchilazione del DNA. La riparazioneavviene ad opera di O6-metilguanina aciltransferasi, enzima suicida che agisce trasferendoun gruppo alchile del DNA ad un residuo cisteinico.

BER e NER: complessi multienzimatici che si basano sull’azione delle endonucleasi, ossiatagliano il DNA nella zona del danno e poi lo riattaccano grazie ad una DNA polimerasi.BER e NER intervengono in situazioni leggermente diverse.

MMR: funziona in tandem con BER e NER ed interviene nella riparazione degli errori diappaiamento che causano distorsione dell’elica tridimensionale del DNA, deformazionericonosciuta da MHS1 e MLH1. Anche questi richiedono poi l’intervento di DNA polimerasie ligasi.

ricombinazione omologa: complessi multi enzimatici che si legano al DNA riconoscendo lerotture, tenendo i filamenti vicini e ricostruendo i legami intracatena. Questi sistemi siattivano tramite segnali intercellulari che coinvolgono la chinasi ATM, la quale regola laformazione di complessi sul DNA e induce segnali tramite P53 per bloccare la trascrizione.Se il processo fallisce, i segnali possono interferire con la sopravvivenza cellulare stessa.

I difetti nell’attività di riparazione di questi enzimi possono dare luogo a diverse malattie genetiche: sistema NER = Xeroderma Pigmentoso, causata dall’azione combinata di difetti genetici e

fattori esogeni per mancata eliminazione dei dimeri di timina formati dai raggi UV; ècaratterizzata da gravi aberrazioni cutanee(lesioni non cicatriziali anche per brevi esposizionialla luce), opacizzazioni della cornea, comparsa di tumori cutanei dovuta alle mutazioni.

sistema MMR = carcinoma ereditario del colon ricombinazione omologa = carcinomi famigliari della mammella e dell’ovaio sistema ATM = atassia teleangectasica

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Risposta funzionale allo stress ossidativo

La modificazione adattativa è mediata da NRF2, fattore di trascrizione localizzato nel citoplasmalegato tramite gruppi –SH alla proteina KEAP1, a sua voltacomplessata con le strutture del citoscheletro. In caso di danni daROS, NRF2 si stacca da KEAP1 per modificazione del legame etrasloca nel nucleo e, legandosi alle sequenze ARE, induce latrascrizione di geni che codificano per proteine con azioneantiossidante. Animali knock-out per NRF2 presentano gravidanni ossidativi. Se le specie ossidanti colpiscono le proteine ne causano unamodificazione strutturale, che ha come prima conseguenza ladenaturazione proteica, con perdita della struttura terziaria e dellafunzione e con tendenza alla formazione di aggregati. L’equilibrioconformazionale nella

cellula, ossia il corretto foalding, è una situazioneabbastanza instabile, infatti il ripiegamento appropriatoè mantenuto solo nel caso in cui le condizioni di pH,temperatura e concentrazione rimangano ottimali. Lecellule presentano sistemi per la regolazione delfoalding proteico che coinvolgono le chaperonine, il cuicompito è appunto quello di permettere il corretto ripiegamento e di indurre il re-foalding inproteine che siano state denaturate. Il protein misfoalding avviene in seguito ad aumento dellasintesi proteica, con relativo peggioramento dei controlli di qualità, oppure per fattori esogeni edendogeni(più rari), ed è molto grave per la cellula. Se le proteine alterate vengono immesse incircolo possono andare incontro a processi di aggregazione e possono causare gravi malattiedegenerative; la risposta all’alterazione proteica è costituita da UPR(Unfolded Proteins Response),che coinvolge diversi complessi funzionali. La catabolizzazione di queste proteine noncorrettamente ripiegate prevede il loro legame con le ubiquitine, che permettono il blocco dellaproteina stessa e il suo indirizzamento verso il riconoscimento da parte del proteasoma; questotaglia la proteina in frammenti che vengono distrutti dalle peptidasi nel citosol. Oltre a questo tipodi risposta esiste anche quella delle proteine da shock termico(il loro nome deriva dalla modalitàmediante la quale sono state scoperte, ossia scaldando le cellule fino a 50°C); prodotte in caso distress, la loro funzione è quella di partecipare a URP. Queste proteine sono distinte a seconda delloro peso molecolare(100,90,70..) e la loro caratteristica comune è di essere altamente conservatenella filogenesi, mantenimento fondamentale per la sopravvivenza della specie. Appartengono ingran parte alla categoria delle foldrine e aumentano in quantità durante la risposta al danno cellulareperché le HSP presenti stimolano la sintesi di HSP nuove, attraverso la liberazione di un fattore ditrascrizione, HSF1, che trimerizza e trasloca nel nucleo legandosi al DNA a livello diHSE(sequenze responsive a shock) e bloccando tutti i processi di sintesi proteica.

HSP27: stabilizza i microfilamenti e mantiene l’”impalcatura” della cellula HSP60: regola la degradazione proteica nei mitocondri HSP70-HSP90: stessa funzione protettiva in nucleo, citosol e mitocondri

In generale, le HSP legano le proteine unfoalded cercando di ricombinarle tramite l’azionecombinata di HSP a basso ed alto peso molecolare(es. HSP100 presenta un foro al centro chepermette il passaggio nelle proteine, il loro disassemblamento e il corretto ripiegamento). Moltoimportante è HSP32, anche detta emeossigenasi, che non è propriamente una foldrina, ma la suafunzione è quella di partecipare alle difese antiossidanti, aumentando la risposta a particolare

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stimoli e degradando molecole EME, contenenti ferro molto reattivo, che determinano laformazione di biliverdina e poi di bilirubina(la quale ha anch’essa funzione antiossidante) e dimonossido di carbonio, potente segnale intracellulare che attiva la risposta di sopravvivenza daparte della chinasi P38(antiapoptotica), apre alcuni canali e attiva la guanilato ciclasi.Il reticolo endoplasmatico è una struttura chiave per la formazione di aggregati proteici data la suafunzione di modifiche post-traduzionali, sintesi dei fosfolipidi, metabolismo degli acidi grassi eaccumulo di calcio intracellulare. Nel caso in cui queste funzioni vengano intaccate si attivano tresistemi di segnalamento, normalmente legati alla membrana ed eventualmente liberati nel citosol

ATF attiva la trascrizione di chaperonine eproteasi e blocca la sintesi di proteine disecrezione

IRE processa XBP1 e ha lo stesso effetto di ATF PERK innesca meccanismi di

autodistruzione tramite attivazione diCHOP(fattore di trascrizione di fattoriproapoptotici)

Autofagia e danno cellulare

Le condizioni in cui si verificano squilibri tra necessità e fornitura di ossigeno sono alla base dicondizioni patologiche. Un meccanismo di compenso alla disponibilità energetica è mediato da unsistema a cavallo tra meccanismi fisiologici e di risposta al danno: l’autofagia, necessaria per ilricambio cellulare, per le risposte adattative e nel controllo dell’accumulo di materiale da degradare.AMP e AMT formano aggregati nella cellula e inviano segnali che espandono le strutture dimembrana, avvolgendo porzioni di citoplasma e formando vacuoli, detti autofagosomi; su questiagiscono segnali che reclutano lisosomi che riversano enzimi e provvedono alla degradazione.Meccanismi paralleli coinvolgono direttamente i lisosomi ed in questo caso si parla di autofagiamediata da proteine da shock.La reazione autofagica, quindi, ha un significato importante nei meccanismi funzionali relativi allafornitura di nutrienti; infatti il processo autofagico fornisce substrati energetici e materiali dacostruzione(tramite demolizione di organuli non essenziali).Questa risposta è mediata da un complesso di attività che comprende inositide-3-fosfato chinasi, la

quale, producendo fosfatidilinositolo-3,4,5trifosfato, attiva PDK1, che a sua voltaattiva AKT, il quale fosforila e inibisceTSC1 e TSC2, enzimi che agiscononormalmente a livello di mTOR2; mTOR2riceve, nel caso di mancata inibizione diTSC1 e TSC2, segnali di sopravvivenza edetermina l’attivazione di processianabolici e sintesi proteica. TSC1 e TSC2sono attivate anche dalla chinasi AMPdipendente, che percepisce le variazioni

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energetiche della cellula, poiché regolata dal rapporto tra ATP e AMP. mTOR2 interviene anchenella modulazione dei processi autofagici.Tuttavia, il controllo dell’adattamento alla disponibilità di nutrienti è molto critico; intervengonoinfatti anche meccanismi regolati dall’ossigeno, che ha diffusione diversa nell’organismo(alcunitessuti devono adattarsi a lavorare in anaerobiosi). Il sistema che percepisce i livelli di ossigeno è

HIF1(Fattore Inducibile dell’Ipossia), appartenentead una famiglia di fattori di trascrizione tra cui figurano

anche 1α, 1β e 2α.HIF1α sono proteine in grado di percepire la quantità

di ossigeno poiché presentano rapido turnover e perchéla loro degradazione è legata all’idrossilazione ad operadi propilidrossilasi su specifici residui di prolina; la

velocità con cui questi enzimi agiscono dipende dalladisponibilità di ossigeno, in quanto si occupanodell’aggiunta di un gruppo –OH. HIF1α idrossilatocomplessa con il fattore di Von-Hippel-Lindau(VHL),ubiquitina ligasi che la invia al proteasoma. FHI

