Adriana Maggi

METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

GENERAZIONE DI ANIMALI REPORTER Ingegneria Animale

animali mutati geneticamente ad esprimere un gene reporter

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE

Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD)

Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)

TRANSGENESI STANDARD

GENE TARGETING

Microiniezionedel DNA clonato

zigote

Embrionestadio 2 cellule

Impianto nellafemmina pseudogravida

10-20% dei nascituricontiene il transgene

Trasfezione del DNA clonatoin cellule ES

Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti

Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida

Topo chimerico

Ibrido F1

25-75% della progenieportano il transgene

Preparazione oociti fecondati

Preparazione ‘pseudo pregnant’

Screening della progenie

Preparazione costrutti

microiniezione

Preparazione oociti fecondati

Cocktail ormonale

Incrocio

Recupero uova fecondate

Preparazione del costrutto

Purificazione del transgene

propagazione del transgene

transgene Vettore di clonaggio

Impianto degli oociti microiniettati

Preparazione delle ‘pseudo pregnant’

FemminaMaschio vasectomizzato

Incrocio

Prelievo delle uova fecondate

MicroiniezioneTrasferimento delle uova

fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di

femmina pseudogravida

Microiniezione e reimpiantodegli oociti microiniettati

Screening della progenie

Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per :

Southern blot

PCR

GENE TARGETING - procedura -

• generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES)

• preparazione del vettore

• trasfezione delle cellule ES con il vettore

• iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti

• generazione di topi mosaico

• incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale

Generazione di cellule staminali ES

Femmine dopo 3-4 giornidal concepimento

Blastocisti

Espianto e messa in coltura

Crescita in terreno selettivo per le ES

Disaggregazione

1 passaggio

Linea pura

Trasfezione del vettore (elettroporazione)

Cellule ES

Selezione dellecellule knock out

Trasfezione delle ES

Strategia di selezione delle ES knock outDestino del DNA

Integrazione random

Integrazione sito specifica

Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

Iniezione delle cellule ES nella blastocisti

- generazione di animali mosaico -

Incroci per l’omozigosi

F2Omozigoti 1:4Eterozigoti 1:2Wild type 1:4

Founder/wild type

F1/F1

REPORTER SYSTEMSTO STUDY DRUGS ACTIVE

THROUGH INTRACELLULARRECEPTORS

GFP

POL II, TF, co-regulators

ERERER

ER ER

ReporterERE

transcription

Reporter: easily detectable protein REPORTER MOUSE

INSULATOR( MAR )

INSULATOR

( MAR )

lightluciferin + ATP = oxyluciferin + AMP +

TKERE 2x

firefly luciferase

+/- +/-

ERE-Luc reporter mouse

The ERE-Luc reporter mouse: a model to study of ER transcriptional activity

Ciana et al., 2001

ERE

kinase-dependent activation

i.p. of D-luciferin

20 min.

Evaluation of ER transcriptional activity

5 min. after the acquisition

18.516.514.513.5 15.5

ERE-Luc mouse

ER is transcriptionally active at day 14.5 pc

dpc (day post conception)

ERE-Luc mouse

P118.516.514.513.512.5

dpc (day post conception) post-natal day 1

endoderm mesoderm ectodermimaging IHC

A B C D

E

F

G

H

C – intestine 20xD – bone 40xE – heart 40xF – forebrain 10xG – moustache 40x H – skin 20x

16.5 dpc 16.5 dpc

GP Rando, 2007

ERE-Luc mouse bone

0

2

4

6

thymus

0

1

2

3

4

brain

0

5

10

15

20

P E M D2

intestine

0

4

8

12

16

bone

0

2

4

6

thymus

0

1

2

3

4

brain

0

5

10

15

20

LU

CIF

ER

AS

E A

CT

IVIT

Y (

RL

U)

P E D

intestine

0

4

8

12

16liver

0

10

20

P E M D2

ovaries

0

2

4

uterus

1

3

5

7

9

0

6

12

liver

0

10

20

P E D2P E D

ovaries

0

2

4

uterus

1

3

5

7

9

0

6

12hypothalamus

M D P E

Est

rad

iol

(pg/m

l)

1020

30

40

50

day 1 day 2 day3 day 4

SESTRUS

E2

(p

g/m

l)

1020304050

M D P E

Luciferase activity in adult, cycling females

Ciana et al, Nature Ned., 2003

Suckling Mice

Pregnancy &

EmbryoDevelopment

13.5

14.5

15.5

16.5

17.5

18.5

19.5

12.5

DAY 18.5

DAY 16.5

DAY 13.5

DAY 14.5

DAY 15.5

DAY 1

DAY 10

Immature Mice

Adult Mice

LIFE

CYCLE

ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals physiopathology

MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS

Functional Magnetic Nuclear Resonance

Optical imagingBioluminescence

Ultrasound

MicroPETPositron emission tomography

Nuclear imaging

Micro SPECTsingle-photon emission

computerized tomography

2/06

Fluorescence

PARTICULARLY, IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH!

ONE PICTURE IS WORTH TEN THOUSAND WORDS(Frederic Barnhard 1927)

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