ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA Dottoranda:...

ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA

ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA

Dottoranda: Coordinatore: Dott. ssa Fabbro Elisa Chiar. mo Prof. Alessandro Ventura

Tutore e Relatore: Dott. Not Tarcisio

Dottorato in Medicina Materno - Infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia (XX ciclo)

Definizione di celiachia (CD):“E’ un’enteropatia autoimmune che si manifesta in individui geneticamente predisposti in seguito al consumo di glutine.”

LA CELIACHIALA CELIACHIA

In particolare la In particolare la frazione tossica frazione tossica del glutine del glutine è rappresentata è rappresentata dalla sua dalla sua componente componente alcool solubile:alcool solubile: LA GLIADINALA GLIADINA

La celiachiaLa celiachiaSINTOMI E

SEGNI

I VILLI INTESTINALI:

Sottili filamenti situati nell’intestino tenue deputati ad aumentare la superficie di assimilazione del tubo digerente. Il danno subito dai villi porta quindi ad una riduzione di tale superficie e ad un conseguente malassorbimento di nutrienti

La celiachiaLa celiachia SINTOMI GASTROINTESTINALI

Diarrea cronica con steatorrea ( perdita di grassi non assorbiti con le feci)Dolori addominali, epigastralgia e dispepsia

Meteorismo

Vomito

Spasmi addominali

La celiachiaLa celiachia SINTOMI EXTRAINTESTINALI

Anemia da carenza di ferro, di acido folico e/o vit. B12Aumento delle transaminasiOsteoporosiInfertilità / abortiDisturbi neurologiciCrampiRitardo della crescita ( nei bambini)Secchezza delle mucose

La celiachiaLa celiachia

PATOLOGIE ASSOCIATE

Diabete mellito insulino dipendenteTiroiditi autoimmuniArtrite reumatoide Sclerosi multiplaCardiomiopatia dilatativa Idiopatica


DIAGNOSI

Per porre diagnosi di celiachia si seguono Per porre diagnosi di celiachia si seguono due due

diverse stradediverse strade : :

TECNICHE NON INVASIVETECNICHE NON INVASIVE

TECNICHE INVASIVETECNICHE INVASIVE


Le tecniche invasive sono rappresentate da Le tecniche invasive sono rappresentate da esami strumentaliesami strumentali: : EGDS (esofagogastroduodenoscopia)EGDS (esofagogastroduodenoscopia)E’ la metodica attualmente più usata per E’ la metodica attualmente più usata per ottenere delle biopsie, che di solito sono ottenere delle biopsie, che di solito sono multiple, a livello della seconda o terza porzione multiple, a livello della seconda o terza porzione del duodeno.del duodeno.Soltanto la biopsia intestinale ci permette di Soltanto la biopsia intestinale ci permette di dimostrare, attraverso l’esame istologico, la dimostrare, attraverso l’esame istologico, la presenza delle lesioni intestinali che sono alla presenza delle lesioni intestinali che sono alla base della definizione di malattia celiaca base della definizione di malattia celiaca

DIAGNOSI


DIAGNOSI

Le tecniche non invasive sono rappresentate dalla diagnostica di laboratorio

Sensitività % Sensitività % Specificita %Specificita %

AGA-IgG 69 – 85 73 – AGA-IgG 69 – 85 73 – 9090

AGA-IgA 75 – 90 82 – AGA-IgA 75 – 90 82 – 9595

EMA (IgA) 85 – 98 97 – EMA (IgA) 85 – 98 97 – 100100

TTG (IgA) 90 – 98TTG (IgA) 90 – 98 94 – 97 94 – 97

Test sierologici nella Test sierologici nella celiachiaceliachia

Sintomi1:5000

Anticorpi anti-glutine

1:500 – 1:250

Anticopri anti-endomisio1:150

Anticorpi anti-transglutaminasi

1:90

DIAGNOSIDIAGNOSIDiarreaDiarrea, Difetto di Difetto di CrescitaCrescita

Anemia, Bassa Statura

Malattie Autoimmuni

Programmi di “Case finding” Screening di Popolazione

EpidemiologiaEpidemiologia

ANTICORPI ANTI ACTINA:ANTICORPI ANTI ACTINA: nuovi marker sierologici nella nuovi marker sierologici nella

celiachiaceliachia Anticorpi Anti-Actina (A.A.A.):Anticorpi Anti-Actina (A.A.A.):

sensibilità ( 82-25%) sensibilità ( 82-25%)

specificità ( 100%)specificità ( 100%)

