5_ tos sistemica

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Rapporto No.: 2010/07 SAM Versione: Italiano Pagina 31 di 42 Data di stampa: 19/02/2010

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Rapporto di Sperimentazione SAM2010/07.A4

TOSSICITA’ SISTEMICA

RICERCATORE PRINCIPALE: P. CONSONNI

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PROCEDURA SPERIMENTALE

1. SISTEMA DI SAGGIO

1.1 Caratterizzazione Specie: ratti Razza: New Zealand N°: 4 Sesso: femmine giovani adulte nullipare e non gravide Ceppo: CBA/Ca o CBA/J 1.2 Alloggiamento

Gli animali vanno posti in gabbie singole. La temperatura dello stabulario deve essere mantenuta a 22°C /± 3°C). L’illuminazione è artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Le registrazioni sono conservate negli archivi Biolab S.p.A.

1.3 Pulizia e disinfezione

Sebbene l’umidità relativa debba raggiungere almeno il 30% e preferibilmente non superare il 70%, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, occorre mantenere un valore del 50-60%.

1.4 Alimentazione

Gli animali sono stati alimentati con dieta pellettizzata standard della ditta Harlan Italy.

1.5 Abbeverazione

Gli animali sono stati abbeverati con acqua purificata disponibile ad libitum e distribuita mediante sistema di abbeverazione automatico.

1.6 Identificazione degli animali

Gli animali selezionati per lo studio sono stati identificati da un contrassegno numerato di plastica applicato all'orecchio destro. Le gabbie sono state identificate con un cartellino.

1.7 Quarantena

Gli animali acquistati, prima di essere utilizzati per questo studio, sono stati tenuti in quarantena per una settimana. Durante il periodo di quarantena essi sono stati osservati giornalmente. Al

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termine del periodo di quarantena essi hanno subito un accurato esame per verificare la loro idoneità allo studio.

1.8 Selezione degli animali

Gli animali utilizzati nello studio sono stati selezionati a caso tra quelli idonei disponibili al momento dello studio.

2. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI SAGGIO

La sostanza in esame è stata utilizzata tal quale.

3. DISEGNO SPERIMENTALE

Ogni saggio comprende 3 animali, sui quali si saggiano 3 concentrazioni della sostanza, più un gruppo di controllo negativo trattato solo con il veicolo per la sostanza e, ove pertinente, un controllo positivo. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Il veicolo selezionato con l’obiettivo di massimizzare le concentrazioni sperimentali e la solubilità produce al contempo una soluzione/sospensione adatta all’applicazione della sostanza di prova; il veicolo utilizzato è olio di oliva (4:1 v/v). Il protocollo sperimentale del saggio è il seguente:

Giorno 1:

Identificare e registrare il peso di ciascun animale singolarmente. Cominciare con l’applicazione di 25 µl della diluizione appropriata della sostanza sperimentale del solo veicolo o del controllo positivo (pertinente) sulla parte posteriore di entrambe le orecchie.

Giorni 2 e 3:

Ripetere la procedura di applicazione eseguita il giorno 1.

Giorni 4 e 5:

Nessun trattamento.

Giorno 6:

Registrare il peso di ciascun animale. Iniettare 250 µl di soluzione salina tampone fosfato (PBS) contenente 20 µCi di H-metil-timidina a tutti i topi trattati e di controllo, attraverso la vena caudale.

Cinque ore dopo, gli animali sono soppressi. I linfonodi auricolari drenanti di entrambe le

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orecchie vengono asportati e posti in soluzione salina tampone fosfato raggruppati per gruppo sperimentale (sistema del gruppo di trattamento) per un’analisi cistologica.

4. TRATTAMENTO

4.1 Preparazione

Mediante delicata disaggregazione meccanica attraverso una rete di acciaio inossidabile con maglie da 200 µm si prepara una singola sospensione cellulare di cellule linfonodali, provenienti dai gruppi di trattamento. Le cellule linfonodali sono lavate due volte con abbondante PBS e precipitate con acido tricloro-acetico al 5% a 4°C per 18 ore. I granuli sono poi rimessi in sospensione in 1 ml di TCA.

4.2 Applicazione

Escludendo gli effetti 0 e 100%, si rappresentano su carta log-probit le percentuali di organismi immobilizzati in funzione delle corrispondenti concentrazioni. Si traccia la retta che meglio approssima i punti ottenuti privilegiando quelli compresi tra 40 e 60% di effetto. A questo punto si legge sulla retta tracciata a quale concentrazione corrisponde l’effetto tossico atteso (EC50 o EC20 corrispondenti al 50 e 20% degli individui inibiti).

