I nuovi sistemi automatizzati per la lettura degli ANA in

immunofluorescenza indiretta

Elio Tonutti

Laboratorio di Immunopatologia e AllergologiaAzienda Ospedaliero-Universitaria di Udine

Tolmezzo 12.12.2012

Am J Clin Pathol 2002Am J Clin Pathol 2002

Ann Rheum Dis 2010

4

+ - STOP

Pos > 1:160

-SLE ?

Anti-nucleosome

PM or SS ?

ANA - IIF

ENA profile

+

DNA ENA screen EIA

EIA o IIF

+

confirm

titre

IIFEIA

Flow-chart of Connective Tissue Disease

Sp-100

Pattern

Centromer Cytoplasmic/Nucleolar Nuclear dots Others

CENP-B AMA, ribosomial, Jo1, Polym/Dermat, Scleroder

EIA DB LIA ALB

RNP, Sm, SSA, SSB, Scl70, Jo-1, PCNA,

histone

5

CRITERIA FOR THE CLASSIFICATION OF CRITERIA FOR THE CLASSIFICATION OF

SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUSSYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS(ACR (ACR SubcommitteeSubcommittee) )

HochbergHochberg MC. MC. Arthritis Rheum Arthritis Rheum 1997; 40: 17251997; 40: 1725

1. 1. Malar rashMalar rash

2. 2. Discoid rashDiscoid rash

3. 3. PhotosensitivityPhotosensitivity

4. 4. Oral ulcersOral ulcers

5. 5. ArthritisArthritis

6. 6. SerositisSerositis

7. 7. Renal disorderRenal disorder

8. 8. Neurologic disorderNeurologic disorder

9. 9. Haematologic disorderHaematologic disorder

HaemoliticHaemolitic anemiaanemia

LymphopeniaLymphopeniaLeucopeniaLeucopenia

ThrombocitopeniaThrombocitopenia

10. 10. Immunologic disorderImmunologic disorder

dsDNA AbsdsDNA Abs

SmSmAbsAbs

SerologicSerologic test test for syphilisfor syphilis

aCL IgGaCL IgG

aCL IgMaCL IgM

LACLAC

11. 11. Antinuclear Antinuclear antibodyantibody

Le problematiche legate alla refertazione:

• Quali pattern refertare• Come refertare i pattern• Quando e se eseguire test di conferma (ANA reflex)• Quando inserire un commento interpretativo

J Autoimm 2010

Pattern Antigeni Patologie

associate

Test reflex

Membrana nucleare Lamina, Gp210 SLE, Sj, CBP,AH GP210

Omogeneo , nucleoli+ DNA,Istoni SLE, Drug SLE, AR j DNA, ENA?, Istoni, Nucleos

Omogeneo, nucleoli - DNA, Istoni SLE, Drug SLE DNA,ENA?, Istoni, Nucleos

Speckled coarse hnRNP, U1 RNP MCTD ENA

Speckled large granul. U1 RNP MCTD ENA

Fine speckled SSA,SSB,Mi2,Ku Sj,SLE,SSc/PM ENA,SSc/PM auto-Ab

SCL70-like pattern SCL70,PM/Scl Pm/Scl ENA SCL70, Pm/Scl auto-Ab

PCNA pleiomorphic PCNA SLA, MCTD PCNA

Centromerico CENP A,B,C,D SSc limited; Rayn. CENP

Multi dots (5-10) Sp100,PML PBC Sp100, PML

Few nuclear dots (2-6) P80 coilin (raro) Sj, SLE, Rayn. P80 coilin

Nucleolare: omog,

clumpy, speckled

Fibrill,

Pm/Scl,RNA pol

Scleroderma Fibrill, Pm/Scl,RNA pol

Centriolo diversi Mycoplasma, Sj ? ?

NuMa centrofilina Mycoplasma ?

Pattern Antigeni Patologie

associate

Test reflex

CENP-F MSA-3 cancer ?

