Analisi di laboratorio e prove di campo per la valutazione ... · Caratteristiche microbiologiche...

Analisi di laboratorio e prove di campoper la valutazione qualitativa dei compost

Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisidell’economia agraria, Centro di Ricerca per l'Orticoltura diPontecagnano (SA) (Crea-Ort)

Massimo Zaccardelli

Potenza, 26 Maggio 2016

Azione C1: Monitoring of composting processes andcharacterization of compost quality

Analisi dei compost: pHE.C.attività idrolasica totalefitotossicità/biostimolazione caratterizzazione microbiologica soppressività


pH, EC, N tot., FDA (attività idrolasica) dei compost

EC N Totale Att. IdrolasicaS cm-1) (%) (μg FDA g-1 d.s. 2h-1)

L1 7,77 1.722 0,69 3,21L2 8,43 1.316 1,28 1,82L3 9,10 2.639 1,55 2,93L7-8 8,82 2.684 1,68 3,83L2C 8,21 1.850 1,85 2,70L1A 7,73 1.620 0,67 7,04L4 8,73 2.258 1,55 8,27L7A 8,20 2.324 2,96 2,6L2A 9,02 1.514 1,68 12,00L3A 8,59 1.564 1,42 11,37L4A 7,00 1.339 1,89 2,60L5/6A 6,95 1.950 1,32 2,7CV 8,57 6.591 1,45 7,66TO M.P. 8,38 2.982 1,79 6,84S.S. TO 7,92 1.904 1,62 16,26

Compost pH



Fitotossicità/biostimolante dei compost su Lepidium sativum

Caratteristiche microbiologiche dei compost


Batteri Totali

Funghi Totali

L1 8,59 4,67L2 7,78 4,23L3 7,48 5,92L7-8 7,59 6,36L2C 6,98 4,56L7A 5,88 5,23L1A 7,98 6,00L4 12,56 5,15L2A 6,76 3,30L3A 6,62 4,00L4A 8,12 5,96L5/6A 8,16 5,19CV 6,21 4,78S.S. TO 6,00 3,85TO M.P. 8,78 4,19

Compost(Log10 u.f.c. g-1)

Enterobatteri Clostridi E. coli Salmonella Streptococchi

L1 0 0 0 0 15,0 0,9 0L2 0 4,48 0 0 9,5 4,5 0L3 0 4,00 0 0 25,0 4,5 0L7-8 0 3,68 0 0 9,5 4,5 0L1A 0 2,60 0 0 9,5 0,4 0L4 0 0 0 0 140,0 45,0 0L2A 0 3,73 0 0 0,9 0,4 0L3A 0 3,38 0 0 0 0 0L4A 0 3,78 0 0 0,4 0 0L5/6A 0 0 0 0 7,5 2,5 0L7A 0 3,24 0 0 9,5 0,9 0L2C 0 2,52 0 0 9,5 0 0CV 0 0 0 0 9,5 0 0S.S. TO 0 0 0 0 4,5 0,9 0TO M.P. 0 0 0 0 4,5 0 0

Compost (M.P.N./g)Log10 u.f.c./g)

Coliformi fecali

Coliformi totali



0

25

50

75

100

L1 L2 L3

L7-8

TO M

.P.

S.S.

TO

L1A L4 CV

L2A

L3A

L4A

L5/6

A

L7A

RhizoctoniaSclerotinia

Inci

denz

a di

pia

ntin

e m

alat

e (%

)

* *

Valutazione della Soppressività dei compost


Isolamento di batteri antagonisti termoresistenti

Rhizoctonia Sclerotinia

L1 6 0 0L2 11 6 7L3 24 24 5L7-8 19 5 12TO M.P. 16 0 0S.S.TO-MP 14 13 10L1 A 14 4 4L4 8 7 6CV 11 8 8L2A 4 1 0L3A 21 6 9L4A 17 1 1L5/6A 6 0 0L7A 13 7 5

N° Isolati antagonisti di:N° isolati termoresistentiCOMPOST


Antibiosi in piastra


Soppressività in vivo


Biostimolazione dei batteri in vivo


Induzione di resistenza in planta


Valutazione dell’espressione in planta dei principali geni coinvolti nell’induzione diresistenza a seguito dell’interazione pianta microorganismi mediante real time PCR