La verifica delle condizioni sperimentali va effettuata ricorrendo a tre composti di riferimento: sodio laurilsolfato, bicromato di potassio e solfato di rame, ottenendo i seguenti risultati:

- 24h EC50 per il sodio laurilsolfato inferiore a 30 mg/L;

- 24h EC50 per K2Cr2O7 inferiore a 25 mg/L;

- 24h EC50 per CuSO4 · 5 H2O inferiore a 6,5 mg/L.

I composti da analizzare sono stati incubati in duplicato in miniprovette Matrix MultiScreen (Matrix Technologies, Hudson, NH) con microsomi epatici (Xenotech, Lenexa, KS) per la misurazione della cinetica di eliminazione di primo ordine. Ciascun test è stato eseguito in tampone potassio fosfato 50 mM, pH 7,4, e NADPH 2,5 mM. I composti sono stati testati ad una concentrazione finale di 1,0 µM. La concentrazione delle proteine nella miscela di reazione è stata di 1 mg/mL. I composti sono stati pre-incubati per 5 min a 37°C, e le reazioni metaboliche sono state attivate con l'aggiunta del NADPH. Dalla miscela di incubazione sono state rimosse aliquote di 80 µL a 0, 3, 6, 10, 15, 20, 40 e 60 min dopo l'inizio della reazione per la raccolta dei dati di caratterizzazione, oppure a 0 e 30 min dopo l'inizio della reazione per la raccolta dei dati di screening. Ciascuna aliquota è stata aggiunta a 160 µL di acetonitrile per l'estrazione mediante precipitazione delle proteine.

Questi campioni sono stati miscelati per 1 min mediante vortex, e un volume della miscela è

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stato filtrato attraverso i pozzetti di piastre con filtri in fibra di vetro da 0,25 mm tramite centrifugazione a 3000 rpm per 5 min. Gli estratti dei campioni sono stati analizzati mediante LC-MS-MS per determinare i livelli di composto di origine. La percentuale di perdita del composto di origine è stata calcolata dall'area del picco a ciascun punto cinetico per determinare l'emivita (t1/2, min) dei composti testati.

L'analisi dei campioni è stata condotta tramite LC-MS-MS. Le piastre di incubazione sono state trasferite off-line per l'analisi quantitativa.

La cromatografia HPLC è stata effettuata su uno strumento Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania).

Il sistema è stato interfacciato con un liquid handler Gilson 215 e con un attuatore Gilson con 819 valvole di iniezione (Gilson, Inc., Middleton, WI) per l'iniezione dei campioni nella colonna in fase inversa. Per le condizioni di gradiente della HPLC sono state usate la fase mobile A, con acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua, e la fase mobile B, con acido formico allo 0,1% (v/v) in acetonitrile.

La cromatografia dei campioni raccolti per i test di permeabilità e di legame alle proteine è stata eseguita su colonne Polaris C18 (30 x 2 mm d.i., 5 µm; Varian, Walnut Creek, CA) con una velocità di flusso di 0,4 mL/min e volumi di iniezione di 10 µL. Le condizioni del gradiente sono state variate in modo da gestire tutti i vari composti.

La spettrometria di massa di questi campioni è stata eseguita con uno strumento Waters Micromass Quattro micro con ionizzazione elettrospray in condizioni di MRM (multireaction monitoring) o SRM (selected reaction monitoring) per l'ottenimento della maggiore sensibilità possibile.

La cromatografia dei campioni sottoposti ai test di stabilità metabolica con microsomi epatici è stata condotta con volumi di iniezione di 10 µL, tipicamente in colonne Zorbax SB C8-A (30 x 3,6 mm d.i., 3,5 µm; Phenomenex, Torrance, CA) o Polaris C18 (20 x 2 mm d.i., 5 µm; Varian, Walnut Creek, CA) con una velocità di flusso di 1,5 mL/min, oppure in colonne Aquasil C18 (30 x 2 mm d.i., 3 µm; ThermoHypersil, Keystone, PA) con una velocità di flusso di 0,5 mL/min. La spettrometria di massa è stata in generale eseguita in modalità positiva con un Waters Micromass Quattro Ultima (Waters Corp., Milford, MA). Le metodiche di MS per i composti analizzati sono state sviluppate automaticamente con il software MassLynx (Versione 4.0) con QuanOptimize, che ha selezionato i migliori ioni precursore e prodotto (ESI+, ESI-) ed ha ottimizzato il voltaggio di cono e l'energia di collisione per le condizioni di monitoraggio multiplo delle reazioni (MRM). I composti che non erano adeguati a questo metodo sono stati analizzati con la ionizzazione chimica a pressione atmosferica in condizioni SRM.

