ACC Programma 3. Trasferimento delle conoscenze allo sviluppo di interventi volti a prevenire,...

ACC Programma 3.

Trasferimento delle conoscenze allo sviluppo di interventi volti a prevenire, diagnosticare e

trattare il cancro.

Progetto Terapie Biologiche combinate e personalizzate nei

tumori solidiCoordinatore: Giorgio Parmiani,

Istituto Scientifico San Raffaele, Milano

Partecipanti

• Gruppi di Ricerca Afferenti (HSR):

• Unità di Immuno-Bioterapia del Melanoma e dei Tumori Solidi (G. Parmiani);

• Unità di Medicina Nucleare (F. Fazio);

• Unità di Biologia dei Tumori e Targeting Vascolare (A. Corti);

• Unità di Immunologia Sperimentale (P. Dellabona).

Gruppi di Ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca

• Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milano (RS. Licia Rivoltini):

• UOC Immunoterapia Oncologica, Azienda Ospedaliera Universitaria, Siena (R.S. Michele Maio);

• Laboratorio di Immunoterapia Sperimentale, ISS, Roma (R.S. Maria Ferrantini);

• Laboratorio di Ricerche in Immunologia e Infiammazione, Istituto Clinico Humanitas, Milano (R.S. Cecilia Garlanda).

Destinatari Istituzionali Partecipanti

• Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro (Genova) IRCCS (R.S. Paola Queirolo);

• Istituto Oncologico Veneto IRCCS, Padova (RS. Paola Zanovello)

Obiettivi e Razionale

• Il progetto è basato sull’attivazione di studi clinici di combinazione tra farmaci biologici e vaccinazione con peptidi antigenici, oltre a studi associati o paralleli di laboratorio destinati: 1) a migliorare le conoscenze sui meccanismi alla base della combinazione proposta; 2) al monitoraggio immuno/biologico dei pazienti; c) a valutare polimorfismi di geni che possono influire sulla risposta al trattamento.

Risultati del primo anno di attività.Studi pre-clinici

• Unità di Immunologia Sperimentale HSR (P. Dellabona).

• Obbiettivi: a) identificazione di epitopi della proteina survivina (SVV) riconosciuti da linfociti T; b) l’utilizzo di questi peptidi per lo studio della risposta in pazienti con tumori esprimenti SVV; c) utilizzo di epitopi SVV in protocolli di vaccinazione antitumorale.

Risultati e conclusione del primo anno di attività.Studi pre-clinici

• Sono state identificate 9 sequenze di SVV e sintetizzati i peptidi sintetici corrispondenti.

• I peptidi sono stati utilizzati in vitro per stimolare, in colture a breve termine, linfociti T CD4+ isolati dal sangue di 7 soggetti normali e 7 pazienti con melanoma metastatico.

• Linfociti CD4 di 2/7 pazienti e 4/7 donatori hanno risposto. Nel caso dei pazienti con melanoma la reattività anti-SVV dei linfociti T CD4+ appare quindi ridotta rispetto a quella dei soggetti sani.


• Unità di Biologia dei Tumori e Targeting Vascolare HSR (A. Corti);

• Obbiettivo: Verificare se la combinazione di NGR-TNF con vaccinazione può indurre, in modelli animali, una più forte e duratura risposta immune e una migliore risposta clinica in confronto alla sola vaccinazione .

TNFNGR-TNF

CNGRCG peptide

Targeted delivery of TNF to tumor vasculatureby coupling with the NGR-peptide

(a ligand of CD13 expressed by angiogenic vessel)

Curnis et al., Nat. Biotechnol., 2000

The antitumor activity of NGR-TNF is >10 times greater than that of TNFin several mouse models

Sacchi et al., Clin. Cancer Res. 2006


• I risultati del primo anno indicano che basse dosi di NGR-TNF possono indurre, in maniera più efficiente e persistente del solo TNF, il rilascio di varie citochine e chemochine (IL-2, IL-6, IP-10, lymphotactin, MCP-1, MIP-1beta, oncostatin M, TIMP-1).

• Esperimenti sono in corso in modelli animali per testare in contesto terapeutico la risposta alla combinazione tra NGR-TNF+vaccino peptidico.


• UOC Immunoterapia Oncologica, Azienda Ospedaliera Universitaria, Siena (Michele Maio)

• Obbiettivo: verificare se cellule di melanoma esprimono antigeni di tipo Cancer Testis (CTA) quali MAGE e NY-ESO1, e se la loro espressione correla con uno stato de-metilato dei rispettivi promotori.