FHI è il fattore inibente HIF1α; in particolare ha azioneinibitoria mediante idrossilazione di un’asparagina..Quando l’ossigeno nella cellula diminuisce,diminuiscono conseguentemente i processi didegradazione di HIF1α e una certa quota si accumula

nel citoplasma, stabilizzandosi con HSP e traslocando nel nucleo; qui forma un dimero con HIF1β ep300-CBP, che riconosce sequenze HRE(Ipossia Responsive Elements) sul DNA. I geni regolati datali sequenze sono centinaia, molti dei quali partecipano alla via glicolitica come enzimi o cometrasportatori. HIF1α regola l’effetto Pasteur, ossia blocca la piruvato deidrogenasi econseguentemente la glicolisi aerobica, permettendo invece quella anaerobica, molto più rapida; inquesto modo il piruvato si trasforma in lattato. Inoltre HIF1α regola l’ossidazione degli acidi grassi,favorendo l’accumulo sottoforma di trigliceridi, la catenarespiratoria, inibendola mediante l’induzione di citocromicon minor affinità, oltre che il metabolismo glucidico. HIF ha molteplici vie di risposta(ridondanza), infatti,non solo è regolato dalla quantità di ossigeno, ma anche dasegnali indipendenti dalla disponibilità di quest’ultimo:ad esempio, dalla presenza di α-chetoglutarato, fumarato,succinato ecc.., i quali bloccano l’attività della

propilidrossilasi. Inoltre, alcune vie cheregolano la crescita cellulare, stimolano anche la produzionedi HIF, in modo ossigeno indipendente(quindi anche in presenza di adeguate quantità di ossigeno);questo avviene ad esempio nei tumori, dove la crescita incontrollata delle cellule neoplastichedetermina l’impropria attivazione di risposte da parte di HIF. Negli anni ’80 fu scoperto da Murry e dai suoi collaboratori il precondizionamento ischemico.Studiando gli infarti miocardici, Murry scopre che inducendo infarto transitorio nel cuore deiconigli, si determina un miglioramento delle condizioni in seguito ad infarto “permanente”.L’ischemia transitoria rendeva infatti il tessuto più resistente, fenomeno detto appuntoprecondizionamento ischemico. Questo processo risultò inoltre essere indipendente dallo stimoloattivante(stress termico, infezioni batteriche o aumento della frequenza cardiaca). I meccanismi diprotezione sono legati al rilascio di mediatori, principalmente adenosina e monossido d’azoto, e larisposta del tessuto si svolge in due fasi:

rapida, che compare rapidamente e ha durata media di 1-2 ore, consistente nel riadattamentodi alcune condizioni cellulari

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lenta, della durata di circa 5 ore e che compare dopo 12-24 ore, correlata con l’espressionegenica

La cellule quindi risponde la danno modulando in tempi brevi la sua attività e poi rendendosi piùresistente.

Malfunzionamento e insufficienza dei meccanismi di difesaIn caso di malfunzionamento o insufficienza dei meccanismi di difesa, i danni possono essere più omeno gravi a seconda dell’entità dell’”attacco”. Dal punto di vista biochimico, il danno si manifestacon risposte diverse, tra cui:

apoptosi autofagia necrosi catastrofe mitotica

Le morti cellulari più semplici e diffuse sono la necrosi el’apoptosi. La differenza sostanziale consiste nel fatto chel’apoptosi richiede energia(ATP); quindi, in caso di carenzaenergetica, la cellula tende a morire per necrosi.

NecrosiLa necrosi è definita come una forma di morte cellularecaratterizzata dal precoce aumento del volume cellulare edalterazione morfologica degli organelli ed esita nel rilascio dicostituenti intracellulari. Si caratterizza per l’aspecificità, non essendo dipendenti dalla causaeziologica, ma manifestandosi sempre nello stesso modo anche in organi diversi tra loro; è possibileevidenziare il fenomeno mediante colorazioni eosinofile:

picnosi, nucleo maggiormente colorato a causa della cromatina esposta cariolisi e cariolessi, rottura e frammentazione del nucleo organuli gravemente danneggiati rottura delle vescicole del RE rugoso

Generalmente coinvolge anche cellule adiacenti, dando origine ad un focolaio necrotico.La necrosi si differenzia, dal punto di vista dei patologi, in:

coagulativa o caseosa, caratterizzata da una tendenza all’addensamento delle strutture, chediventano più colorabili; si nota inoltre aggregazione delle proteine intracellulari.es. miocardiociti nell’infarto

colliquativa, che presenta degradazione delle proteine e degli organuli facendo perderecaratteristiche morfologiche e strutturali al tessuto. Spesso segue la necrosi coagulativa.es. tipica del SNC

Possono associarsi ad emorragia se coinvolgono anche le cellule endoteliali(necrosi emorragica),oppure si avrà deposito di materiale fibrillare(necrosi fibrinoide). Essenzialmente, la morte per necrosi consegue ad una improvvisa riduzione delle disponibilitàenergetiche della cellula. Le cause di tale carenza possono essere molteplici:

alterazioni mitocondriali, per danni provocati da diversi fattori ipossia cellulare, per mancanza di ossigeno, compromissione degli

scambi respiratori, anemia, inibizione delle funzionidell’emoglobina o problemi di perfusione.

attivazione di poliADPribosil transferasi(PARP, enzima di rispostaallo stress, aggiunge molecole di poliADPribosio al DNA conconsumo di ATP; segnale la presenza di danni al DNA a chinasideputate alla modulazione della risposta adattativa allo stress).

Se le riserve energetiche sono compromesse, vengo attivate rapidamenterisposte diverse, volte al recupero di ATP:

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adenosil transferasi forma, a partire da 2ADP, ATP e AMP; quest’ultimo si idrolizzaparzialmente a formare adenosina, che, liberata nella cellula, funziona da segnaleintracellulare con attività paracrina e autocrina, interagendo con recettori purinergici.

ATP viene anche generato in condizioni anaerobiche in alcuni tessuti per brevi periodi tramitefosfocreatina o più generalmente con riduzione di lattato.

Sono necessari dei sistemi di regolazione per mantenere il pH cellulare costante: una sua alterazioneinfatti può danneggiare gravemente la cellula, poiché causa acidosi metabolica data dagli ioni H+;questa situazione è compensata con meccanismi che coinvolgono scambiatori Na+/H+, i qualipermettono scambi elettroneutri grazie allaconcentrazione di sodio(145 mM fuori dallacellula e 1-2 mM dentro); se il sodio aumenta siha attivazione della pompa Na+/K+ in presenzadi ATP, mentre, nel caso in cui quest’ultimo siapoco abbondante, vengono attivati i simportiNa+/HCO3

-, i quali permettono l’ingresso nellacellula di acido carbonico che si combina con iprotoni formando acqua e anidride carbonica.Questo meccanismo determina tuttavial’ingresso di sodio, che causa depolarizzazionedella membrana e squilibrio osmotico coningresso di acqua e conseguente rigonfiamentodella cellula; per ovviare all’aumento di sodio, si attiva la pompa Na+/Ca2+ che usa il gradiente delcalcio(2 mM fuori e 10-7 mM dentro), mantenuto da una ATPasi calcio-dipendente e da pompe chenormalmente trasferiscono il calcio nel reticolo, per portare il calcio all’interno e estromettere ilsodio. In questo modo però, il calcio si accumula nella cellula, determinando impropria attivazionedi diversi enzimi che da questo ione dipendono e modificazione del citoscheletro; parte del calcioviene quindi portata nei mitocondri da una pompa Ca2+/H+ che annulla il gradiente neimitocondri(quindi gli ioni H+ escono).Osservando al microscopio cellule epatiche isolate in cui è stata indotta ipossia si è notato che:

dopo 15 minuti le cellule sono ancora normali dopo 18 minuti si osserva la formazione sulla membrana di estroflessioni, bolle di citoplasma

prive di organelli definite blebs, che rappresentano la compromissione del citoscheletro epossono staccarsi entrando incircolo come micro particelle. Laconcentrazione di sodio è giàaumentata di 5 volte, ma il volumerimane uguale, poiché esistonomeccanismi di compenso cheagiscono estrudendo altriosmoliti(es. potassio)

dopo 60 minuti il volume è ancoraintegro grazie all’ulteriore perditadi osmoliti

dopo circa 2 ore, il volume siaccresce e il sistema non funzionapiù: si determina collasso osmotico,la membrana cede e il citoplasma siriversa all’esterno. I danni sono

riscontrabili anche a livello tissutale, dove si osserva rigonfiamento del reticoloendoplasmatico, dei mitocondri e dei lisosomi, episodi di autofagia, formazione di aggregatidi cromatina nella fase iniziale seguita da cariolisi e rottura dei mitocondri.

