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Chimica Analitica
TEORIA DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE
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Componenti degli strumenti per spettroscopia ottica
� sorgente stabile di energia radiante
� selettore di lunghezze d’onda che isola una regione limitata dello
spettro per la misura
� uno o più contenitori per il campione
� un rivelatore di radiazione che converte l’energia radiante in un
segnale misurabile (generalmente di natura elettrica)
� un processore ed un registratore del segnale che mostra il segnale
trasdotto su una scala metrica, un oscilloscopio, un display digitale o
la carta di un registratore
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Sorgenti di radiazione
Per essere adatta a studi spettroscopici, una sorgente deve generare
radiazioni di potenza sufficiente ad essere facilmente rilevabile e
misurabile; la sua potenza in uscita altresì deve essere stabile per
periodi ragionevoli.
Esistono due tipi di sorgenti spettroscopiche:
➲ sorgenti continue
➲ sorgenti a righe
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Sorgenti continue di radiazione visibile
Le lampade tungsteno/alogene s tanno incontrando
un’applicazione sempre crescente nei moderni strumenti
spettroscopici per via del loro esteso intervallo di lunghezza
d’onda (240-2500 nm), della maggiore sensibilità e della vita più
lunga.
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Sorgenti continue di radiazione ultravioletta
Le lampade al deuterio (e anche ad idrogeno) sono usate per
fornire radiazione continua nell’intervallo da 160 a 380 nm e sono
le sorgenti più comuni per la spettroscopia ultravioletta.
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Sorgenti continue di radiazione infrarossa
La sorgente Globar consiste di una bacchetta (5 per 50 nm) di
carburo di silicio. Quando la sorgente è riscaldata a circa 1500°C dal
passaggio di elettricità emette radiazione nella regione da 1 a 40 µm.
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La lampada di Nerst è una bacchetta di ossidi di ittrio e di zirconio
avente dimensioni tipiche di 2 per 20 µm. Emette radiazione
infrarossa quando riscaldata ad alta temperatura da una corrente
elettrica.
Sorgenti continue di radiazione infrarossa
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Sorgenti continue per la spettroscopia ottica
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Selettori di lunghezza d’onda
Gli strumenti spettroscopici sono generalmente equipaggiati con
uno o più dispositivi per limitare la radiazione da misurare a una
stretta banda, assorbita o emessa dall’analita.
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Esistono due classi di selettori di lunghezza d’onda:
➲ monocromatori: permettono variazioni della lunghezza d’onda in
uscita in un intervallo spettrale considerevole
➲ filtri: offrono il vantaggio della semplicità, robustezza e basso
costo
Selettori di lunghezza d’onda
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Monocromatori
I monocromatori sono di due tipi: uno impiega un reticolo per
disperdere la radiazione nelle sue lunghezze d’onda competenti,
l’altro usa un prisma.
Al momento sono i monocromatori a reticolo quelli
preferenzialmente utilizzati.
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Monocromatore a reticolo
Per scopo illustrativo la radiazione è raffigurata da due lunghezze
d’onda λ1 e λ2 in cui λ1 > λ2. Ruotando il reticolo, sia λ1 che λ2
possono essere focalizzate sulla fenditura di uscita del
monocromatore.
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Monocromatore a reticolo a piccoli gradini
I reticoli a riflessione consistono di una superficie piana e riflettente
di alluminio lunga pochi centimetri che presenta un gran numero di
solchi paralleli e strettamente spaziati. Per la radiazione ultravioletta/
visibile il reticolo deve avere 1200/1400 solchi per mm mentre per
quella infrarossa 10/200 per mm.
Raggi monocromatici Ad angolo di incidenza i
Raggi diffratto all’angolo di riflessione r
Normale Al reticolo
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Reticoli concavi
I reticoli concavi permettono la progettazione di un monocromatore
senza specchi o lenti ausiliari di collimazione e focalizzazione
poiché la superficie concava non solo disperde la radiazione ma la
focalizza anche sulla fenditura di uscita.
Inoltre la radiazione del numero di superfici ottiche aumenta
l’energia in uscita dai monocromatori che presentano un reticolo
concavo.
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Reticoli olografici
I reticoli olografici vengono realizzati rivestendo una lastra di vetro
piana con un materiale fotosensibile. I fasci provenienti da una
coppia di laser identici colpiscono la superficie di vetro ricoperta.