Pathway metabolici di risposta ai PGPR

Calmoduline (CaM) e calmoduline-like proteins (CMLs) •Calmodulin-like protein - IPR011992 EF-Hand type•Jasmonate ZIM-domain protein 1 - IPR010399 Tify •Calmodulin-like protein - IPR018248 EF hand•Calcium-transporting ATPase 1 - IPR006408

Ethylene-responsive element binding factors (ERF)

•Ethylene-responsive transcription factor 4•Ethylene-responsive transcription factor 10•Ethylene-responsive transcription factor 1•Ethylene responsive transcription factor 2a


Solubilizzazione del fosforo

Sostanze antibiotiche prodotte dai Bacillus spp.


2. Bacilisina

1. Surfactina

3. Iturina

5. Fengicina

4. Bacillomicina-D

Patogeni targetBotritis cynereaSclerotinia sclerotiorumFusarium graminearumPenicillium expansumRhizoctonia solani

1 2 3 4 5MW


Le molecole indicate precedentemente sono peptidi non ribosomiali(NRPS) e quelle appartenenti alla famiglia delle surfactine sono le piùstudiate.

A causa della loro natura anfipatica, le surfactine si integranorapidamente nel doppio strato delle membrane e ne alterano la stabilità.

Meccanismo di azione delle Surfactine

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)


• L’analisi si basa sulla digestione, con enzimi four-cutter, di prodotti di PCR ottenuti utilizzando un oligomarcato con fluoroforo (es. FAM, HEX).

• La tecnica fornisce informazioni circa la diversità presente nel microbioma di un determinato campione.• Il risultato di tale tecnica è un elettroferogramma che descrive un profilo di

diversità della comunità microbica in relazione all’altezza ed ampiezza deipicchi presenti nel grafico.


Al fine di collegare la diversa soppressività dei compost alla diversa composizionemicrobiologica degli stessi, in due compost con differente soppressività (bassa edelevate), si è scelto di applicare un approccio di tipo metagenomico attraverso ilsequenziamento degli ampliconi 16S (batteri) e 18S (funghi).

Next Generation Sequencing per lo studio della biodiversità

elevata soppressivitàbassa soppressività

Compost

Estrazione DNA dal compost

Sequenziamento ampliconi 16S e 18S

Identificazione microorganismi

Analisi bioinformatica

Enzimi coinvolti nei principali cicli dei nutrienti nei suoli:•Fluoresceina diacetato idrolasi•Deidrogenasi•‐glucosidasi•Invertasi•‐galattosidasi•Glucosaminidasi•Fosfomonoesterasi•Arilsolfatasi•Ureasi•Nitrato reduttasi

Proprietà funzionali e metaboliche del suolo:•Carbonio microbico•Biomassa microbica (DNA)•Respirazione•Biolog Ecoplate•Apyzim•Ergosterolo


Azione C2: Monitoring of soil organic carbon stabilization and the improvement of physical and biological soil fertility

Enzima Substrato Ciclo

‐ glucosidasi e ‐ galattosidasi Cellulosa C

Invertasi Saccarosio

N‐acetyl –‐glucosaminidasi Chitina N

Nitrato reduttasi Nitrati

Ureasi Urea

Fosfatasi (mono‐e diester‐) Esteri fosforici P

Solfatasi Esteri solforati S

Deidrogenasi Enzimi idrolitici coinvolti in molteplici degradazioni

Fluoresceina diacetato idrolasi

Principali enzimi investigati e loro funzione nel suolo


Biolog Ecoplate

La diversità funzionale dipende da molteplici reazioni metaboliche e interazionimicrobiche pertanto è necessario determinare simultaneamente molteplici attività.