Regulation of CTA expression in human melanoma xenografts by 5-AZA-CdR

Xenografts

Mel 275 Mel 313 Mel 195

5-AZA-CdR - + - + - +

MAGE-1 - -

MAGE-2 - -

MAGE-3 -

MAGE-4 - - -

MAGE-A10 - -

GAGE 1-6 -

NY-ESO-1 - - -

PRAME -

Recognition of Mel313 clones by a MAGE-3-specific HLA-B37-restricted CTL clone

8,292

124,688

251,218218,05

-50

50

150

250

350

313#5 313#14

IFN

(pg

/ml)

B37

B37 5-AZA-CdR

Conclusioni

• La valutazione degli effetti sinergici fra 5-AZA-CdR sulla immuno-modulazione del melanoma ha mostrato che il trattamento in vitro e in vivo porta ad un aumento di 2-4 volte nei livelli di espressione di diversi CTA (es. MAGE-3, NY-ESO-1).

• Indurre aumento di espressione di CTA nei pazienti (?)


• Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milano (Licia Rivoltini).

• Obbiettivo: Studio delle cellule immunosoppressive (T regolatorie e mieloidi) nei pazienti con melanoma.

Myeloid suppressor cellsMyeloid suppressor cells are increased are increased

in peripheral blood of stage II-III melanoma patientsin peripheral blood of stage II-III melanoma patients

0

5

10

15

20

% C

D1

4+C

D1

1b

+H

LA-D

R-/

lo

STAGE IIB-IIIC

STAGE IVHD

MELANOMA

p<0-01

p<0.01

N=40

N=40

N=30

Increased frequency of CD4+CD25Foxp3+ Tregis a late event in melanoma patients

HD

Stage

I IB-I

IC

Stage

I IIA

-II IC

Stage

IV0

5

10

15

%C

D4

+C

D25

hig

hFo

xp3

+n.s.

p= 0.0002

p=0.04

p= 0.002

% C

D4

+C

D25

hig

hFo

xP3

+ c

ells

(gate

d

on lym

phocy

tes)

Monitoring T regs : no major effect of low-dose Monitoring T regs : no major effect of low-dose cyclophosphamide on the frequency of CD4cyclophosphamide on the frequency of CD4++CD25CD25highhighFoxp3Foxp3++

0

2

4

6

8

10

HD P0 P1 P4

10

8

6

4

2

0

VACCINATION ARMVACCINATION ARM

cyclophosphamide

300mg/m2 3-5 days before vaccination

IIB-IIIC HIGH RISK MELANOMA PATIENTS

cyclophosphamide

Conclusioni

1.1. Myeloid suppressor cells are increasedMyeloid suppressor cells are increasedin the peripheral blood of stage II-III in the peripheral blood of stage II-III

melanoma patientsmelanoma patients

2. Increased frequency of CD4+CD25FoxP3+ Tregs is a late event in melanoma patients

3.3. No major effect of low-dose No major effect of low-dose cyclophosphamidecyclophosphamide on the frequency of on the frequency of

CD4+CD25+Foxp3+CD4+CD25+Foxp3+


• Laboratorio di Ricerche in Immunologia e Infiammazione, Istituto Clinico Humanitas, Milano (Cecilia Garlanda).

• Obbiettivo: Trasferimento clinico delle conoscenze sulle molecole infiammatorie da utilizzarsi quali potenziali biomarcatori diagnostici/prognostici delle terapie anti-tumorali.

• La pentraxina lunga PTX3, proteina di fase acuta, è espressa nella risposta infiammatoria e svolge il duplice ruolo di difesa contro i patogeni e di proteina strutturale della matrice extra-cellulare.

• Valutare le potenzialità diagnostiche di PTX3 sullo stato infiammatorio del paziente alla diagnosi e durante la terapia, e come marcatore di rischio di infezioni opportunistiche.

PTX3 expression of liposarcoma specimen and

corresponding normal fat tissue

Normal fat tissue Pleomorphic liposarcoma

MCA203 (5x105 c/mice)

0

1

2

3

4

10 15 20 25 30 35 40

days post injection

tum

or

volu

me

(cm

3)

WT

PTX3-/-

Potential role of PTX3 in the control of tumor growth and metastatic potential:Increased tumor growth in absence of PTX3 in two different models of murine

fibrosarcoma

MN/MCA1: non immunogenic and metastasic fibrosarcoma

MN/MCA1 (105cell/mice)

02468

10

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

days post injection

tum

or v

olum

e (c

m3) WT

PTX3 -/-

*

**

** *

*

**

**

******

*

MCA203:immunogenic and non metastasic fibrosarcoma

Conclusione

• Identificazione di forme tumorali producenti PTX3: liposarcomi, condrosarcomi, gliomi.