Le frange di interferenza risultanti dai due fasci sensibilizzano la
fotoresistenza causando lo scioglimento di alcune aree e la
formazione di una struttura scanalata.
L’alluminio viene quindi depositato sotto vuoto. Si possono
fabbricare reticoli con anche 6000 linee/mm
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Filtri
Il tipo più comune di filtro d’assorbimento è un pezzo di vetro
colorato su un supporto. Filtri di questo tipo hanno ampiezze di
banda effettive da 50 fino a 250 nm ed hanno picchi di trasmittanza
più bassi di quelli mostrati dai filtri ad interferenza.
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Qui di seguito vengono paragonate le caratteristiche di trasmissione di
un filtro di assorbimento e di un filtro ad interferenza.
Filtri
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Rivelatori e trasduttori di radiazioni
Il rivelatore è un dispositivo in grado di indicare l’esistenza di un
qualche fenomeno fisico.
Anche l’occhio umano può essere considerato un rivelatore: esso
converte la radiazione visibile in un segnale elettrico che è trasmesso
al cervello attraverso la catena di neuroni nel nervo ottico.
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Il trasduttore è un tipo speciale di rivelatore che converte segnali
come intensità luminosa, pH, massa e temperatura in segnali elettrici
che possono essere amplificati e convertiti in numeri proporzionali
alla grandezza del segnale originale.
Rivelatori e trasduttori di radiazioni
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Trasduttori
E’ essenziale che il segnale elettrico prodotto dal trasduttore sia
direttamente proporzionale alla potenza P del raggio:
G = KP + K’
G = risposta elettrica del rivelatore in unità di corrente, resistenza o
potenziale
P = potenza del raggio
K = costante di proporzionalità che misura la sensibilità in termini di
risposta elettrica per unità di potenza radiante
K’ = corrente di fondo (risposta piccola e costante presente anche
quando nessuna radiazione colpisce la superficie del trasduttore o
rivelatore)
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Trasduttori
Esistono due tipi di trasduttori: un tipo risponde ai fotoni, l’altro al
calore.
I rivelatori fotonici si basano sull’interazione della radiazione con una superficie radioattiva per produrre elettroni (fotoemissione) o per
promuovere elettroni a stati di energia in cui essi conducono
elettricità (fotoconduzione). Solo le radiazioni ultravioletta, visibile e
nel vicino infrarosso hanno energia sufficiente per promuovere questi
processi.
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Trasduttori
La radiazione infrarossa è rivelata mediante i rivelatori di calore
misurando l’aumento di temperatura di un materiale annerito,
posizionato nel cammino del raggio, o misurando l’aumento di
conducibilità elettrica di un materiale fotoconduttore quando questo
assorbe la radiazione infrarossa.
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Tabella riassuntiva dei maggiori rivelatori per spettroscopia
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Rivelatori fotonici
➲ Fototubi
➲ Fotomoltiplicatori
➲ Fotodiodi al silicio
➲ Celle fotovoltaiche
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Fototubi
Applicando un potenziale tra gli elettrodi, i fotoelettroni emessi fluiscono
all’anodo, producendo una corrente (fotocorrente) che è velocemente
amplificata e mostrata su uno schermo e registrata.
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Tubi fotomoltiplicatori
E’ simile nella costruzione al fototubo ma è più sensibile. Gli
elettroni emessi sono accelerati verso un dinodo (1)
mantenuto ad un potenziale di circa 90 V più elevato rispetto
al catodo e cosi via su tutti i dinodi rimanenti producendo per
ciascun fotone da 106 a 107 elettroni. Tale cascata di
elettroni è infine raccolta all’anodo.
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Fotodiodi al silicio
Hanno acquisito notevole importanza
recentemente perché è possibile affiancarne, su
un singolo chip di silicio, 1000 o più.
Con uno o due di questi rivelatori a serie di
diodi posti lungo la lunghezza del piano focale
di un monocromatore è possibile monitorare
simultaneamente tutte le lunghezze d’onda,
realizzando così la spettroscopia ad alta
velocità.
Il silicio cristallino è un semiconduttore. A
temperatura ambiente questa struttura ha un
agitazione termica
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Celle fotovoltaiche
E’ il piú semplice trasduttore di radiazione ed è costituito da un
elettrodo di rame o di ferro sul quale è depositato uno strato di un
materiale semiconduttore come selenio o rame(I) ossido.