La diversità funzionale del suolo

Piastra con 31 differenti fonti carboniose, intriplicato, con un cromoforo per laquantificazione della crescita microbica


Analisi del contenuto di ergosterolo

L’ergosterolo è un lipide di membrana presente quasi esclusivamente nelle ife fungine e si degrada

rapidamente dopo la morte dell’ifa

Rappresenta una frazione piuttosto costante della biomassa fungina, circa 0,5 – 1,5 %

Per tali motivi la sua determinazione rappresenta una stima attendibile della biomassa fungina del suolo


La biomassa microbica come indicatoreLa biomassa microbica del suolo, include batteri, funghi, actinomiceti, alghe eprotozoi, e rappresenta un buon indicatore di qualità del suolo poiché imicrorganismi sono coinvolti in molteplici attività.

Determinazione:•Carbonio associato alla biomassa microbica

•Quantificazione DNA estraibile da suolo

Approccio classico, per mezzodel’ossidazione del carbonio microbico.

Estrazione da suolo

Corsa elettroforetica

Quantificazione fluorimetrica


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

µg N

H4-

N g

-1 h

-1

Ureasi

0

5

10

15

20

25

30

35

g fl

uore

scei

na g

-1h-

1

Attività idrolasica

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

μg N

O2-

N g

-1h-

1

Nitrato-reduttasi

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

μmol

pN

P g-

1h-

1

Glucosaminidasi

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

μmol

pN

P g-

1h-

1

-Glucosidasi

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

μg T

PF g

-1h-

1

Deidrogenasi

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

μmol

pN

P g-

1h-

1

-Galattosidasi

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

μmol

g-1

h-1

Invertasi

1,5

2

2,5

3

3,5

Shan

non

Inde

x, 9

6h

Biolog Ecoplate – H index

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

24 48 72 96

AW

CD

Tempo di incubazione

ControlloOrgano-mineraleCompost on-farm 10 t/haCompost on-farm 20 t/ha

Biolog Ecoplate – AWCD

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

μmol

pN

Pg-

1h-

1

Fosfomonoesterasi

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

μmol

pN

P g-

1h-

1

Arilsolfatasi

Azione C3:Monitoring of the agronomical, phytopathological and practical sustainability of proposed strategies


Produzione commerciale di scarola

Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (75 + 63 kg/ha N)C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N

Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)


Peso cespo tolettato scarola




Contenuto sostanza secca cespo commerciale

Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (75 + 63 kg/ha N)C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N


Produzione di ZUCCA

Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (85 + 40 kg/ha N) C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N)

B

AB

A

B

AB

AAB AB



ZUCCA – Numero frutti commerciabili per pianta

Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (85 + 40 kg/ha N) C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N)



Andamento dei valori SPAD su SCAROLA durante il ciclo 2014‐2015(media delle tre ripetizioni)



Andamento dei valori SPAD su ZUCCA durante il ciclo primaverile‐estivo 2015(media delle tre ripetizion)

Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (85 + 40 kg/ha N) C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) Potenza, 26 Maggio 2016

Monitoraggio dei nitrati del suolo durante la coltivazione di SCAROLA e ZUCCA (ott. 2014‐agosto2015)

‐

10

20

30

40

50

60

70

80

A B C D

NO‐3 ppm estate


Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza seccaD) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca

‐ 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

A B C D

EC estivo (dSm‐1)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

A B C D

EC invernale (dSm‐1)

Monitoraggio della conducibilità elettrica del suolo durante la coltivazione di SCAROLA e ZUCCA (ott. 2014‐agosto2015)


Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza seccaD) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca


Attività in corso e future- Approfondimento della caratterizzazione microbiologica dei compost mediante

metodi non colturabili (T-RFLP);

- Valutazione delle popolazioni microbiche nei 2 compost che hanno mostratoproprietà di soppressività differenziali (NGS);

- Valutazione delle attività enzimatiche nei suoli dopo 4 ammendamenti(2 anni);

- Valutazioni agronomiche dei compost su altri 2 cicli colturali;

- Monitoraggio in pieno campo dei nitrati, della EC e del pH nel suolo


RingraziamentiRiccardo Scotti e Roberto Sorrentino

Catello PanePaola Iovieno

Antonietta NapolitanoFrancesco Raimo

Alfonso PentangeloGiulia Alfano

Michele Caputo, Domenica Villecco, Armida Del Galdo

[email protected]

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BattipagliaPontecagnano

Grazie per l’Attenzione


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