Valutazione Valutazione retrospettiva degli retrospettiva degli A.A.A. in sieri ( - 20°C )A.A.A. in sieri ( - 20°C )

sensibilità ( 43 %)sensibilità ( 43 %)

Type 0 Type 1 Type 2 Type 3

Marsh, Gastroenterology 1992, Vol 102: 330-354

NormalCeliac Diseae

(latent)

InfilitrativeCeliac

Giardiasis

Milk intolerance

Tropical sprue

Marasmus

GVHR

Hyper plastic

Celiac

Giardiasis

Milk intolerance

Tropical sprue

Marasmus

GVHR

Flat destructive

Celiac

Giardiasis

Milk intolerance

Tropical sprue

Marasmus

GVHR

Gli A.A.A. correlano con la lesione Gli A.A.A. correlano con la lesione istologica della mucosa intestinaleistologica della mucosa intestinale

Obiettivi:Obiettivi:

Allestire una metodica di Allestire una metodica di “immunofluorescenza indiretta“immunofluorescenza indiretta””

Misurare la riproducibilità del test

A.A.A. nella mucosa intestinale di un pz. con A.A.A. nella mucosa intestinale di un pz. con CDCD

Confrontare gli A.A.A. con gli anticorpi anti Confrontare gli A.A.A. con gli anticorpi anti Ttg nella CDTtg nella CD

Gli A.A.A. in una patologia autoimmune con Gli A.A.A. in una patologia autoimmune con danno del citoscheletro :danno del citoscheletro :la Cardiomiopatia Dilatativa Idiopaticala Cardiomiopatia Dilatativa Idiopatica

Obiettivi:Obiettivi:

Verificare il ruolo di fattori sierici leganti l’ Actina (A. B. P.) nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo

A. B. P.A. B. P. : proteine in grado di legare e di : proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare modificare la struttura molecolare dell’dell’ActinaActina..

• GelsolinGelsolinaa

• CofilinaCofilina

risultati falsamente risultati falsamente negativi negativi ••

A. B. PA. B. P. sequestrano . sequestrano l’Actinal’Actina al legame con al legame con anticorpi specificianticorpi specifici

Materiali e MetodiMateriali e Metodi

Allestimento di vetrini attivati con Allestimento di vetrini attivati con cellule cellule “Hep2”“Hep2”

TrattamentoTrattamento fisico - chimicofisico - chimico dei dei sierisieri

Lettura al microscopio a Lettura al microscopio a fluorescenzafluorescenza

Celiaci diagnosticati tra il Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 20042000 e il 2004 : :

102 (12 =3a, 102 (12 =3a,

40=3b ,40=3b ,

48=3c);48=3c);

età media : 20 a. a.;età media : 20 a. a.;

sesso: 57 f., 45 m.;sesso: 57 f., 45 m.;

Controlli : 103 donatori saniControlli : 103 donatori sani

76 soggetti malati 76 soggetti malati (Chron, Rettocoliti U.)(Chron, Rettocoliti U.)

Immunofluorescenza indiretta (IFA)Immunofluorescenza indiretta (IFA)

1 2

3IgA anti-actina su cellule “Hep2.” Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero riscaldato; 3 siero in EDTA.La positività del test è evidente nei fotogrammi 2-3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1.

Trattamento Trattamento fisico-chimico fisico-chimico dei dei sierisieri

Il pre trattamento facilita 1.l’osservazione al microscopio 2.rende il test più sensibile

1)1) Risultato: Risultato:

Pz Pz

celiaci:celiaci:

№ № =102 =102

Cntr.Cntr.

sani: sani:

№ № =103=103

Cntr.Cntr.

malati:malati:

№ № =76=76

% Positivi% Positivi

Sieri nonSieri non

Trattati Trattati (N.T.)(N.T.)

48 % 48 %

(№ :49)(№ :49)14,6 %14,6 %

(№:15)(№:15)18,4 %18,4 %

(№:14)(№:14)

Sieri Riscaldati

( R )

82,4 %82,4 % (№:84)(№:84)

24,3 %24,3 %

(№:25)(№:25)48,7 %48,7 %

(№:37)(№:37)

Sieri conE.D.T.A.