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Fino ad un certo limite, il danno è reversibile, e la cellula può andare incontro a recuperofunzionale. In particolare, tale alterazioni reversibili sono la dissociazione dei ribosomi dallecisterne con formazione di aggregati, il rigonfiamento idropico e la steatosi, ossia l’accumulo digrassi. I danni irreversibili sono quelli caratterizzati da un ulteriore rigonfiamento fino a perditadella membrana plasmatica. Il limite oltre il quale il processo determina l’alterazione completa della

cellula è quello relativo all’impropria distribuzione delcalcio, che se non risulta più essere in equilibrio neimitocondri, determina danni irreversibili attivandoproteasi, fosfolipasi, proteine-chinasi cheinterferiscono con le funzioni cellulareimpropriamente. I mitocondri sfruttano il potenziale dimembrana per trasportare calcio al loro interno:disomogeneità del calcio intracellulare determinaalterazione della permeabilità del mitocondri stessi.Questo risulta essere un grave problema per la cellula,poiché, avendo i mitocondri un loro particolaregradiente di concentrazione dei metaboliti, essiriversano all’esterno il loro contenuto.Ciò che normalmente regola la permeabilità dellamembrana mitocondriale sono la presenza di calcio, laquantità di ATP e la formazione di ROS. I fenomeni di

transizione della permeabilità vedono l’aggregazione in membrana di ANT(Adenina NucleotideTransferasi), poi di VADC(canale anionico voltaggio-dipendente) ed infine della ciclofillina D.L’aumento della ciclofillina determina l’apertura di uncanale ionico da cui entra acqua nei mitocondri edescono elettroliti e componenti della matrice. Puressendo questi fenomeni di brevissima durata, essicoinvolgono un numero mitocondri sempre maggiore,determinando un collasso del potenziale mitocondrialecon ulteriore perdita di energia e ulteriore rilascio delcontenuto nel citosol. Questo fenomeno rappresenta ilpunto di non ritorno.Esistono poi fenomeni che caratterizzano la necrosi neidiversi tessuti. Ad esempio, nel sistema nervosocentrale di ha danno ipossico durante l’ischemia cerebrale; si parla in questo caso di eccitotossicità

delle cellule nervose, che prevede un massiccio rilascio delneurotrasmettitore glutammato sia da parte delle cellule stesseche da parte delle fibre che arrivano nelle zone interessate; sidetermina quindi stimolazione sia autocrina che paracrina deirecettori glutamminergici che risultano accoppiati ad un canaleper il calcio, di cui determinano apertura impropria, il calciopuò quindi attivare proteasi, accumularsi nei mitocondri oattivare l’enzima nNOS, il quale produce monossido d’azotoche forma, insieme ai ROS, il nitro perossido, in grado didanneggiare mitocondri e altre strutture; ad opera delnitroperossido viene quindi attivate tra le altre la

poliADPribosil polimerasi, che permette il riparo del DNA con consumo di ATP e quindi ulterioreperdita di energia.Come già detto, la rottura della membrana determina il rilascio dei componenti intracellulare neglispazi circostanti, fenomeno che provoca l’insorgenza dell’infiammazione acuta, con conseguenterichiamo di leucociti dal sangue al tessuto necrotico. Gli attivatori della risposta infiammatoria sono

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contenuti in particolare nei costituenti rilasciati dalla cellula in necrosi: essi vengono chiamatiDAMPs e comprendono HMGB1, associata agli istoni e rilasciata in risposta a danno nucleare,l’acido urico, frammenti di cromatina e DNA, le HSP(Heat Shock Proteins), la tioredoxina,glicoproteine quali le galetine, le IgM ed enzimi rilasciati da degradazione della matrice. Questesostanze sono riconosciute dalle cellule infiammatorie che determinano l’attivazione del processoinfiammatorio.I marcatori clinici di necrosi tissutali sono importanti per operare una diagnosi in tempi molto

brevi. Nell’infarto miocardico, ad esempio, la presenza dialcuni marcatori è piuttosto precoce, fatto che permette dirilevare il processo necrotico appena questo insorge. Inparticolare, si ha rilascio di mioglobina poche ore dopol’evento, seguito dalla troponina cardiaca, dalla creatin-chinasi e altri.

Apoptosi L’apoptosi è un’autodistruzione che segue un preciso programma intrinseco al sistema di rispostacellulare. Questo processo è sia un evento patologico, determinato per esempio da ischemia, sia unarisposta fisiologica che pone termine al processo vitale della cellula ed interessa singole cellule, chevanno incontro a morte individualmente. Tale meccanismo causa la formazione di corpi apoptotici,ossia strutture con membrana integra contenete organuli non danneggiati e frammenti dinucleo(differenza sostanziale con la necrosi); tali strutture si formano in conseguenza ad attivazionedi un canale Cl-/ K+ che determina il rilascio di potassio con conseguente fuoriuscita di acqua dallacellula, la quale, diminuendo di volume, si raggrinzisce e permette ad alcune porzioni di citoplasmadi entrare in contatto e di fondersi a formare appunto i corpi apoptotici; la membrana di questestrutture è resa maggiormente robusta dalla presenza di transglutamminasi, enzima che lega leproteine associate al citoscheletro. Con la disgregazione del nucleo inoltre, nel corpo apoptotico sidetermina una perdita dei codici di lettura del DNA con conseguente attivazione di endonucleasideputate al taglio della cromatina in frammenti di circa 200 paia di basi; questo processo èfondamentale per evitare che il DNA della cellula apoptotica, facilmente fagocitata dalle cellulevicine, si combini con il DNA di queste.Il programma apoptotico si compone di diverse fasi, rigidamente seguite dalla cellula:

iniziazione regolazione esecuzione rimozione delle cellule morte

Sostanze fondamentali dell’apoptosi sono le caspasi, serino-cisteino proteasi riconosciute in base alnumero relativo all’ordine in cui sono state scoperte. Si possono distinguere in regolatrici, coinvoltenelle prime due fasi, ed in effettrici, che intervengono invece nella fase di esecuzione. Le caspasisono attivate con un modalità a cascata, per cui le caspasi che vengono attivate per prima vanno adagire su quelle successive; inoltre, a loro volta, permettono l’attivazione degli enzimi coinvoltinell’apoptosi.Diversi sono i segnali che permettono l’avvio del processo apoptotico, spesso integrati tra loro:

segnali di membrana, i quali coinvolgono recettori che captano segnali provenientidall’esterno

segnali endogeni, quali alterazione dei mitocondri, reticolo endoplasmatico stressato o DNAdanneggiato

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A seconda dei segnali che innescano il processo apoptotico, si parla di via estrinseca o di viaintrinseca.

Per quanto concerne la via estrinseca, alivello della membrana plasmatica esistonodei recettori di morte, quali FAS, TNFα eTRAIL, che permettono il legame conligandi provenienti dall’esterno; quandovengo attivati, trimerizzano, affinché, sulversante citoplasmatico vengano favoriteinterazione omotipiche tra i domini dimorte DD(Death Domain). I diversirecettori funzionano in maniera simile purlegando ligandi diversi. Il recettore TNFαesiste in isoforme diverse che possonogenerare risposte differenti nella cellula:ad esempio, nelle cellule epitelialidetermina una riposta di sopravvivenza inquanto interagisce con la proteinaTRADD. La più importante proteina che

trasduce il segnale di morte per interazione tra il suo dominio DD con quello del recettore è laproteina FADD/MORT1, che oltre a contenere appunto un dominio DD, contiene anche un dominioDED(Death Effector Domain) in grado di reclutare altre proteine che contengono lo stesso dominiosecondo un meccanismo gerarchico. In particolare, le due proteine legate dal FADD/MORT1 sonodue procaspasi attivatrici(o iniziatrici), la caspasi 8 e la caspasi 10, contenenti anch’esse ben duedomini DED; in questo modo vengono reclutate molte caspasi 8 in uno spazio ristretto che vannoincontro a reciproco cliviaggio passando alla forma attiva. La caspasi 8 attivata ha come substratop22BID, sottoposta a taglio proteolitico con conseguente rilascio della sua forma attivata p15tBIDche invierà segnali ai mitocondri; questi sono un punto importante del processo apoptotico inquanto permettono grande amplificazione del segnale, ma devono disporre di buona quantità diATP, poiché il processo apoptotico necessità di energia(in caso contrario la cellula andrà incontro anecrosi).La via intrinseca dipende invece dasegnali mediati dai mitocondri, senzacoinvolgimento dei recettori di mortesulla superficie della cellula.Importanza rilevante in questa viaricoprono le proteine appartenenti allafamiglia Bcl2, che presentano incomune il dominio BH3 e che devonoil loro nome a quello che fuidentificato come oncogene in unlinfoma delle cellule B; esse possonoessere distinte in proteineantiapoptotiche e proapoptotiche, queste ultime suddivisibile a loro volta in BH3 only(contenentisono il dominio BH3) e in multidominio. La caratteristica delle proteine proapoptotiche, tra cuiBAX, BAD, NOXA, PUMA ecc, è quella di indurre la formazione di un porocanale da cui puòfuoriuscire il citocromo c, essenziale per la formazione dell’apoptosoma; nel citosol, infatti, cyt coligomerizza con APAF1, con consumo di ATP, complesso che permette l’attivazione di caspasi 9,posta sulla membrana mitocondriale esterna, mediante taglio proteolitico. Caspasi 9 attivata andrà asua volta ad attivare altre caspasi effettrici. Le proteine antiapoptotiche, tra cui Bcl-xl, Mcl-1, Bcl-wecc, possono impedire l’aggregazione di proteine proapoptotiche, stabilizzando la membrana e

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impedendo la fuoriuscita del cyt c. BID inoltre è attivata dal granzima B, che viene a sua voltarilasciato grazie alla perforina; è attivato inoltre da calpaine, catepsine e, come già visto, da caspasi8. Esistono diversi fattori che inibiscono i segnali di trasduzione proapoptotici:

IAPs, tra cui xIAP, così chiamata poiché il gene si trova sul cromosoma x, la quale inibiscecaspasi effettrici e non. Antagonista delle proteine appartenenti a questa famiglia èDIABLO(SMAC), secrete dai mitocondri con APAF1 che hanno quindi funzionepropapototica.