La cella fotovoltaica tipica ha sensibilità massima a circa 550 nm, con
una risposta che cade a circa il 10% del massimo a 350 e 750 nm.
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Rivelatori termici
I rivelatori fotonici precedentemente esposti non possono essere
utilizzati per misurare la radiazione infrarossa poiché i fotoni di
queste frequenze non hanno energia sufficiente a produrre
fotoemissione di elettroni; come conseguenza devono essere usati i
rivelatori termici.
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I rivelatori termici consistono di una sottile superficie annerita che
si riscalda assorbendo radiazione infrarossa. L’aumento di
temperatura è convertito in un segnale elettrico che è amplificato e
misurato.
Le prestazioni dei rivelatori termici sono decisamente inferiori a
quelle dei rivelatori fotonici.
Rivelatori termici
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Rapporto segnale-rumore
Il segnale in uscita dallo strumento fluttua in maniera casuale e
proprio tali fluttuazioni limitano la precisione dello strumento.
Il segnale è il valore medio dell’uscita di un dispositivo elettronico, mentre il rumore è la misura della deviazione standard
del segnale.
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Il rapporto segnale-rumore (S/N) viene usualmente definito come il
rapporto tra il valor medio del segnale in uscita e la sua deviazione
standard ed è considerato un’importante parametro di merito per gli
strumenti analitici e per altri tipi di dispositivi elettronici.
Rapporto segnale-rumore
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Rapporto segnale-rumore
Il comportamento segnale-rumore è
mostrato nello spettro riportato qui
a fianco relativo all’emoglobina.
Lo spettro in basso ha S/N = 100 e
si possono facilmente osservare i
picchi a 540 nm e 580 nm. Con la
diminuzione di S/N i picchi
appaiono scarsamente visibili; per
valori di S/N = 2 e S/N = 1 i picchi
scompaiono nel rumore e non sono
identificabili.
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Contenitori per il campione
I contenitori per il campione sono
chiamati cellette o cuvette e
devono avere finestre costruite con
un materiale trasparente nella
regione spettrale d’interesse.
Il quarzo o silice fusa è richiesto per la regione ultravioletta(sotto i 350 nm)
e può essere usato nella regione visibile e fino a circa 3000 nm
nell’infrarosso.
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Contenitori per il campione
La qualità dei dati spettroscopici dipende criticamente dal modo in
cui le cuvette accoppiate sono usate e conservate.
Impronte digitali, grasso o altri depositi sulle pareti alterano in
maniera marcata le caratteristiche di trasmissione di una cuvetta.
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Strumenti per misure di assorbimento ottico
Sono due i tipi di strumenti utilizzati per misure di assorbimento con radiazione ultravioletta, visibile o infrarossa: ➲ spettrofotometri ➲ fotometri
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Gli spettrofotometri utilizzano un monocromatore a reticolo o a
prisma per selezionare una stretta banda di radiazione per le
misure.
I fotometri utilizzano a tale scopo un filtro di assorbimento.
Differenze tra spettrofotometri e fotometri
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Gli spettrofotometri offrono il vantaggio considerevole della
possibilità di variare in modo continuo la lunghezza d’onda utilizzata
rendendo possibile la registrazione dell’intero spettro di assorbimento.
I fotometri hanno di contro il vantaggio della semplicità, robustezza e
basso costo.
Differenze tra spettrofotometri e fotometri
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Esistono tre categorie di strumenti utilizzabili per la spettrofotometria ultravioletta/visibile: ➲ strumenti a raggio singolo ➲ strumenti a doppio raggio ➲ strumenti multicanale
Spettrofotometri nell’ultravioletto/visibile
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La figura a fianco riporta lo schema di uno strumento semplice e poco costoso, lo Spectronic 20, progettato per la regione visibile dello spettro. Il suo intervallo spettrale va da 340 a 625 nm.
Strumenti a raggio singolo
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Lo Spectronic 20 ha una sorgente di luce a filamento di tungsteno alimentata con un alimentatore stabilizzato. L’intensità della radiazione della lampada è sufficientemente costante da fornire dati di assorbimento riproducibili.
Strumenti a raggio singolo
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La radiazione dalla sorgente passa attraverso una fenditura fissa e
giunge sulla superficie di un reticolo di riflessione.
La radiazione diffratta passa attraverso la fenditura di uscita fino
alla cuvetta del campione o del riferimento ed infine al fototubo.