( E )

76,5 %76,5 % (№:78)(№:78)

13,5 %13,5 %

(№:14)(№:14)29 %29 %

(№:22)(№:22)

Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei tre differenti metodi di trattamento dei campioni.campioni.

sensibilitàsensibilità specificitàspecificità

Correlazione tra positività degli A.A.A. e grado di Correlazione tra positività degli A.A.A. e grado di

lesione istologica.lesione istologica.

TrattameTrattamento dei nto dei

sierisieri

Lesione Lesione 3a3a

LesionLesione 3be 3b

Lesione Lesione

3c3c

Non Non

TrattatoTrattatop = no p = no signsign..

4 4 (33.3%)(33.3%)

19 19 (47,5%(47,5%

))

2222

(45,8%)(45,8%)

RiscaldatRiscaldatoo

p = 0,039p = 0,039

88

(66,7%)(66,7%)

3131

(77,5%(77,5%))

4444

(91,7 %)(91,7 %)

Con Con EDTAEDTA

p = 0,001p = 0,001

66

(50%)(50%)

2727

(67,5%(67,5%))

4343

(89,6 (89,6 %)%)

2) 2) Risultato:Risultato:

La % di positivi è tanto maggiore quanto più grave è la lesione solo se i sieri sono pre-trattati

sensibilità

NT R E0.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.95

specificità

trattamento

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

NT R E

Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori

3)Risultato: 3)Risultato: Riproducibilità degli A.A.A.Riproducibilità degli A.A.A.

Metodica Metodica del del

trattametrattamentonto

KappKappaa

Forza di Forza di agreemenagreement Landis-t Landis-

KochKoch

RiproducibiRiproducibilitàlità

FleissFleiss

Non Non TrattatoTrattato 0,590,59 ModerataModerata BuonaBuona

TrattameTrattamentonto

FisicoFisicoO,61O,61 SostanzialSostanzial

eeBuonaBuona


ChimicoChimico0,640,64 SostanzialSostanzial

eeBuonaBuona

KappaKappa Forza della Forza della concordanzaconcordanza

< 0,00 < 0,00 PoveraPovera

0,00 – 0,0200,00 – 0,020 LieveLieve

0,21- 0,400,21- 0,40 DiscretaDiscreta

O,41-0,60O,41-0,60 ModerataModerata

0,61-0,800,61-0,80 SostanzialeSostanziale

0,81-10,81-1 Quasi perfettaQuasi perfetta

KappaKappa RiproducibilitàRiproducibilità

>0,75>0,75 EccellenteEccellente

0,40-0,740,40-0,74 BuonaBuona

0,00-0,0390,00-0,039 MarginaleMarginale

Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch

Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss

Elisa Fabbro

Elisa Fabbro

Valore predittivo positivo (VPP):Valore predittivo positivo (VPP):prob. che un individuo positivo al test abbia effettivamente la prob. che un individuo positivo al test abbia effettivamente la patologia in esamepatologia in esame

Valore predittivo negativo(VPN):Valore predittivo negativo(VPN):prob. che un individuo negativo al test NON abbia effettivamente la prob. che un individuo negativo al test NON abbia effettivamente la patologia in esamepatologia in esame


dei sieridei sieriVPPVPP VPNVPN

NonNon

TrattatoTrattato62,8 %62,8 % 74 %74 %


Chimico Chimico

(EDTA)(EDTA)

68,4 %68,4 % 85,6 %85,6 %


FisicoFisico

(CALORE(CALORE))

56 %56 % 86,7 %86,7 %

Attività inibitoria degli Attività inibitoria degli A .B. A .B. P.P.

Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina

Sequenza del test d’inibizione:Sequenza del test d’inibizione:1. Preincubazione delle cellule 1. Preincubazione delle cellule

con pool di sieri (A.A.A.-)con pool di sieri (A.A.A.-)2. Incubazione con siero di 2. Incubazione con siero di

celiaco pretrattato (A.A.A. celiaco pretrattato (A.A.A. +++)+++)

Attività inibitoria di fattori sierici (Attività inibitoria di fattori sierici (A. A. B. P.B. P.))::

L’attività inibitoria del pool (A.A.A. -) viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina g (5-10-15-20 g/ml)