• Ruolo potenziale di PTX3 nel controllo della crescita tumorale e della metastatizzazione.


• Laboratorio di Immunoterapia Sperimentale, ISS (Roma) (Maria Ferrantini )

• Obiettivo: Identificazione di biomarcatori genetici predittivi della risposta biologica e clinica ai diversi protocolli di vaccinazione sperimentati nel corso degli studi clinici di questo progetto.

• Metodica: Strategie basate sul microarray verranno utilizzate per valutare l’esistenza di possibili correlazioni tra la risposta clinica e/o immunologica indotta dai vaccini e la presenza nel DNA dei pazienti di specifici polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in geni codificanti citochine e proteine ad esse correlate.


• Istituto Oncologico Veneto IRCCS, Padova (Paola Zanovello)

• Obbiettivo: Studio pre-clinico della immunogenicità di hTERT, un antigene da utilizzarsi in studi clinici.

• E’ stata valutata la immunogenicità di diversi epitopi di h-TERT presentati in associazione alla molecola HLA-A*0201, e la generazione di linee e/o cloni di linfociti T CD8 specifici per questo antigene.

• A tale scopo sono stati immunizzati topi transgenici HLA-A*0201 (topi HHD) con hTERT impiegando diversi protocolli. Per ciascuna delle modalità di immunizzazione è stata condotta una valutazione ex vivo mediante ELISPOT.

Num

ber

of S

pots

of

0.5x

106 C

D8+

0

50

100

150

200

250

Vaccinated withh-TERT

peptide-30

No Vaccianted

peptide-540

peptide-865

peptide-Neu

peptide-30

peptide-540

peptide-865

peptide-Neu

CD8+ T cells induced by im DNA vaccination and electroporation in HHD-mice

KILLED

14 days

DNA DNA

14 days

KILLED

14 days14 days

DNADNA DNA

14 days14 dayscontrol

HHD mice showed strong reactivity against epitopes R30 and R865

Cytotoxic activity of T cells obtained after several cycles of in vitro re-stimulation was measured against a panel of HLA-A2 human tumor cell lines

MLPC from HHD mice vaccinated with hTERTstimulated with peptide-865

Effector : Target cells ratio

100:1 33:1 11:1 3:1

% C

r51

rele

sed

0

20

40

60

80

100

MLPC from HHD mice vaccinated with hTERTstimulated with peptide-30

Effector : Target cells ratio

100:1 33:1 11:1 3:1

% C

r51

rele

sed

0

20

40

60

80

100

293A2-p865 293A2-p30 293A2-pNeu SW480 SK-OV-3 U266 LnCap

nine restimulations of CD8 T cells from hTERT immunized HHD mice with -irradiated and peptide pulsed splenocytes

Conclusioni

I risultati ottenuti non hanno dimostrato significative differenze fra i diversi protocolli utilizzati per immunizzare.

La fase di valutazione pre-clinica è stata completata studiando la capacità di riconoscere in vivo in topi Rag2(-/-) una linea tumorale umana di ca della prostata da parte delle linee T CD8 specifiche per l'epitopo R865 o per l'epitopo R30.

Obiettivi cliniciTre studi clinici sono proposti: Uno coordinato dall’Unità di IST di Genova: Studio di

fase I-II di vaccinazione con oncolisato cellulare di melanoma autologo associato ad IFN-α2b in pazienti con melanoma metastatico;

Due coordinati da HSR (Milano) e comprendenti, a) Studio di fase II randomizzato di IFN-α2b ad alte dosi per un mese in combinazione con vaccino peptidico in pazienti con melanoma metastatico (M1a/b); b) Studio di fase I-II di combinazione di NGR/TNF (anti-angiogenico MolMed) e vaccino peptidico in pazienti con melanoma o carcinoma del colon.

Risultati del primo anno di attività.Studi clinici

• Istituto per lo Studio e la Cura dei Tumori IRCCS Genova (Paola Queirolo)

• Obbiettivo: Attivare il protocollo clinico. Nel corso del primo anno l’Oncologia Medica A e il Laboratorio di Terapia Immunologica dell’IST si sono occupati della stesura del protocollo dello studio clinico.

• La preparazione del vaccino avverrà in regime di GMP presso il centro di biotecnologie avanzate dell’IST.

•


• Il documento riassuntivo di tale protocollo era stato oggetto di una pre-audizione presso l’ISS/AIFA che ha suggerito alcune revisioni. Attualmente è stata redatta una versione rivista del protocollo che è in fase di sottomissione all’ISS.

• Inoltre sono state preparate le istruzioni operative inerenti al processo di preparazione del vaccino ed è stata ultimata la stesura del Technology Transfer Report.