Citoplasmatico diffuso Jo1, PL7, PL12, OJ,

EJ, Sc, ribosomi

Miosite, SLE,

alveolite, Rayn

Ribosomi, auto-Ab

Pm-associati

Citoplasmatico fin.

Speck.

Jo1 e auto-Ab

anti-sintetasi

Miosite,

dermatomiosite

Jo1 e auto-Ab anti-

sintetasi

Mitocondri-like M2 CBP M2

Lilsosomi -like ? ? ?

Smooth muscle actina Autoimmune

Hep

actina

Vimentina-like ? ? ?

Midbody MSA-2 SSc, Rayn ?

Sistemi per lo screening dei campioni negativi e Sistemi per lo screening dei campioni negativi e Sistemi per lo screening dei campioni negativi e Sistemi per lo screening dei campioni negativi e per consentire allper consentire allper consentire allper consentire all’’’’operatore di operatore di operatore di operatore di concentrare concentrare concentrare concentrare professionalitprofessionalitprofessionalitprofessionalitàààà e tempo sui veri campioni e tempo sui veri campioni e tempo sui veri campioni e tempo sui veri campioni positivipositivipositivipositivi, per i quali i sistemi possono fornire , per i quali i sistemi possono fornire , per i quali i sistemi possono fornire , per i quali i sistemi possono fornire unununun’’’’interpretazione di alcuni pattern interpretazione di alcuni pattern interpretazione di alcuni pattern interpretazione di alcuni pattern fluoroscopici fondamentalifluoroscopici fondamentalifluoroscopici fondamentalifluoroscopici fondamentali

• Microscopio a fluorescenza

– Lampada LED (10000 h di durata)

• Stazione motorizzata per individuare vetrini

e pozzetti

• Fotocamera o telecamera

• Software

• Sistema autofocusing

• Screening totalmente automatizzatoScreening totalmente automatizzatoScreening totalmente automatizzatoScreening totalmente automatizzato• Analisi Analisi Analisi Analisi HEp2:HEp2:HEp2:HEp2:

– completa: tempo varia dacompleta: tempo varia dacompleta: tempo varia dacompleta: tempo varia da1 1 1 1 minuto a 5 minuti a pozzettominuto a 5 minuti a pozzettominuto a 5 minuti a pozzettominuto a 5 minuti a pozzetto

– screening pos / negscreening pos / negscreening pos / negscreening pos / neg– analisi dei pattern (alcuni)analisi dei pattern (alcuni)analisi dei pattern (alcuni)analisi dei pattern (alcuni)

• Quantificazione dei risultatiQuantificazione dei risultatiQuantificazione dei risultatiQuantificazione dei risultati• Archiviazione di datiArchiviazione di datiArchiviazione di datiArchiviazione di dati----immagini immagini immagini immagini • Preparazione report per pazientePreparazione report per pazientePreparazione report per pazientePreparazione report per paziente• Visione Visione Visione Visione livelivelivelive dei pozzettidei pozzettidei pozzettidei pozzetti

• Il sistema analizza Il sistema analizza Il sistema analizza Il sistema analizza intensitintensitintensitintensitàààà e struttura della e struttura della e struttura della e struttura della fluorescenzafluorescenzafluorescenzafluorescenza di ogni campione, per poter fare la di ogni campione, per poter fare la di ogni campione, per poter fare la di ogni campione, per poter fare la discriminazione discriminazione discriminazione discriminazione POSITIVIPOSITIVIPOSITIVIPOSITIVI---- NEGATIVINEGATIVINEGATIVINEGATIVI

• Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni pozzetto viene incubato con DAPI (4pozzetto viene incubato con DAPI (4pozzetto viene incubato con DAPI (4pozzetto viene incubato con DAPI (4’’’’6666----diamidinodiamidinodiamidinodiamidino----2222----phenylindol). Il DAPI permette il phenylindol). Il DAPI permette il phenylindol). Il DAPI permette il phenylindol). Il DAPI permette il riconoscimento dellriconoscimento dellriconoscimento dellriconoscimento dell’’’’elemento cellulare e la elemento cellulare e la elemento cellulare e la elemento cellulare e la messa a fuocomessa a fuocomessa a fuocomessa a fuoco