FLIP, proteina che inibisce la caspasi 8 HSP, in particolare quelle ad alto peso molecolare, che complessano con APAF1 impedendo

la formazione degli apoptosomi.I segnali per l’apoptosi possono derivare da diversi livelli della cellula; lo stress del reticoloendoplasmatico ad esempio, può causare l’accumulo di proteine non foldate, che induce la

trascrizione del gene CHOP, il quale determinarisposte proapoptotiche, attivando BIM-BAX einibendo Bcl-2. L’apoptosi può anche essereindotta da danno al DNA, il quale determinainterazione tra la chinasi ATM e proteine P53;P53 normalmente interagisce con i sistemi diriparazione del DNA e viene attivata perfosforilazione ad opera appunto di ATM, si slegadal suo inibitore MDM2 e regola la trascrizionedi diversi geni che impediscono laproliferazione cellulare; tuttavia, se l’attivazionedi P53 permane, questa induce la trascrizione diproteine proapoptotiche quali BAX, NOXA e

PUMA. Questo meccanismo è molto importante, poiché cellule geneticamente modificate devonoessere eliminate in quanto, se replicate, possono risultare dannose per il tessuto.La necrosi e l’apoptosi presentano quindi una serie di caratteristiche distintive:

Se i corpi apoptotici non vengono sequestrati si può andare incontro a necrosi secondaria,fenomeno che interrompe l’apoptosi e determina morte cellulare per dissoluzione della membranaplasmatica.L’eliminazione dei corpi apoptotici avviene tramite emissione di segnali che richiamano ifagociti(find me and eat me) da parte dei corpi apoptotici stessi. I segnali trovami sono nucleotidi,tra i quali figurano sfingosina 1 fosfato, lisofosfatidilcolina, CX3CL1(chemochina) ecc., cheinteragiscono con i recettori purinergici, come P2Y2, S1Prec, CX3CR1 ecc. I segnali mangiamiinvece, stimolano la fagocitosi: in particolare, dipendono dall’esposizione di fosfatidilserina daparte dei corpi apoptotici stessi che presentano un eccesso di questa molecola. Per attivare tali

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APOPTOSI membrana integra diminuisce il volume cellulare organuli intatti nucleo frammentato e DNA

idrolizzato attivazione di tranglutamminasi corpi apoptotici con membrana non altera il tessuto perché

interessa cellule isolate non dà infiammazione efferocitosi(morte pulita), i DAMPs

sono mantenuti nei corpi apoptotici

NECROSI membrana permeabile aumento del volume cellulare frammentazione organuli nucleo frammentato non si ha attivazione enzimatica dissoluzione della cellula modifica il tessuto si ha infiammazione è seguita da cicatrizzazione

segnali viene bloccata l’azione delle flippasi, che normalmente portanofosfatidilserina all’interno, e viene attivata l’azione delle scramblasi. Ilriconoscimento può essere diretto(con interazione) o mediato daproteine circolanti che si legano a fosfatidilserina e che sonoriconosciuti da recettori di membrana, tra cui la β2glicoproteina,GAS6 e MFGE8. Diversi segnali intracellulari impediscono al

fagosoma di produrre sostanzeproinfiammatorie. Questomeccanismo è rilevante anchenel riconoscimento self -nonself: i fagociti partecipanoall’eliminazione dei corpiapoptotici e evitano ilreclutamento dei linfociti T inducendo rispostetollerogeniche; se vengono impropriamente attivate risposteinfiammatorie si determina l’insorgenza di una rispostaimmunitaria.

Catastrofe mitoticaNecrosi e apoptosi non sono i soli meccanismi responsabili della rimozione di cellule danneggiate.In casi di gravi errori nel processo di mitosi si determinacatastrofe mitotica. Le cause di danno a questo livellosono molteplici:

danno al DNA(radiazioni ionizzanti, cisplatinoecc..)

arresto mitotico alterazioni del fuso mitotico(colchicina, taxolo..) inibizione delle chinasi mitotiche

In alcuni casi, i segnali che inducono l’apoptosi possonoanche stimolare la necrosi; si determina in questo casonecroapoptosi. Spesso, infatti, nel danno cellulare i duefenomeni convivono es. infarto miocardico ocerebrale, la zona interessata più gravemente dall’ipossiamuore per necrosi, ma le zone limitrofe muoiono perapoptosi.

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Risposta adattativa delle cellule al danno

Se la cellula sopravvive al danno deve adattarsi alla nuova condizione. Essenzialmente, la cellulapuò rispondere o con un aumento dell’attività, o con la diminuzione dell’attività oppure cambiandodi forma e dimensione. Il meccanismo più semplice è quello che prevede la diminuzionedell’attività cellulare conseguente ad una riduzione di nutrienti e di risorse energetiche. In questocaso si determina atrofia, ossia riduzione del volume di un organo o tessuto a seguito delladiminuzione del volume e/o del numero delle cellule che lo costituiscono. L’atrofia puòdeterminarsi sia in condizioni fisiologiche(come atrofia del timo nell’adulto per regressione deifollicoli o l’atrofia dell’endometrio nel postmenopausa) che in condizioni patologiche(quali l’atrofiamuscolare causata da denervazione conseguente a lesioni o l’atrofia surrenale dovuta aipofisectomia). Si può osservare inoltre atrofia senile dovuta all’invecchiamento ad esempio alivello dell’encefalo. Le cause di atrofia possono essere varie:

fisiologiche dotto arterioso di Botallo e vene ombelicali nel postparto timo nell’accrescimento diffusa senescenza

da ridotto apporto nutritivo digiuno protratto per compressione esterna o processi neoplastici ridotto apporto ematico per stenosi/legature alterazione degli scambi di nutrienti

da ridotta stimolazione muscolare, per immobilizzazione o denervazione muscolare, per lesioni tendinee ghiandolare, per ostruzione o legature

dei dotti(nelle esocrine) ghiandolare, per ridotta produzione di

ormoni(nelle endocrine) mammelle, utero, ovaie e vagina nelle

menopausaI fattori che portano ad atrofia sono analoghi in tutti i tessuti, ma questa condizione si determina permeccanismi diversi; infatti, nei tessuti a rapido turnover diminuisce il numero di cellule, mentre neiparenchimi a lento turnover prevale la diminuzione del volume. Inoltre, accanto alla riduzione deiprocessi di sintesi dei costituenti cellulari e della proliferazione cellulare, si osserva aumento deiprocessi di degradazione intracellulare e morte cellulare per apoptosi.Più complesse risultano invece essere le risposte all’aumento di richiesta funzionale. In caso diaumento o delle dimensioni cellulari si osserva ipertrofia, con conseguente aumento del peso e delledimensioni dell’organo(es. iperplasia mammaria in gravidanza e lattazione), mentre in caso diaumento del numero di cellule si determina iperplasia(es. iperplasia muscolare a seguito diesercizio fisico intenso). Spesso le due risposte coesistono. L’ipertrofia è tipica dei tessuti a bassoturnover, mentre la risposta iperplasica è tipica dei tessuti ad elevato turnover. Entrambi imeccanismi sono reversibile se viene interrotto lo stimolo.Le cause di ipertrofia ed iperplasia sono comuni:

da fattori congeniti macrosomio fetale

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iperplasie surrenali e tiroidee nel feto di madri con insufficienze surrenaliche o tiroidee da cause ormonali

surrenalica o tiroidea per aumento della secrezione ipofisaria gigantismo o acromegalia per aumento secrezione ipofisaria mucosa uterina in gravidanza per aumento degli estrogeni rare forme nel sistema nervoso periferico

da aumento della richiesta funzionale nel miocardio, fisiologica o patologica nel muscolo liscio, per stenosi degli organi cavi in organi pari, per asportazione di uno di essi(si parla

in questo caso di ipertrofie compensatorie, ad esempioin rene, surrene o ovaio)

per asportazione di parte di un organo della serie eritroblastica, in casi di ipossia cronica

In caso di iperplasia, vengono coinvolti i comparti staminale e proliferativo per aumentataproliferazione cellulare. La proliferazione staminale è di tipo conservativo, ossia la sua divisioneproduce sia una staminale sia una cellula che si differenzia. Le nicchie staminali si trovano neltessuto emopoietico nelle zone periva scolari, nella cute all’interno di ghiandole sebacee e a livellointestinale nelle cripte del Lieberkhun. Qui avvengono le regolazioni per l’immissione di cellule nelcomparto proliferante; l’attivazione della risposta iperplasica coinvolge segnali mediati da WNT eNOTCH. WNT viene secreto con modalità apocrina dalle cellule vicine e si lega al recettore

FRIZZLED, il quale regola un complesso proteico chedegrada βcatenina, la quale a sua volta agisce come fattoredi crescita. Tale complesso proteico contiene APC,glicogeno sintasi chinasi 3 e caseina chinasi 4, i qualifosforilano βcatenina. Se WNT si lega al recettore, questosi lega con proteine DESLEVELED che bloccano ladegradazione; la βcatenina può quindi entrare nel nucleo eattivare la trascrizione genica. Un altro gruppo è quellolegato al contatto cellula-cellula e mediato da NOTCH.Sono isoforme di un recettore che lega molecole proteichedette DELTA e JAGGED sulla superficie cellulare e chesubiscono conseguentemente cambio conformazionale

della porzione intracellulare di NOTCH, la quale viene tagliata da ADAM e γ-secretasi; questa puòquindi traslocare nel nucleo e regolare la trascrizione di geni, interagendo con la proteina CSL.