• Il ritardo nella ri-sottomissione del protocollo è legato alla necessità di eseguire adeguamenti strutturali del laboratorio GMP dell’IST, sulla base della normativa vigente. Infatti tale struttura non è ancora stata approvata e verrà valutata nel corso della site-visit ministeriale per questo protocollo.

Conclusione

• Nel corso del primo anno i gruppi IST hanno svolto una preziosa attività di preparazione della struttura GMP che si intende utilizzare, ridefinito il protocollo e iniziato uno studio delle possibili reazioni allergiche che possono comparire in pazienti trattati con alte dosi di IFNα2a.


Unità di Immuno-Bioterapia dei Tumori Solidi, HSR (G. Parmiani)

Obbiettivo: Iniziare le procedure per attivare due studi clinici.

1. Studio di fase II randomizzato di IFN-α2b ad alte dosi in combinazione con vaccino peptidico in pazienti con melanoma metastatico (M1a/b);

2. Studio di fase I-II di combinazione di NGR/TNF (anti-angiogenico MolMed) e vaccino peptidico in pazienti con melanoma o carcinoma del colon.


• L’attivazione degli studi è stata bloccata dalla repentina impossibilità di utilizzare peptidi per questi protocolli in Europa (gennaio 2008).

• Dopo un anno di discussione con diverse industrie Biotech e i colleghi europei interessati, si è finalmente arrivati a poter utilizzare nuovi peptidi, acquistati in forma consortile per renderne il costo compatibile con i finanziamenti. I peptidi saranno disponibili entro aprile 2009.

• .


• Tuttavia il costo costringe a ridurre da 4 a 2 il numero di peptidi vaccinali che verranno inoculati nei pazienti. Le due industrie interessate agli studi (ma non sponsors) confermano la possibilità di fornire gratuitamente i farmaci da combinare col vaccino (IFN-α2b e NGR/TNF).

• Ciò ha costretto a rivedere in parte i protocolli che verranno presentati alle autorità regolatorie entro marzo/aprile 2009.

Conclusioni generali dopo il primo anno di attività

• Due incontri si sono tenuti per l’avvio e la verifica dei programmi in corso con la partecipazione delle Unità coinvolte.

• Nuove informazioni sono state ottenute a livellopre-clinico per migliorare il disegno degli studi clinici di combinazione immuno-bioterapia.

• I protocolli clinici previsti potranno iniziare il reclutamento dei pazienti entro giugno 2009.

Adoptive-Transfer of mTERT-specific CTLs in TRAMP mice

causes reduction of peripheral blood lymphocytes

Autoimmunity side effect ?

0

1

2

3

4

5

6

7

8

WBC x10E03/µL RBC 10E06/µL

β-Gal T cells

mTERT T cells

0

1

2

3

4

5

NEUT10E03/µL LYM 10E03/µL MONO 10E03/µL

β-Gal T cells

mTERT T cells

*

**

*Student t test P=0.0002 **Student t test P=0.00002

Effects of low dose cyclophosphamide and IL-2 onEffects of low dose cyclophosphamide and IL-2 on

CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in PBMCCD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in PBMC

CTX1

CTX2

SurgeryIL-2

V1 V2V3 V5

% FoxP3+CD25+ in CD4+ T cells

V0

p0

p1

p2

p4

p6

0

10

20

30

40

50

0

2

4

6

8

10

N.

IFN

S

pots

2x1

05 C

D8

+ %C

D4

+CD

25

hig

hFoxp3

+

p0

p1

p2

p4

p6

follo

w-u

p (

6m

)

follo

w-u

p (

12

m)0

50

100

150

200

0

1

2

3

4

5

N.

IFN

S

pots

2x1

05 C

D8

+ %C

D4

+CD

25

hig

hFoxp3

+

INT-001 INT-004

Ex vivo recognition of Mart-1 peptide (by IFNEx vivo recognition of Mart-1 peptide (by IFNγγ ELISpot) and ELISpot) and

Treg frequency in vaccinated melanoma patientsTreg frequency in vaccinated melanoma patients

0

1

2

3

4

5

6

7

HDN=10

Prostate carcinoma

withbiochemicalrecurrence

N=22

Metastaticprostate

carcinomaN=6

%C

D4+

CD

25

hig

hFo

xp3+

in

G1

Low frequency of Treg cells in prostate carcinoma patients with biochemical

recurrence:Tregs frequency may depend on tumor

burden

n.s.

p<0.01

Potenziale diagnostico di PTX3 in patologia neoplastica

Cecilia Garlanda

Laboratorio di Ricerche di Immunologia

Istituto Clinico Humanitas, Rozzano, Milano.