Come piattaforma di automazione è stata usata una workstation Tecan Genesis 150 (Tecan

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US, Durham, NC) programmata con il software Gemini (Versione 4.0). Questo robot ha un braccio di manipolazione dei liquidi (LiHa) e un braccio di manipolazione robotica (RoMa), ed è stato integrato con un lettore multifunzione di piastre microtiter Tecan Genios Pro utilizzando il software Magellan (Versione 4.00). Le procedure per la manipolazione dei liquidi, la manipolazione delle piastre e l'incubazione sono state scritte su misura per la procedura. Questo test ha misurato la IC50 dei composti testati necessaria per inibire le isoforme degli enzimi epatici metabolizzanti degli xenobiotici CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 e 3°4. Otto concentrazioni (0,01-30 µM in intervalli semilogaritmici) di ciascun composto analizzato sono state testate in KPO4 200 mM, NADP+ 1,3 mM, glucosio-6-fosfato 3,3 mM, MgCl2 3,3 mM e 0,4 unità/mL di glucosio-6-fosfato deidrogenasi. I composti di test che erano stati precedentemente disciolti in acetonitrile sono stati diluiti separatamente in tampone di test. Aliquote in duplicato da 100 µL dei composti di test diluiti sono state erogate in piastre da 96 pozzetti Falcon Microtest (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e le piastre sono state pre-incubate per almeno 10 min a 37 °C. A ciascun pozzetto è stato quindi aggiunto un volume di isoforme umane ricombinanti di CYP (Supersomes, BD Gentest, Woburn, MA; 2,5-15,0 pmol/mL) e di substrato (1,5-75 µM). La reazione è stata incubata per 15-45 min a 37°C. Con ciascuna piastra di test sono state valutate in parallelo le curve di inibizione standard usando inibitori di riferimento specifici per il test (BD Gentest, Woburn, MA). La reazione è stata bloccata con l'aggiunta di 75 µL di aceto nitrile 80%/Tris base 0,5 M 20%. La piastra di test è stata letta con il lettore di fluorescenza per piastre alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione specifiche per il prodotto.

Tutti i test di tossicità cellulare sono stati condotti con la linea cellulare di epatociti ACTI V- Tox (Amphioxus Cell Technologies, Houston, TX). Dopo l'arrivo delle piastre cellulari dalla Amphioxus Cell Technologies, le cellule sono state acclimatate a 37°C ed è stato sostituito il terreno nei pozzetti. Dopo un'incubazione di 24 ore a 37°C in un'atmosfera di 37°C al 5% di CO2 e con un'umidità relativa del 90%, i composti da testare sono stati incubati con le cellule per 24-48 ore, a dipendenza delle particolari condizioni di analisi.

Il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), l'inibizione della proliferazione cellulare, la deplezione cellulare di adenosina trifosfato e l'attivazione delle caspasi sono stati determinati usando i kit commerciali (rispettivamente CytoTox96, CellTiter 96, CellTiter-Glo e Apo-ONE, Promega Corp., Madison, WI) forniti con le cellule. Il tracciamento dei composti e l'analisi dei dati sono stati effettuati con ActivityBase Versione 5.2.2.49 (ID Business Solutions, Guilford, GB) che integrava il software XLFit (versione 4.1.1) per la processazione delle worklist del dispensario dei composti e dei dati dei file di output generati dagli strumenti.

5. OSSERVAZIONI Gli animali sono osservati attentamente una volta al giorno per individuare eventuali segni clinici

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di tossicità sistemica. Non sono stati osservate risposte dolorose. Si è valutata la stabilità metabolica con microsomi epatici mediante le metodiche in cinetica e a tempo fisso nella valutazione della stabilità metabolica con microsomi epatici, espressa come emivita dell'eliminazione di primo ordine del composto di origine da misurazioni in duplicato:

Fegato di topo Emivita misurata con i microsomi (min) Incubazione in cinetica Incubazione a tempo fisso

Ratto 1 3 4 Ratto 2 13 18 Ratto 3 20 29 Ratto 4 1 0

RISULTATI Nessun sintomo riscontrato dopo 72 ore dall’inoculazione. Non e’ stata riscontrata alcuna patologia macroscopica durante l’esame post-mortem. Il metodo di valutazione è stato progettato per misurare la percentuale di composto originario residuo con un'unica determinazione temporale per lo screening rapido o in cinetica per la caratterizzazione di follow-up. Dai dati risulta una bassa stabilità metabolica o una breve emivita, che suggeriscono la rapida eliminazione epatica e quindi la scarsa tossicità sistemica in vivo.

CONCLUSIONI

Sulla base dei risultati ottenuti la sostanza in esame deve essere considerata NON TOSSICA SISTEMICAMENTE.

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