La rigenerazione epaticaNell’uomo, il fegato rigenera in 48 ore. Data la rapidità del processo, la rigenerazione non puòovviamente essere sostenuta solo dal comparto staminale; esistono infatti cellule differenziateterminali, gli epatociti, che supportano la rigenerazione. La cronologia dei segnali che concorronoalla proliferazione epatica dopo epatectomia parziale è la seguente:

dopo 5 minuti l’attività di urochinasi è aumentata dopo 15 minuti si ha attivazione dei segnali mediati da NOTCH tra i 10 minuti e le 6 ore, si determina traslocazione di βcatenina nel nucleo tra i 30 minuti e le 2 ore viene rilasciato

HGF tra i 30 e i 60 minuti vengono attivati i

recettori HGF e EGF; si determina quindiinizio della proliferazione con cicli didivisione degli epatociti, i quali hannotermine solo quando la massa torna

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normale. Solo nel caso in cui gli epatociti siano danneggiati interviene il comparto staminale,composto dalle cellule ovali nelle vicinanze dei dotti biliari.

Caratteristiche dell’ipertrofia cardiacaNegli atleti, il cuore aumenta la dimensione delle sue pareti con conseguente necessità di maggiorapporto ematico. In particolare, si determina un aumento delle strutture contrattili e della

membrana, del numero di mitocondri nelsarcomero e della matrice extracellulare,con relativa espansione dell’alberovascolare. Tuttavia, la portata coronaricaha un range limitato, per cui, un aumentodella riposta metabolica non può esserecompensato esclusivamente da unaumento di estrazione di ossigeno daparte dell’organo(che già a riposoconsuma circa il 75-80% delle riservedel sangue). Il sistema del miocardioipertrofico è quindi esasperato e lacapacità adattativa del miocardio èlimitata; questo provoca scompenso.L’ipertrofia cardiaca interessa

soprattutto il ventricolo; potrà inoltre essere concentrica od eccentrica. Nel primo caso, si osservaaumento del volume cellulare, ed è caratteristico della risposta all’aumento della pressione e deglisforzi isometrici; l’ipertrofia eccentrica è invece caratterizzata da allungamento cellulare al fine diaumentare le cavità e di accogliere un maggior volume di sangue.L’ipertrofia fisiologica si osserva negli atleti o durante la gravidanza, mentre la forma patologica ètipica della risposta all’ipertensione, a stenosi valvolari o a cardiopatie su base genetica. La maggiordifferenza riguarda la loro evoluzione: quella fisiologica è reversibile e non esita in insufficienzacardiaca, al contrario di quella patologica. Nell’iperplasia fisiologica si hanno diversi riscontri morfologici: esse può presentarsi comeeccentrica, con aumento della gittata cardiaca e tipica di ciclisti e nuotatori, oppure concentrica, conaumento della capacità contrattile e riscontrabile nei sollevatori di pesi. Nei vogatori si osservainoltre ipertrofia combinata.L’ipertrofia fisiologica assomiglia ai normali processi di crescita del miocardio( il cuore smette dicrescere subito dopo la nascita, quindi un aumento del suo volume è dovuto solo ad ipertrofia). Ilprocesso ipertrofico è scatenato dall’integrazione di un complesso di membrana recettoriale,sensibile a diversi ormoni, quali angiotensina, insulina, catecolamine o citochine; la distensionemeccanica del miocardio è mediata da tre tipi di messaggeri che coinvolgono integrine dimembrana, le quali legano componentidella matrice e si accoppiano con diversechinasi capaci di attivare cascate difosforilazione, da segnali legati al calcio esensori localizzati sulla stria Z delsarcomero. Tutti questi sistemi regolanonel nucleo fattori di trascrizione per lecomponenti contrattili del miocardio,componenti del mitocondrio ed enzimi peril sistema di controllo cellulare.Nell’ipertrofia fisiologica, il ruolo diintegrazione è svolto dagli IGF(Insulin-like Growth Factor); l’elevata capacità dirispondere, legata alla presenza di

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un’adeguata stimolazione la distingue dall’ipertrofia patologica, nella quale i meccanismi di innescosono legati a stimoli dovuti all’aumento della pressione sistemica. Il sistema renina-angiotensinasvolge un ruolo molto importante, agendo a livello sistemico e renale; altro mediatore che si attiva èl’endotelina, che stimola la contrazione muscolare; sono mediatori prodotti in condizioni di disagiodell’endotelio, insieme alla noradrenalina(recettori βadrenergici). In queste condizioni, lasovrastimolazione dei recettori ha come conseguenza l’attivazione di proteine chinasi e l’aumentodell’entrata di calcio nei miocardiociti, con conseguente squilibrio nelle risposte adattative eaccentuazione delle vie che coinvolgono calmodulina e chinasi calcio-dipendenti. Vengono espresseforme fetali di proteine contrattili, sono ridotti i processi di adattamento con riduzione delle rispostedi sopravvivenza: si determina quindi insufficienza cardiaca.Diversi sono i fattori metabolici che concorrono allo sviluppo dell’ipertrofia: questa condizione siassocia ad un aumento del consumo di ossigeno e dell’apporto vascolare. Nell’ipertrofia fisiologica

è privilegiata l’utilizzazione di acidi grassi, mentrenell’ipertrofia patologica si ha maggior utilizzazionedi glucosio: i due processi sono energeticamentediversi. L’aumento di secrezione delle catecolaminedurante l’ipertensione attiva la liberazione di acidigrassi dal tessuto adiposo, ma questi non vengonousati, poiché i sistemi favoriscono l’utilizzo diglucosio; la conseguenza è l’ingresso degli acidigrassi nei cardiociti, che non possono però essereossidati e determinano stress del reticoloendoplasmatico; si scatena quindi una risposta dilipotossicità che concorre ad indurre la morte deimiocardiociti. La diminuzione dell’efficienza

nell’insufficienza cardiaca è dovuta sia agli squilibri metabolici che alla formazione di ROS dovutaall’aumento dei mitocondri e all’incapacità di rigenerarli e sostituirli; inoltre, la stimolazione deirecettori induce l’attivazione di NOX e la sintesi di monossido d’azoto. La capacità di adattarerisposte antiossidanti è limitata; si hanno anche problemi nel controllo dell’omeostasi del calcio, chenell’ipertrofia fisiologica è normale, mentre in quella patologica la curva di recupero del calcio èrallentata a causa dell’insufficienza delle chinasi deputate alsuo trasporto e alla perdita di calcio da parte di canaliradotilina sensibili.Nel miocardio fisiologico ipertrofico il rimodellamento dellamatrice è modesto; al contrario, nell’ipertrofia patologica, ilrimodellamento è importante e prevede processi dideposizione del collagene che esitano in condizioni di fibrosi,causa di difficoltà nella contrazione del muscolo miocardico(ilmiocardio patologico si presenta ingrandito, sclerotico eincapace di contrazione).Quindi, le condizioni che determinano una ridotta contrattilitàmiocardica, conseguenti al processo di ipertrofizzazione ecausa di morte cellulare per insufficienza cardiaca severa sono:

eccesso di angiotensina II aumento delle citochine proinfiammatorie distribuzione di calcio alterata alterazioni metaboliche riduzione della rigenerazione dei mitocondri modificazione dell’espressione genica stress ossidativo alterazioni della matrice

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Tutte le forme di risposta adattativa sono tra loro reversibili e permettono il ritorno alle condizioniiniziali.

Metaplasia La metaplasia è una forma di adattamento caratterizzata dall’alterazione delle caratteristichedifferenziative cellulari(derivati dello stesso foglietto embrionale). Lo scopo è quello di rendere iltessuto più adatto agli stimoli.es. nei fumatori si osserva metaplasia bronchiale, in particolare l’epitelio ciliato bronchiale diventapluristratificatoes. metaplasia della cervice uterina, che da normale assumeconformazione ghiandolare, processo comune in caso si infezionie/o politraumatismi

Displasia La displasia invece consiste in un’alterazione della proliferazione o della differenziazione cellulare;il tessuto risulta notevolmente alterato, e può evolvere verso tessuti neoplastici.

es. displasia della cervice uterina, che presenta un numeromaggiore di cellule, dalla forma e disposizione fortementeirregolari.

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BETA-FIBRILLOSI E MALATTIENEURODEGENERATIVE

Le beta-fibrillosi sono un gruppo molto eterogeneo di malattie caratterizzate dall’accumulo intra- oextracellulare di aggregati proteici insolubili e resistenti alle proteasi; tali aggregati sonocaratterizzati dalla prevalente presenza di peptidi con struttura a foglietto beta.La beta-fibrillosi è alla base di diverse patologie, caratterizzate da accumulo di aggregati proteiciextracellulari (amiloidosi, malattia di Alzheimer) o intracellulari (morbo di Parkinson, malattia diHuntington); interessa inoltre le malattie prioniche. Tali manifestazioni patologiche, sebbenediverse, possiedono delle caratteristiche comuni.La condizione di stress del reticolo per accumulo di proteine denaturatedetermina il cosiddetto stress cellulare. Si formano, dalla degradazioneproteica incompleta, dei peptidi che possono aggregarsi e formare degliaccumuli a foglietto beta. Si ha così polimerizzazione, che avvieneall’interno o all’esterno della cellula. Ciò determina alterazioni nellefunzionalità delle cellule interessate e anche a livello dell’interoorganismo.Vi sono dei meccanismi di difesa intracellulare nei confronti dellaformazione di aggregati di proteine anomale; essi comprendono laformazione di vacuoli di autofagia, che permettono la degradazione di proteine unfolded omisfolded, l’attivazione di foldrine e di proteine da stress.