Esperienza col sistema Aklides

Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: NUCLEARE o CITOPLASMATICA NUCLEARE o CITOPLASMATICA NUCLEARE o CITOPLASMATICA NUCLEARE o CITOPLASMATICA

con assegnazione della fluorescenza ad uno dei con assegnazione della fluorescenza ad uno dei con assegnazione della fluorescenza ad uno dei con assegnazione della fluorescenza ad uno dei 5 pattern basilari del software5 pattern basilari del software5 pattern basilari del software5 pattern basilari del software

omogeneo dots

centromericonucleolare

speckled

La segmentazione delle La segmentazione delle La segmentazione delle La segmentazione delle immaginiimmaginiimmaginiimmagini

• Le Le Le Le immaginiimmaginiimmaginiimmagini cellulari vengono considerate cellulari vengono considerate cellulari vengono considerate cellulari vengono considerate OGGETTI che vengono definiti utilizzando OGGETTI che vengono definiti utilizzando OGGETTI che vengono definiti utilizzando OGGETTI che vengono definiti utilizzando sistemi di identificazione:sistemi di identificazione:sistemi di identificazione:sistemi di identificazione:– Regionali (spazio fisico) Regionali (spazio fisico) Regionali (spazio fisico) Regionali (spazio fisico) – Topologici (proprietTopologici (proprietTopologici (proprietTopologici (proprietàààà di figure e forme)di figure e forme)di figure e forme)di figure e forme)– Di superficie Di superficie Di superficie Di superficie

Image Processing of AKLIDES ®

homogenous

nucleolar

speckeld

centromere

cytoplasm

DAPI FITC

dots

Pattern omogeneo

Pattern centromericoVALUTAZIONE ESEGUITA VALUTAZIONE ESEGUITA

A UDINEA UDINE

CAMPIONI ANALIZZATI: CAMPIONI ANALIZZATI: • 530 sieri in totale di cui

• 502 campioni consecutivi inviati per

ricerca ANA

• 28 campioni selezionati con pattern

IFI peculiari e/o specificità

autoanticorpale nota

CAMPIONI ANALIZZATICAMPIONI ANALIZZATI

•SSA

•SSB

•DNA

•SP100

•Cenp-B

•AMA-M2

•Gp210

•RNP

•Scl70

•Jo1

•PCNA

•PMscl

•Sm

•P-ribosomiale

Specificità

Anche più specificitàpresenti: fino a 4

68 sieri con

ANALISIANALISI

Microscopia tradizionale:

• tessuto: Hep-2 Alifax

•Valutazione al microscopio a fluorescenza di due operatori esperti:

•Titolo e pattern

Sistema automatizzato di lettura

• tessuto Hep-2 Alifax

• Valutazione automatizzata con lampada a led

• Titolo e pattern

ANALISI : sistema ANALISI : sistema

automatizzatoautomatizzato

Titolo:

Negativo, debolm. pos., 1+, 2+, 3+,

Pattern:

• speckled,

•omogeneo,

•nucleolare,

•centromerico

•dots

•citoplasmatico

•non definito

RISULTATI N = 530RISULTATI N = 530

Negativi POSITIVINon

determinati

Lettura Aklides 279 (53%) 245 (46%) 6 (1%)

Lettura microscopio

256 (48%) 270 (51%) 4 (1%)

Positivi 67 su 68 sieri con specificità definita

RISULTATI POSITIVI : RISULTATI POSITIVI :

titolotitolo

BASSO ALTO

Debol pos e 1+ 2+, 3+, 4+

Lettura Aklides N = 245

115 (47%) 130 (53%)