PTX3: a multifunctional soluble Pattern Recognition Receptor

(Garlanda C. et al. Ann. Rev. Immunol. 2005)

Diagnostic potential of PTX3 in human pathology

• Hischemic heart disease and heart failure (Circulation 2000, 2004)

• Sepsis (Mueller et al. Crit. Care Med. 2001)

• Small vessel vasculitis (Arthritis Rheum 2001, 2006)

• Atherosclerosis (Rolph et al. Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.2002)

• RA (Lucchetti et al. Clin. Exp. Immunol. 2000)

• Infections: TBC, Dengue (Microbes Infect. 2005, J med

virol.2005)

• Preeclampsia (Am J Obstet Gynecol. 2006;194:1347-53; Obstet Gynecol.

2006;108: 148-55)

• Preterm delivery (B.J.Ob.Gy. 2007)

293A2p865

IFN

- r

elea

sed

(p

g/m

l)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

hTERT865-CTLs

hTERT30-CTLs

293A2p30

293A2pNeu

SW480 SK-OV-3 U266 LnCap

Functional characterization of hTERT 865 and hTERT30-specific CD8 T cells obtained from

HHD vaccinated mice

T cells

T cells

nine restimulations of CD8 T cells from hTERT immunized HHD mice with -irradiated and peptide pulsed splenocytes

Clone

Levels of MAGE-3 mRNA expressed by different single cell clones from Mel 313

melanoma cell line

1

3

5

7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Mel 313cell line

MA

GE

-3 m

ol/

-act

in m

ol (

x10

-3)

0

4x10-3

8x10-3

1,2x10-2

1,6x10-2

0

1x10-3

2x10-3

3x10-3

Up-regulation of MAGE-3 expression in single cell clones from Mel 313 cells by 5-AZA-CdR

Clone 5 Clone 14

MA

GE

-3 m

ol/

-act

in m

ol

Persistency of 5-AZA-CdR-induced CTA expression in human melanoma xenografts

0,0E+00

3,0E-04

6,0E-04

9,0E-04

1,2E-03

5 10 20 30

NY

-ES

O-1

mo

l/-

ac

tin

mo

l

CELLULAR SOURCES OF PTX3

MATRIXDEPOSITION

Mø myeloidDC

fibroblasts adipocytes mesangial cellsSMC

endothelium granulosacells

FERTILITY

PTX3

TLR AGONISTS(e.g. LPS)

PRIMARY INFLAMMATORYCYTOKINES (IL-1, TNF)

IL-10OXIDIZED

LDL

GDF9FSH, cAMP, EGF

(+ oocyte)

INNATEIMMUNITY

Resistance to A. fumigatus,P. brasiliensis,P. aeruginosa,

K. pneumoniae,CMV

…

(Garlanda Bottazzi and Mantovani Annu Rev Immunol 2005; Bottazzi

Curr Op Immunol 2006)

Tuninginflammation

PMN

Valutazione dei livelli serici di PTX3 in diverse forme tumorali

-Trovata in liposarcoma, condrosarcoma, glioma, carcinoma ovarico, polmonare e mammario, AML, ALL (Willeke et al. Eur J Cancer, 2006)

SCOPO:Valutare le potenzialità diagnostiche di PTX3 sullo stato infiammatorio del paziente alla diagnosi e durante la terapia, e come marcatore di rischio di infezioni opportuniste.

Obiettivi (1)

Sulla base di studi pre-clinici già condotti o da condurre nell’ambito del programma, identificare i potenziali meccanismi di sinergia anti-tumorale per combinare due o più agenti terapeutici di cui almeno uno di tipo biologico in protocolli clinici di fase I-II.

PTX3 deficiency is associated with increased tumor growth and metastatic potential

Mice were sacrificed at 32 days after s.c. injection with MN/MCA1 fibrosarcoma (10*5 cell/mice)

WT PTX3 -/-0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5Primary tumor weight

tum

or

we

igh

t (g

r)

WT PTX3 -/-0

50

100

150

200

250

0.0224

*

P value

Lung metastasis volume (mm3)

met

asta

sis

volu

me

(mm

3 )

WT PTX3 -/-0

25

50

75

0.0106 P value

**

Number of lung metastasis

n°o

f lu

ng

met

asta

sis

Conclusioni

• Al momento, oltre a numerosi ulteriori tentativi di messa a punto di un protocollo efficace per l’utilizzo dei vetrini di microarray prodotti “in house”, il gruppo sta valutando la possibilità di procedere con l’acquisto di una diversa piattaforma di microarray commercialmente disponibile.

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