Amiloidosi

Le amiloidosi sono un gruppo eterogeneo di malattie aventi in comune la deposizione negli spaziextracellulari di sostanza amorfa chiamata amiloide (per il fatto che reagiva debolmente con i

coloranti per amidi, ossia soluzioni di iodio).L’amiloide è una sostanza di natura proteica, amorfa,presente a livello extracellulare in vari organi e tessuti.La sostanza amiloide si caratterizza per la specificacolorabilità con il Rosso Congo e per il fatto cheassume una bi-rifrangenza verde alla luce polarizzata.L’amiloide origina da precursori peptidici diversi, chea loro volta derivano da frammenti di proteine più

grandi, che hanno alcune caratteristiche in comune: le catene polipeptidiche nei filamenti corronotrasversalmente anziché longitudinalmente, assumendo una conformazione a foglietto beta. Quindiè l’organizzazione fisica delle proteine piuttosto che la loro sequenza amminoacidica a determinarele caratteristiche dell’amiloide. Oltre alla componentefibrillare, inoltre, abbiamo la componente globulare,caratterizzata da sostanza P dell’amiloide emucopolisaccaridi (cui si deve la reattività con sali diiodio).Le forme cliniche di amiloidosi sono presenti in grannumero e si differenziano non tanto per lasintomatologia, per la localizzazione degli accumuli oper aspetto dell’amiloide, quanto per l’origine dellasostanza amiloide stessa (proteina).

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Esistono tre tipi principali di amiloidosi: Amiloidosi AA: si associa a malattie infiammatorie croniche (lupus

eritematoso), infezioni croniche, forme neoplastiche, malattie genetiche(febbre mediterranea familiare). Nell’amiloidosi AA si assiste aproduzione di IL-6 e le citochine proinfiammatorie, con attivazionedella reazione di fase acuta a livello del fegato, si producono quindi leproteine di fase acuta, tra cui spicca il siero amiloide A (SAA); siassiste all’aumento in circolo dei livelli di SAA, che costituisce ilsubstrato per la formazione di peptidi che generano l’amiloide. Non èben chiaro come avvenga questo, forse coesistono dei fenomeni diparziale degradazione proteolitica, per cui i peptidi di SAApolimerizzano in zone extracellulari, soprattutto in aree perivascolari.Gli aggregati che ne derivano appaiono resistenti alle proteasi.

Amiloidosi AL: si associa a neoplasie caratterizzate dalla proliferazionedi plasmacellule, per cui si ha presenza in circolo di grandi quantità diimmunoglobuline (mAb). A causa della scorretta organizzazione dellasintesi di Ig si ha eccesso di produzione delle catene leggere, chepassano in circolo e nel filtrato glomerulare, dando le proteine diBence-Jones. Può avvenire una loro parziale degradazione proteoliticaa peptidi e a formazioni a foglietto beta, che polimerizzano in spaziextracellulari. Anche in questo caso il meccanismo non è ben chiaro eanche qui abbiamo aumento dei livelli circolanti di SAA. AmiloidosiAA e AL sono simili dal punto di vista microscopico.

Altre forme di amiloidosiL’aumentata di sintesi di SAA può avere molteplici origini, ad esempio può essere di derivazionegenetica. La transtiretina mutata può avere una conformazione tale per cui si ha una sua parzialedegradazione, con formazione di peptidi, e così via.Una forma di amiloidosi è associata a terapia dell’insufficienza renale con dialisi intraperitoneale,tale per cui non si elimina la β2-microglobulina, che si accumula, subisce degradazione parziale,ecc. L’amiloidosi può essere legata anche alla parziale degradazione di certe forme di insulina,ANP.

Processo di generazione della sostanza amiloide

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Conseguenze dell’amiloidosiL’accumulo della sostanza amiloide negli spazi perivascolari ointerstiziali (extracellulari) determina aumento della matriceextracellulare inerte, rendendo più difficili gli scambi di gas e disostanze nutritizie e metaboliti tra tessuti e sangue e viceversa. Si harallentamento del catabolismo cellulare, si osservano ipossia eprogressiva atrofia della componente parenchimale del tessuto.

Amiloidosi renale Amiloidosi cardiaca

Malattie da prioni

Con il termine prione si indica proteinaceous infective only particle. La scrapie è una malattia dellapecora, caratterizzata da alterazioni dell’encefalo, vacuolizzazione dei neuroni che danno gravicompromissioni neurologiche. Le stesse variazioni sono state riscontrate in malattie diverse:

Il Kuru è la forma epidemica di encefalopatia spongiforme osservata negli aborigeni della NuovaGuinea. La diffusione di tale malattia era associata all’usanza del cannibalismo rituale.

Malattia Organismo Eziologia

Scrapie Pecora InfezioneEncefalopatia spongiforme bovina (BSE) Bestiame InfezioneKuruMalattia di Creuzfeltd-Jakob

IatrogenaSporadicaEreditariaNuova variante

UomoUomo

Infezione

InfezioneNon notaMutazione del gene PrPInfezione da prioni bovini?

Sindrome di Gerstmann-Sträussler-Scheinker

Uomo Mutazione del gene PrP

Insonnia familiare mortale Uomo Mutazione del gene PrP

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Relazione cronologica tra diffusione di BSE e comparsa dicasi giovanili di encefalopatia spongiforme.

In Scrapie e Kuru, apparentemente, l’agente causale aveva caratteristiche infettive. Tale agente,però, appariva elusivo. Una serie di evidenze dimostrava che esso era resistente alle radiazioniionizzanti o ad altri trattamenti; era però suscettibile alle proteasi K. Prese piede l’ipotesi secondocui l’agente infettivo non era un virus, ma una proteina. Ciò andava contro i dogmi della biologia,infatti ci si chiedeva come potesse riprodursi senza DNA oRNA. L’ipotesi avanzata fu quella che affermava lapresenza di un struttura simile a una glicoproteinaintracellulare, definita PRionic PreCursor (PrPc), che sitrova soprattutto nella membrana plasmatica internaneuronale, e che sembra partecipi ai processi disegnalazione. La PrPc ha un rapido turnover, vieneendocitata e degradata nei lisosomi. Non presenta fogliettibeta, ma una grande componente ad alfa elica.La sequenza amminoacidica tra PrPc e proteina prionica, definita PrP-Sc (da Scrapie), è uguale, maè diversa la struttura tridimensionale; la PrP-Sc, inoltre, può indurre la PrPc ad acquisire la suastessa struttura. Le due proteine interagiscono tra loro e, probabilmente con l’aiuto di un corecettore(chaperonina), la PrP-Sc induce una modificazione conformazionale di PrPc. La nuova proteinaprionica sia accumula, polimerizza, per cui si innesca un meccanismo autocatalitico grazie al qualeaumenta il fenomeno di conversione PrPc PrP-Sc. Gli accumuli intracellulari di proteina prionicaaumentano e provocano morte cellulare.Se in topi knock-out per PrPc si cerca di indurre comparsa di encefalo spongiforme, questo risultaimpossibile, perché manca il substrato (PrPc).

Partendo da soluzione diluita di proteina prionica einducendo artificialmente interazioni tra proteinericombinanti e proteine prioniche, si attiva in vitro ilcambiamento conformazionale, con formazione diaggregati con struttura beta-fibrillare.Si ipotizza che il processo sia autocatalitico, però si è vistoche talvolta non è sufficiente il contatto di un solo agente,ma sembra necessaria la presenza di aggregati beta-fibrillariper indurre il cambiamento conformazionale nel precursore.

Si parla, in questo caso, di seeding.Proteine con caratteristiche prioniche sono presenti filogeneticamente in certi organismi come i funghi, questo forse è un sistema che viene usato per trasmettere informazioni. Si ipotizza che mutazioni di PrPc inducano

spontaneamente il cambiamento conformazionale.Ci sono poi forme iatrogene di malattie prioniche, in seguito ad esempio aimpianto di elettrodi. Questo anche perché il prione è resistente ai sistemi

classici di sterilizzazione.In generale, le patologie da prioni hanno latenza elevata, e tendono a comparire in età avanzata.

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Negli anni ’90 si determinò un’epidemia, con comparsa della Malattia di Creuzfeldt-Jakob insoggetti relativamente giovani. Avvenne in seguito ad un’epidemia di BSE nel Regno Unito,scatenatasi per uso di farine di origine animale nei mangimi. Le farine animali derivavano dacarcasse di capi abbattuti, tra cui pecore affette da Scrapie. Si verifica quindi un salto di specie:pecora bovino uomo. Nonostante i molti esposti, si ebbero pochi casi: probabilmente, leomologie di sequenza tra PrP-Sc e PrPc individuali hanno favorito l’insorgenza della malattia soloin certi soggetti.

Le vie mediante le quali sono possibili infezione da prionisono svariate: ad esempio, attraverso le cellule dendritiche eil sistema linfatico (milza e GALT). Si pensa che la proteinaprionica raggiunga, attraverso l’innervazione dei linfonodi, ilmidollo spinale e quindi l’encefalo, dove si trovano grandiquantità di precursore.E’probabile inoltre che il processo autocatalitico sia comuneanche alle amiloidosi. Alcune caratteristiche dell’infettivitàprionica sono comuni alle altre beta-fibrillosi. Il presuppostoè sempre l’eccesso di produzione di proteina nativa.

Neurofibrillosi

Le neurofibrillosi sono un gruppo di malattieneurodegenerative caratterizzate dalla presenza diaggregati beta-fibrillari.