1:80 ≥≥≥≥ 1:160Non titolati

Lettura microscopio

N = 27082 (30%) 185 (69%) 3

PATTERN IFI omogeneo PATTERN IFI omogeneo

e specklede speckled

47

123

190

61

0

40

80

120

160

200

N CAMPIONI

OMOGENEO SPECKLED

microscopio

Aklides

microscopio

PATTERN IFI: altriPATTERN IFI: altri

0

2

4

6

8

10

12

14

N CAMPIONI

centromero

nucleolare

dotscitoplasm

at

membra..

matrice n

non defi...

PATTERN

microscopio

Aklides

Dots microscopio: misti + speckled e omogeneo = 20

N = 22

AGREEMENT (88.4%)

POS NEG

POS 231 20 (3.7%)

NEG 42 (7.9%) 237

MICROSCOPIO

AKLIDES

273 257 530

251

279

DEI 42 SIERI AKLIDES NEGATIVI/MICROSCOPIO POSITIVI:

• 29 speckled e/o omogeneo 1:80

• 8 speckled e/ o omogeneo o matrice nucleare 1:160

• 5 speckled o matrice nucleare 320

(1 siero SSA 52 kd positivo a basso titolo)

4,2% 3,1%

8% 2%

M. pos/A. neg M. neg/A. pos

Udine* 7.9% 3.7%

Berlin University** 4.2% 3.1%

Berlin private Lab** 8.0% 2.0%

M = lettura al microscopioA = lettura Aklides*Diluizione 1:80**Diluizione 1:160

Il gruppo di studio SIMeL di Autoimmunologia ha in corso uno studio comparativo tra 6 sistemi per l’interpretazione automatizzata del test ANA:

• 132 sieri validati in 6 laboratori utilizzando 6 diversi substrati Hep-2• I 132 sieri sono stati sucessivamente processati per gli ANA dai rispettivi “specialist” nei laboratori di Udine e Merano• Sono in corso le analisi dei risultati

A B C D E D

Falsi negativi 7/95 2/95 27/95 11/95 10/95 2/94

Sensibilità % 92.6 97.9 71.6 88.4 89.5 97.9

Falsi positivi 2/42 15/42 0/42 2/42 8/42 10/42

Specificità % 95.2 64.3 100 95.2 81.0 76.2

• automazione degli step interpretativiautomazione degli step interpretativiautomazione degli step interpretativiautomazione degli step interpretativi• oggettivitoggettivitoggettivitoggettivitàààà del sistemadel sistemadel sistemadel sistema• assenza di influenza della struttura assenza di influenza della struttura assenza di influenza della struttura assenza di influenza della struttura

intrinseca dellintrinseca dellintrinseca dellintrinseca dell’’’’occhio umanoocchio umanoocchio umanoocchio umano• abbattimento della soggettivitabbattimento della soggettivitabbattimento della soggettivitabbattimento della soggettivitàààà

interpretativa in fase di screeninginterpretativa in fase di screeninginterpretativa in fase di screeninginterpretativa in fase di screening

• STANDARDIZZAZIONESTANDARDIZZAZIONESTANDARDIZZAZIONESTANDARDIZZAZIONE

• I sistemi automatici per la lettura degli ANA sono in grado di discriminare i sieri ANA positivi da quelli ANA negativi

• Sono in grado di identificare i sieri ANA positivi e con autoanticorpi specifici

• I sistemi sono completamente automatizzati

•Sono in grado di archiviare tutte le immagini su scheda/paziente e di collegarsi al LIS.

•Possono processare oltre ai vetrini HEp-2 anche vetrini per ds-DNA, ANCA e 3 tessuti

• Come tutti i sistemi di acquisizione e di interpretazione di immagini interpretano l’immagine in rapporto alla qualità del substrato utilizzato

• Possono avere un ruolo rilevante nel fornire un “titolo” oggettivo di positività

CONCLUSIONI