Pre incubazione dello stesso pool di sieri re incubazione dello stesso pool di sieri A.A.A. - con l’Anticorpo A.A.A. - con l’Anticorpo anti anti Gelsolina Gelsolina (Sigma G4896)(Sigma G4896)

Prove di identificazione:

4 )Risultato4 )Risultato

5)Risultato:5)Risultato:Confronto Ig A anti AAA- Confronto Ig A anti AAA- anti anti tTgtTg

IgA ANTI - ACTINAIgA ANTI - ACTINA IgAIgAANTI- ANTI- tTGtTG

PZ. CELIACIPZ. CELIACI (№ :102 )(№ :102 )

NONNON

TRATTATITRATTATI

TRATTAMENTOTRATTAMENTO

FISICOFISICO

TRATTAMENTTRATTAMENTOO

CHIMICOCHIMICO 100 % 100 % (№:102)(№:102)

48 %48 %(№ :49)(№ :49)

82,4%82,4%(№:84)(№:84) 76,5 % 76,5 %

(№:78)(№:78)

CONTROLLICONTROLLIMALATIMALATI

(№ :103 )(№ :103 )

18,4 %18,4 %

(№:14)(№:14)48,7 %48,7 %(№:37)(№:37)

29%29%(№:22)(№:22)

0 %0 %(№:0)(№:0)

CONTROLLICONTROLLI SANISANI

(№ :76 )(№ :76 )14,6 %14,6 %(№:15)(№:15)

24,3 %24,3 %(№:25)(№:25)

13,5 % 13,5 % (№:14)(№:14)

0 %0 %(№:0)(№:0)

Anticorpi Anti ActinaAnticorpi Anti Actina nella mucosa intestinale nella mucosa intestinale

selezione di anticorpi specifici per

actina

30 anticorpi anti Actina

4 anticorpi anti Actina

Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di

un controllo sano

Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di

un pz. celiaco ( 3 C, A.A.A.+ nel

siero)

5)Risultato:5)Risultato: Presenza A.A.A. nella mucosa Presenza A.A.A. nella mucosa intestinale di un celiaco intestinale di un celiaco

Incubazione con anticorpi ricombinantiIncubazione con anticorpi ricombinanti

Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep 2b

Lettura al microscopio a fluorescenza

RICONFERMA DELLA POSITIVITA’:RICONFERMA DELLA POSITIVITA’:

FINGERPRINTING (P.C.R., digestione enzimatico, separazione elettroforetica)

P.M. A2 E5 G8 H7 A8 B12 C5 D7 D8 F8 H5 F2 B12 D5 E10 H6 D4 A7 D3 G6 H11 E9 F11

Caratterizzazione A.A.A.

Sequenziamento:Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido

nucleico. CLON

EVH Gene V Score CDR3

B5 VH 1 DP-14/V1-18+ 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV

B7 VH1 DP-14/V1-18+ 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV

E8 VH1 2M27/11M27... 1110 EEVRPTGDSYYTGLDV

C10 VH1 DP-14/V1-18 1164 GLGYCAGGCQVPYYALDV

H8 VH1 DP-14/V1-18 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV

C8 VH1 2M27/11M27 1092 EEVRPTGDSYYTGLDV

H10 VH5 VHVCW/COS-24 1263 HSDSYGSYYFDY

H9 VH3 COS-6/DA-8 1281 DLRRSDY

A5 VH6 DP-74/VH-VI 1236 GAPLCAL

B8 VH1 2M27/11M27 1110 EEVRPTGDSSCLV

H11 VH1 DP-14/V1-18 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV

A9 VH5 VHVCW/COS-24+ 1254 HSDSYGSYYFDY

H2 VH1 DP-14/V1-18+ 1128 GLGYCAGGCQVPYYALDV

H5 VH1 DP-14/V1-18+ 1146 GLGYCDGGCQVPYSALDV

C9 VH2 S12-10 1233 TGCSGDCSYYSYYGLDV

E10 VH3 DP-35/V3-11... 1236 GRVSGWLPFDY

A3 VH3 DP-47/V3-23.. 1182 LTSKYYHRMDV

A6 VH6 DP-74/VH-VI... 628 GSYRNTWVW

B11 VH3 V3-48/hv3d1 1218 DVHYGFDL

F9 VH1 DP-7/21-2...+ 1263 DVDGSGSFSPHSSYKYRMDV

H7 VH4 VIV-4/4.35+ 1239 YNWNDAPDGYDI

SOTTOGRUPPO DI CMPD

Patologia autoimmune organo specifica

Autoanticorpi riconoscono con lo specifico antigene

LA CARDIOMIOPATIA DILATATIVA IDIOPATICA (CMPD)patologia cronica e severa del miocardio caratterizzata patologia cronica e severa del miocardio caratterizzata

da una ridottada una ridotta

funzione contrattile dei ventricoli associata a funzione contrattile dei ventricoli associata a dilatazione delle camere cardiachedilatazione delle camere cardiache