Malattia di Alzheimer(AD)L’esordio della patologia è raro prima dei 50 anni, ma ha un impressionante aumento di incidenzacon l’invecchiamento: 3% dai 65 ai 74 anni; 19% dai 75 agli 84 anni; 47% oltre gli 85 anni. Nel 90-95% si tratta di forme “sporadiche”, senza familiarità evidente; nel 5-10% dei casi si hanno formeereditarie, di tipo autosomico dominante. Nei soggetti affetti da sindrome di Down si riscontranoregolarmente le alterazioni tipiche della AD, associate a deficit cognitivi più o meno evidenti.Sebbene il decorso della patologia sia specifico per ogni individuo, essa causa sintomi comuni allamaggior parte dei pazienti:

Viene spesso anticipata dal cosiddetto Mild CognitiveImpairment (Deterioramento cognitivo lieve) o MCI, notoanche come demenza incipiente o deterioramento isolato dellamemoria: gli individui con MCI hanno deficit cognitivi chesono maggiori rispetto a quelli che statisticamente si possonoaspettare per la loro età o istruzione, ma che noninterferiscono significativamente con le loro attività giornaliere.L’MCI amnestico è quindi considerato prodromico all’AD.

Deficit di memoria inizialmente circoscritto a episodi della vitaquotidiana.

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Vengono poi colpite la memoria episodica retrograda e quella semantica. La memoria procedurale viene relativamente risparmiata fino alle fasi avanzate. Morte solitamente dopo 5-10 anni dalla diagnosi.

Il morbo di Alzheimer è caratterizzato dalla deposizione di aggregati proteici insolubili (amiloide) nel parenchima cerebrale e nelle pareti dei vasi cerebrali, responsabili delle caratteristiche lesioni:

grovigli neurofibrillari di Alzheimer placche senili (neuritiche) angiopatia amiloide

Gli ammassi neurofibrillari o tangles sono fasci citoplasmatici checircondano e spiazziano il nucleo del neurone; hanno un aspetto “afiamma”, sono particolarmente evidenti con il metodo dell’impregnazioneargentica e risultano insolubili e resistenti alle proteasi. Sono composti perlo più da una forma abnorme ed iperfosforilata di una proteinacitoscheletrica microtubulare denominata tau. La componente principale dell’amiloide, che si riscontra a livello delleplacche senili, è un peptide idrofobico di 4,3 kDa definito peptide amiloide Aβ o solo Aβ. Ilprecursore dell’amiloide cerebrale è detto APP ed è una proteina di membrana, espressa in moltitessuti, che in seguito a splicing alternativo dà origine a 8 isoforme. La funzione di APP non è nota,si pensa che possa essere coinvolta nella regolazione della proliferazione cellulare.Il gene APP è localizzato sul cromosoma 21: nella sindrome di Down (trisomia 21) i depositi diamiloide sono già presenti in giovane età.Mutazioni del gene APP sono associate alla forma famigliare di Alzheimer.

Placca senile: neuriti distrofici circondano un nucleo di amiloide

Corteccia cerebrale: la colorazione al Rosso Congo evidenzia idepositi di amiloide (vasi e placca senile)

APP, attraverso una sequenza di reazioni proteolitiche, viene degradata da un enzima proteolitico dimembrana, α-secretasi, che stacca un piccolo peptide extracellulare, attivando una cascatatrasduzionale e consentendo ad altre proteasi di membrana (γ-secretasi) di completare ladegradazione. In particolare:

α-secretasi taglia a metà del peptide amiloidogenetico (Aβ) β-secretasi neuronale o BACE taglia a monte del peptide

amiloidogenetico γ-secretasi taglia a valle del peptide amiloidogenetico

La diversa attività di questi enzimi condiziona la quantità di peptide Aβprodotto. In particolare, se predominano β- e γ-secretasi, aumenta lagenerazione di peptide Aβ. Mutazioni nella sequenza di APP stessapossono determinare attivazione impropria degli enzimi.L’enzima γ-secretasi è un complesso multiproteico costituito dallaAspartil-proteasi presenilina 1 e 2 e dalle proteine Aph-1 (Anterior

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Pharynx Phenotype 1), Pen-2 (Presenilin Enhancer 2) e nicastrina. La γ-secretasi svolge diversefunzioni nella idrolisi di molecole coinvolte nel segnalamento intracellulare (Notch, Erb-B4) e nelturnover di proteine di membrana.Un eccesso di APP o un’azione differenziale di α-secretasi e BACE e poi di γ-secretasi fanno sì chesi formino quantità eccessive di Aβ. I frammenti che ne risultano, da 40 a 43 amminoacidi, hannoeffetti neurotossici; inoltre, aggregandosi, formano complessi insolubili resistenti alle proteasi e noticome amiloide cerebrale.Una parte del peptide Aβ ha importanti funzioni, poiché partecipa al signalling tra neuroni e cellulegliali; è un’eccessiva o ridotta degradazione di Aβ ad essere pericolosa.I livelli di Aβ sono regolati da:

Neprilisina: proteasi ancorata alla membrana che degrada monomeri e oligomeri di Aβ. Enzima che degrada l’insulina: può scindere anche monomeri di Aβ.

Una sovraespressione di queste due molecole previene la formazione di placche amiloidi.Non è tanto la presenza dei corpi di inclusione a determinare la patologia, quanto quella di dimeriod oligomeri di peptide Aβ.Sequenza degli eventi che porta alla formazione di aggregati beta-fibrillari nel corso di AD:

I meccanismi patogenetici dell’AD: Danni ai mitocondri Alterazioni delle funzioni neuronali: interazioni con la proteina tau, alterazioni dell’omeostasi

del calcio, alterazioni sinaptiche Infiammazione e danno endoteliale

I mitocondri sono bersagli sia di APP, che si accumula nei canali di import, sia di Aβ, cheinteragisce con diverse proteine e conduce a disfunzione mitocondriale. L’accumulo di Aβ colpiscein particolare la citocromo c ossidasi, alterando il trasporto degli elettroni, la produzione di ATP, ilpotenziale di membrana, e stimolando la produzione di ROS, l’accumulo di calcio e di MPT. Aβ,inoltre, interagisce con gli enzimi del ciclo di Krebs, (riduzione di piruvato deidrogenasi, ATP-citrato liasi e acetoacetil-CoA tiolasi). Si ha rallentamento della rigenerazione mitocondriale,presenza di mitocondri deformati, poco funzionali e con tendenza a transizione di permeabilità. Aβattiva le due proteine della fissione mitoncondriale DLP1 e Fis1, che determinano eccessivaframmentazione dei mitocondri e incapacità di generare mitocondri sani. Una fusione sbilanciataporta ad allungamento dei mitocondri, mentre una fissione sbilanciata porta ad eccessivaframmentazione; entrambe compromettono la funzionalità mitocondriale.Nell’AD si formano i cosiddetti tangles, aggregati beta-fibrillari di proteine del citoscheletro comela tubulina. Importante è tau, una proteine solubile presente negli assoni, dove promuovel’assemblaggio e la stabilità dei microtubuli e la mobilità delle vescicole di trasporto. La normalefosforilazione di tau avviene su residui di serina o treonina seguiti da prolina, ad opera di enzimi tracui GSK3, CdK5 e MAPK. Quella che si accumula nei tangles è una tau iperfosforilata, che perde

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affinità per i microtubuli e si associa a formare filamenti elicoidali appaiati, formando struttureinsolubili intracellulari. Aβ e ROS causano iperfosforilazione di tau, che a sua volta media latossicità di Aβ. Aβ altera quindi il trasporto assonale, poiché la perdita di funzionalità di taudetermina alterazioni gravi dei microtubuli. L’alterazione di tau è associata ai sintomi inizialidell’AD, quelli che si manifestano prima che prevalgano le attività tossiche di Aβ. Un danno deltrasporto causa accumulo di APP e chinasi, formazione di vescicole, deposizione neuronale di Aβ eneurodegenerazione. Il peptide Aβ interferisce con l’equilibrio del trasporto assonale,sbilanciandolo verso il trasporto retrogrado.Studi su neuroni dell’ippocampo analizzati con tecniche di immunofluorescenza hanno dimostratoche la motilità mitocondriale è ridotta dopo il trattamento con Aβ e anche la distribuzione lungo ineuriti risulta alterata. Inoltre, risulta affetta anche la ramificazione delle sinapsi e la crescita deineuroni trattati con Aβ. Ciò conduce inevitabilmente a diminuita produzione di ATP, seguita dadisfunzione sinaptica e neurodegenerazione.Aβ riduce la trasmissione degli impulsi nervosi e il numero delle vescicole presinaptiche. Inoltrecausa riduzione della produzione della neurotrofina BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) einterferisce con la secrezione di acetilcolina. Questi fattori sono importanti nella riduzione dellecapacità cognitive già nelle fasi precoci della malattia. Aβ e i suoi dimeri interferiscono, nelle zone

presinaptiche, con proteine che partecipano alla secrezione dineurotrasmettitore, con l’attivazione dei recettori per il glutammato.Si riscontrano, nell’AD, alterazioni nella distribuzione del calcio intracellulare,sia nel reticolo endoplasmatico sia nel mitocondrio, in relazione alla capacità diAβ di interferire con i meccanismi che regolano la concentrazione del calcio.Nella patogenesi dell’Alzheimer è coinvolta una risposta infiammatoria, chesembra riguardare la componente della microglia. Il peptide Aβ, infatti,interagisce con recettori RAGE, che sono PRR per PAMPs. L’interazione tra Aβe RAGE induce nelle cellule microgliali l’innesco di una rispostaproinfiammatoria, nel corso della quale vengono rilasciate citochine come

TNF-α, IL-1, IL-6, che non solo determinano richiamo e attivazione di altre cellule microgliali mastimolano neuroni adiacenti. Si richiamano anche cellule monocitarie dal circolo sanguigno, che quidifferenziano a cellule della microglia. Si assiste a fagocitosi degli aggregati di polimeri Aβ da partedelle cellule microgliali, e questo costituisce un ulteriore stimolo proinfiammatorio. Non è chiaro seil processo infiammatorio causi morte neuronale, ma sicuramente è un fattore importante.

