Applicazione di tecnologie innovative per il monitoraggio dell’esposizione ambientale

Bologna, 25 Giugno 2009

Perché innovative?Tecnologie che trovano le loro basi dal sequenziamento del genoma umano/altri organismi

Studiano il comportamento di tutto il genomain un singolo esperimento

Integrano competenze di scienze biologiche, informatica ed ingegneria

TECNOLOGIE

Spazi omici

• Profilo metabolico

•Tutti i geni di una cellula o di un tessuto

1%-2% del nostro DNA è funzionalmente attivo

mRNA

++

Tossicogenomica• Applicazione delle tecnologie genomiche

alla tossicologia l’effetto avverso di molecole presenti nell’ambiente o di principi attivi farmaceutici– Valutare l’effetto in termini di pericolosità e

meccanismo d’azione– Analizzare la risposta a dosi differenti– Monitorare e classificare composti tossici– Studiare la variabilità individuale

Interesse verso tecnologie tossicogenomiche

Regolamento (CE) 1907/2006 (REACH)Punto 40. La Commissione, gli Stati membri, l'industria e gli altri soggetti

interessati dovrebbero continuare a contribuire alla promozione, a livello internazionale e nazionale, di metodi di prova alternativi, tra cui metodologie assistite da computer, appropriate metodologie in vitro, metodologie basate sulla tossicogenomica e altre metodologiepertinenti.

Genomics task force white paper

EUROPA

USA

TrascrittomicaTra i vari approcci di tossicogenomica l’analisi dei profili trascrizionali è lo spazio omico piu’ studiato ed attualmente anche il piu’ promettente per l’individuazione di biomarcatori da utilizzare nello screening dei cancerogeni e nel monitoraggio ambientale

mRNA si può copiare/amplificareDiverse tecnologie per depositare su supporto solido le

sequenze che riconoscono l’mRNA di un gene (collezioni miniaurizzate)

Avanzamento della microscopia in fluorescenzaSviluppo di sistemi di analisi statistica ed interpretazione

biologica dei dati

Perchè?

Modelli cellulari• Mammella PBMC• Polmone• Colon• Fegato• Cervello

BALB/c 3T3

V. fisheri

Umani

Murini

Batterici

Analisi trascrizionale:MICROARRAY

Esposizione della cellula al composto in esame

Estrazione RNARetrotrascrizione e marcatura

con sonde fluorescenti

ANALISI della VARIAZIONE di ATTIVITA’

GENICA

CTP-Cianina

•Le cianine presentano una struttura data da 2 indocianineeterocicliche unite da un ponte polimetinico: Cy 5 e Cy3 differiscono per la struttura di questo ponte. •Cy3 e Cy5 sono più fotostabili di altri marcatori fluorescenti. •Mostrano una buona separazione spettrale quindi sono eccitate a λdifferenti e la loro emissione può essere rilevata separatamente. Questo richiede 2 laser separati e filtri ottici opportuni. •Cy3 e Cy5 danno un forte segnale fluorescente e possono sopportare le temperature e le condizioni normalmente presentiin laboratorio.

La slide da microarrayMigliaia di geni spottati (probes) su un unico supporto (slide o chip)

• Un laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elio-neon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5.• Carosello a 48 posizioni• Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione • Software di Feature Extraction: calcolo della log(ratio) dei segnali nel rosso e nel verde associando, ad ogni valore, un errore che verrà utilizzato per calcolare un p-value finale, PVlog(ratio)

Piattaforma Agilent

LABORATORIO MATER – ARPA Bologna

OO3: 5µg/m 3

Analisi dei dati di microarray• I dati ottenuti dalle singole slide vengono

sottoposti ad analisi statistica: Gene Spring GX

• Interpretazione biologica dei dati: meccanismo d’azione

Dose 2

NT

Dose 1Dose 3

Dose 4Referencedesign

Validazione…….Diverse piattaforme/protocolliMolteplici sistemi di analisi statistica dei dati di microarrayDifferenti tool di interpretazione biologica