Eziopatogenesi sconosciuta

Predisposizione genetica

Associazione con specifici alleli

HLA II

Contr. Sani:

№№=103=103

ProbanProban

di:di:

№ № =63=63

Parenti:Parenti:

№ №=84=84


59,7 % 59,7 %

(№:36)(№:36)

21,4 %21,4 %

(№:18)(№:18)

SIERSIERII


11,6 % 11,6 %

(№:12)(№:12)

6)Risultato:6)Risultato: CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova associazioneassociazione

Positività degli A.A.A. in 63 pazienti con CMPD ,in 84parenti Positività degli A.A.A. in 63 pazienti con CMPD ,in 84parenti di di

primo grado e in un gruppo di 103 controlli saniprimo grado e in un gruppo di 103 controlli sani

Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.-

giallo = probando

CMPD Famiglia & Autoimmunità

Conclusioni:Conclusioni:

Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di unaanche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di unaridotta specificità (80%)ridotta specificità (80%) TEST A.A.A. NON DEVE ESSERE UTILIZZATO NELLOTEST A.A.A. NON DEVE ESSERE UTILIZZATO NELLOSCRIINING DI CELIACHIASCRIINING DI CELIACHIA

Il dosaggio degli anticorpi anti tTg:Il dosaggio degli anticorpi anti tTg:•Sensibilità, Specificità= 98%Sensibilità, Specificità= 98%•Significativa correlazione con la gravita’ della lesione intestinaleSignificativa correlazione con la gravita’ della lesione intestinale

DOSAGGIO DELLE tTg:DOSAGGIO DELLE tTg:TEST PIU’ EFFICACE NELLA DIAGNOSI DI CELIACHIATEST PIU’ EFFICACE NELLA DIAGNOSI DI CELIACHIA

Conclusioni Conclusioni

Immunofluorescenza indiretta:test operatore-dipendente Immunofluorescenza indiretta:test operatore-dipendente

CARATTERIZZATO DA UNA BASSA RIPRODUCIBILITA’CARATTERIZZATO DA UNA BASSA RIPRODUCIBILITA’

DISPONIBILITA’ DI ANTICORPI ANTI DISPONIBILITA’ DI ANTICORPI ANTI ACTINA ISOLATI DA MUCOSA ACTINA ISOLATI DA MUCOSA INTESTINALEINTESTINALEda utilizzare controllo positivo nei test per il da utilizzare controllo positivo nei test per il dosaggio degli A.A.A.dosaggio degli A.A.A.

La Gelsolina sierica è una delle cause pricipali La Gelsolina sierica è una delle cause pricipali della bassa sensibilità del testdella bassa sensibilità del test

Obiettivi futuri:Obiettivi futuri:

Comprendere i meccanismi patogenetici alla baseComprendere i meccanismi patogenetici alla base

dell’associazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitrodell’associazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitro

Studi prospettici per comprendere il Studi prospettici per comprendere il ruolo predittivo degli A.A.A. in ruolo predittivo degli A.A.A. in familiari dei soggetti con CMPDfamiliari dei soggetti con CMPD

Verificare il ruolo degli A.A.A. nella patogenesiVerificare il ruolo degli A.A.A. nella patogenesi

del danno intestinale della CD del danno intestinale della CD

Available online at www.sciencedirect.comClinica Chimica Acta 390 (2008) 134–137

Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease screeningscreening

Elisa FabbroElisa Fabbro, Laura Rubert, Sara Quaglia, Fortunato Ferrara,Valentina Kiren,Tarcisio Not

Department of Reproductive and Development Science, University of Trieste and I.R.C.CS“Burlo Garofolo”Trieste,ItalyReceived 20 November 2007 ;received in revised form 15 January 2008; accepted 15 January 2008

www.elsevier.com/locate/clinchim

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