Morbo di ParkinsonIl morbo di Parkinson (MP) è una malattia neurodegenerativa che compare in soggetti con più di 65anni caratterizzata dalla comparsa di tremori e da alterazioni dei movimenti a volte associati adecadimento intellettivo, dovuti alla perdita progressiva dei neuroni dopaminergici della substantianigra. La malattia è caratterizzata dalla presenza nei neuroni dopaminergici di inclusioni eosinofilechiamate corpi di Lewy, originati dall’aggregazione di proteine come la α-sinnucleina, variamenteassociata con ubiquitina e parkina.Alterazioni analoghe a quelle del MP sono presenti in soggetti intossicati con 1-metossi-4-fenil-tetraidropiridina (MPTP), che è un contaminante dell’LSD. MPTP è metabolizzata dallamonoaminossidasi degli astrociti in metil-fenil-piridinio, che, nei mitocondri dei neuronodopaminergici, va in contro a un ciclo ossido-riduttivo generando specie reattive dell’ossigeno.Forme simili sono date dall’esposizione a rotenone e paraquat.

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La patogenesi del MP è complessa, i fattori possibilmente coinvolti comprendono: Alterazioni nella degradazione di sinnucleine, che formano peptidi capaci di formare

oligomeri citotossici ed aggregati beta-fibrillari. Induzione da parte dei peptidi derivati da sinnucleina di alterazioni mitocondriali, con

induzione di stress ossidativo, ridotta sintesi di ATP e blocco della fusione dei mitocondri. Alterazione dei processi di degradazione proteica che coinvolgono la parkina, che ha una

funzione di ubiquitina ligasi. Alterazioni dei processi di autofagia e perdita di lisosomi, possibilmente a causa del danno

ossidativo. Ridotta autofagocitosi di mitocondri alterati da stress ossidativo in relazione anche a difetti

funzionali di parkina. Stimolazione di risposte infiammatorie.

Morbo di HuntingtonIl morbo di Huntington (MH) è una malattia autosomica dominante causata dall’inserzione dinumerose triplette CAG nel gene della huntingtina (HTT), che determinano la presenza di sequenzedi poli-glutammina nella proteina. La malattia si caratterizza per la comparsa progressiva dialterazioni motorie (corea, distonia, bradicinesia), dovute a modificazioni dei neuroni del nucleostriato, accompagnate da declino cognitivo e disturbi psichici.Nei neuroni colpiti si ritrovano inclusioni nucleari e citoplasmatiche formate da aggregati beta-fibrillari contenenti HTT. HTT mutante altera il traffico intracellulare, particolarmente di BDNF. Ladegradazione proteolitica di HTT genera oligomeri tossici che alterano l’attività del proteasoma el’autofagia, favorendo l’accumulo di altre proteine alterate. Inoltre, oligomeri di HTT alterano lafunzionalità dei mitocondri e i loro processi di fusione e frammentazione. Anche in questo caso siha innesco di una risposta di tipo infiammatorio, che coinvolge la microglia.

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L’INVECCHIAMENTO

Osservando una stessa popolazione di conigli lontano da predatori ed inambiente protetto, si nota come la curva di vita si sposta rispetto allastessa popolazione in condizioni di totale libertà; questo dimostral’importanza dell’ambiente per quanto concerne l’età massimaraggiungibile.Con aspettativa di vita si indica l’età che il50% dei soggetti nati ha la probabilità diraggiungere. Dopo la Seconda GuerraMondiale, l’aspettativa di vita si è alzata,portandosi a circa 65 anni per gli uomini e 70

anni per le donne; inoltre, tale limite ipotetico è in ulteriore ascesa, grazieal miglioramento delle condizioni socio-economiche, assistenziali esanitarie(anche la mortalità infantile, che è di molto diminuita, influiscesull’aspettativa di vita).La durata della vita si basa invece esclusivamente su basi biologiche. Itessuti e gli organi, durante l’invecchiamento, vanno incontro a diversi cambiamenti(diminuzionedella contrattilità miocardica, della filtrazione glomerulare, della velocità di conduzione nervosa erallentamento di altri processi).Quando ci si riferisce alla senescenza, normalmente si indica l’insieme di alterazioni patologichecausate da malattie ad essa associate: ad esempio, nel caso delle patologie neurodegenerative odelle neoplasie, la loro incidenza e gravità tende ad aumentare con l’età. In anziani che abbianosuperato i 70 anni senza presentare cospicue patologie associate alla senescenza, si parla diinvecchiamento di successo. Come già detto, durante il processo di senescenza si determinano una serie di modificazioni cheriguardano i vari tessuti del corpo:

nella cute si determina perdita di elastina e proteoglicani, aumento di collagene, diminuzionedel contenuto di acqua, diminuita proliferazione fibroblastica ecc…

nell’occhio si riduce la capacità di accomodazione e si determina calo della percezioneuditiva; in generale, si hanno alterazioni del sistema sensoriale

si osservano alterazioni nel ritmo sonno-veglia, nella velocità di conduzione degli impulsi edell’attività del sistema endocrino, con conseguenti patologieassociate, quali osteoporosi, iperglicemia, alterazioni nel metabolismolipidico ecc…

ulteriori modificazioni che riguardano gli apparati urinario, genitale,respiratorio e cardiovascolare.

Il processo di invecchiamento colpisce in modo diverso le cellule perenni ea rapido turnover(labili), oltre ad interessare anche la matrice extracellulare.

Invecchiamento delle cellule perenniPer quanto concerne le cellule permanenti, è possibile osservare unadiminuzione nel numero e nel volume cellulare variabile nei diversitessuti ed in aree diverse degli stessi; accumulo di sostanzeintracellulari legate a processi di fibrillosi(placche senili, groviglineurofibrillari e amiloidosi cardiaca) o alla formazione di aggregatilipoproteici(es. lipofluscina), non aggredibili da proteasomi o altrisistemi e che determinano quindi riduzione della plasticità sinaptica.Fondamentale importanza assumono in questo processo le alterazionimitocondriali. I mitocondri presentano un loro materiale genetico, in

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parte diverso da quello nucleare, essenziale per la codificazione diproteine che intervengono nella respirazione cellulare; l’accumulo dimutazioni a carico del DNA mitocondriale che si determina durantel’invecchiamento interferisce con la funzionalità di proteine essenzialiper il mitocondrio stesso. Sembra inoltre che vengano anche alterati ilturnover e la capacità dei mitocondri di fondersi e separarsi. Questodetermina conseguentemente un impatto sulla capacità energetica ditutto il sistema, che può portare a morte cellulare e diminuzione dellecapacità funzionali globali delle cellule permanenti.

Invecchiamento delle cellule labiliInvece, per quanto riguarda le cellule labili, si è scoperto che le lorocapacità proliferative sono limitate e per ogni specie è possibile unnumero massimo di cicli mitotici, definito numero di Hayflick. Per questomotivo, nei tessuti costituiti da cellule labili si osserva riduzione delnumero delle cellule ed un rallentamento dei processi di proliferativi, con assottigliamento degliepiteli, e dell’attività riparativa. Le cellule che raggiungono il numero di Hayflick vanno incontro amodificazioni fenotipiche dette senescenza replicativa, caratterizzate da aumento delle dimensioni,appiattimento, resistenza all’apoptosi ed espressione di SA(Senescence Associated)-β-galattosidasi.Esse verranno eliminate per riconoscimento da parte del sistema immunitario, anche se non sonoancora chiari i meccanismi con cui questo avviene(si suppone che siano responsabili delriconoscimento alcune citochine rilasciate dalle cellule stesse). La senescenza mitotica è attivatamediante diversi segnali, tra cui ROS, proteine da stress ed accorciamento dei telomeri. I telomerisono la porzione finale dei cromosomi, costituiti da lunghe sequenze ripetute e terminanti con unframmento di DNA a singola elica; a queste regioni sono associate TRF1,TRF2 e altri che formanocomplessi, i quali si associano alle sequenze telomeriche. I telomeri tendono ad accorciarsi ad ogniciclo cellulare: nel caso in cui si raggiunge un valore critico, i complessi di proteine associate altelomero attivano segnali di allarme, che a loro volta attivano P53, P16 e altri che bloccano l’attivitàproliferativa, modulando il numero di Hayflick. Interviene poi la telomerasi, che risintetizza lestrutture telomeriche e rallenta la comparsa di senescenza mitotica; un’attività telomerasicasovraespressa migliora l’attività dei tessuti labili.

Modificazioni della matriceDurante la senescenza si determinano inoltre modificazionidella matrice:

diminuzione dei proteoglicani diminuzione dell’acido ialuronico e del

condroitinsolfato diminuzione della compliance tissutale diminuzione della sostanza ialina

Anche nella matrice si osserva deposito di aggregaticostituiti da proteine AGE e della matrice stessa; leAGE(Advanced Glicosilation End-products) sono prodottidella glicosilazione avanzata. Il glucosio può presentarsi informa chetonica od enolica: nel primo caso reagisce con igruppi amminici degli amminoacidi per formare aggregati,definiti basi di Schiff, fortemente instabili che possonoessere trasformati in ulteriori composti detti prodotti di Amadori; questi vanno incontro a diversereazioni e portano alla formazione di composti finali a struttura ciclica, chiamati carbossimetil-lisine(CML), che sono appunto gli AGE.

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