La standardizzazione dei protocolli è un requisito fondamentale per definire la qualità dei dati di microarray

Procedure operative standard, con sistemi di controllo intermedi: dalla manipolazione dei campioni fino all’output dello scanner.• Punti critici:

– Disegno sperimentale/numero di repliche– Analisi statistica – Interpretazione biologica convalida dei dati

MIAME

guidelines by the Microarray Gene Expression Data Society

• La conformità alle linee guida MIAME può essere verificata tramite riportando i dati di microarray in data-base MIAME compatibili ( es. Array Express, European Bioinformatic Institute, Cambridge).• La maggior parte delle riviste scientifiche richiede il soddisfacimento delle linee guida MIAME

Gene expression changes in radio-exposed workers: a human in vivo

study. Radiation Research, in pubblicazione

Esposti professionalmente a radiazioni X and γ Non esposti

28 28

Possiamo evidenziare dei marcatori trascrizionali di esposizione cronica frazionata

alle basse dosi di radiazione ionizzanti nel dominio < 25 mSv?

RispostaAnello linfomonocitario

Blocco bilanciato: ibridazione simultanea suuna slide di un campione diogni classe (esposto non esposto) con unadistribuzione equivalente dei2 fluorocromi tra le classi.

mRNA

Prelievo sangue

Analisi Analisi trascrizionaletrascrizionale in in microarraymicroarray

28 slide

Analisi statistica: Analisi statistica: 256 256 genigeni• Tutte le informazioni relative al campione in esame e

i nostri dati grezzi sono stati depositati in Array Express il data-base pubblico del European Bioinformatic Institute e sono consultabili(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/, accession number: E-MEXP-1277).

• Interpretazione biologica (EASE, NIH, USA)• 4 geni sono stati confermati mediante real-time PCR

Esposizione professionale

• Effetto sull’ impacchettamento del DNA dovuto all’ inibizione di diversi istoninuclesomici struttura cromatinicameno condensata

• Disturbo del trasporto elettronico NADH-ubiquinone aumento ROS

• Induzione di geni per le metallotioneinecon funzione antiossidante

The term ‘ecotoxicogenomicsecotoxicogenomics’ describes the integration of genomics into ecotoxicology.

OECD SERIES ON TESTING AND ASSESSMENT, 29-Apr-2005.Number 50, REPORT OF THE OECD/IPCS WORKSHOP ON TOXICOGENOMICS, Kyoto, 13-15 October 2004

The Population and Molecular Stress Responses of Daphnia magna

• Slide per lo studio dell’espressione genica (3000 geni)• Risposta al cadmio

Environ Sci Technol. 2008 Mar, Linking molecular and populationstress responses in Daphnia magna exposed to cadmium. Descrivono una slide con 14000 spots

Microtox toxicity test system

• Test di tossicità acuta in vitro che utilizza un batterio marino naturalmente luminescente Vibrio fisheri (ceppo NRRL B11177).

• Gli effetti tossici sul batterio si manifestano tramite un calo della luminescenza.

• Metodo APAT CNR IRSA 8030

Disegno di una slide per V. fischeri• Software per il disegno degli oligonucleotidi dedicati

alla espressione genica di Agilent : NearestNeighbour” - SantaLucia 98– Il ceppo di cui è stato pubblicato l’intero genoma è il

V.fischeri ES114, isolato dall’organo luminoso della seppia Euprymna scolopes

• Il formato della slide è 8X15K e include: – Tre repliche dell’ intero genomadi V. fisheri (3747 probe 60mer)– Controlli positivi e negativi– 371 probe contro V. cholerae(controllo addizionale di specificità)

Risultati prima titolazione:V. Fisheri/E. coli

100% 100% V. V. fisherifisheri

75% 75% V. V. fisherifisheri

50% 50% V. V. fisherifisheri

0% 0% V. V. fisherifisheri

La trascrittomica

preparano la loro “rivoluzione”e noi stiamo partecipando

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