Strumenti a raggio singolo
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Strumenti a raggio singolo
Il segnale elettrico amplificato dal rivelatore alimenta un contatore
dotato di una scala lineare in trasmittanza percentuale; lo strumento
è dotato anche di una scala logaritmica calibrata in assorbanza.
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Per avere una lettura di trasmittanza percentuale il puntatore del
contatore è prima azzerato con il compartimento del campione
vuoto, in modo tale che lo schermo blocchi il raggio e nessuna
radiazione raggiunga il rivelatore. Il procedimento è detto
calibrazione o aggiustamento dello 0% di T.
Strumenti a raggio singolo
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Una volta effettuata la calibrazione o aggiustamento dello 0% di T
si inserisce una cuvetta contenente il bianco nel portacampione e il
puntatore è portato in corrispondenza del segno 100% di T
corregendo la posizione della finestra di controllo della luce e
dosando la quantità di luce che raggiunge il rivelatore.
Il procedimento è detto calibrazione o aggiustamento del 100% di T.
Strumenti a raggio singolo
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Strumenti a raggio singolo
Una volta effettuata sia la calibrazione dello 0% di T sia la
calibrazione del 100% di T il campione viene posto nel
compartimento della cuvetta e la trasmittanza percentuale o
l’assorbanza viene letta direttamente sulla scala del contatore.
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Strumenti a doppio raggio
Esistono due tipi di strumenti a doppio raggio:
➲ strumento a doppio raggio con raggi separati “nello spazio”
➲ strumento a doppio raggio con raggi separati “nel tempo”
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Strumento a doppio raggio con raggi separati nello spazio
La figura sottostante illustra uno strumento a doppio raggio “nello
spazio” in cui i due raggi vengono prodotti nello spazio mediante uno
specchio a forma di V detto “beam splitter”.
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Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
In questo secondo tipo di strumento i raggi luminosi sono separati
“nel tempo” per la rotazione di uno specchio a settori che dirige
l’intero fascio dal monocromatore prima attraverso il riferimento e
poi attraverso il campione.
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Gli impulsi di radiazione vengono ricombinati da un secondo specchio a
settori che trasmette un impulso al rivelatore e riflette l’altro.
Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
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Lo strumento precedentemente illustrato è del tipo ad azzeramento; il
raggio che passa attraverso il solvente è attenuato finchè la sua
intensità non eguaglia quella del fascio che passa attraverso il
campione.
L’attenuazione viene eseguita con un cuneo ottico la cui trasmissione
decresce linearmente con la sua lunghezza.
Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
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Gli spettrofotometri a doppio raggio offrono il vantaggio di
compensare tutte le fluttuazioni, tranne quelle di durata molto
breve, nell’uscita radiante della sorgente nonché la deriva del
rivelatore e dell’amplificatore.
Strumenti a doppio raggio
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Strumenti multicanale
Gli spettrofotometri multicanale, o a serie di diodi, permettono la registrazione rapida di un intero spettro ultravioletto e visibile. Il cuore di questi strumenti è rappresentato da un numero elevato di diodi di silicio posti l’uno accanto all’altro su una singola piastrina di silicio.
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Le piastrine generalmente sono lunghe da 1 a 6 cm mentre la
larghezza dei singoli diodi varia da 0.015 a 0.050 mm.
Ponendo una o due di queste serie di diodi lungo il piano focale di un monocromatore a reticolo, tutte le lunghezze d’onda possono
essere registrate contemporaneamente e i dati per un intero spettro
collezionati e memorizzati in un secondo o meno.
Strumenti multicanale
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Qui di seguito viene mostrato un diagramma ottico di un tipico spettrofotometro multicanale nell’ultravioletto/visibile.
Strumenti multicanale
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Grazie all’utilizzo di questi strumenti la radiazione in uscita è molto
più intensa di quella di uno spettrofotometro tradizionale e di
conseguenza la sola lampada al deuterio può servire come sorgente sia
per la regione dell’ultravioletto che per quella del visibile (fino a 820
nm).
Strumenti multicanale
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Una singola scansione da 200 a 820 nm con uno strumento di questo
tipo richiede 0.1 s.
Per migliorare la precisione delle misure la scansione viene eseguita
per un secondo o più e i dati sono acquisiti dal computer e mediati
con quelli della scansione successiva.
I ridotti tempi di esposizione del campione riducono la
fotodecomposizione dello stesso anche se esso si trova tra sorgente e
monocromatore.
Strumenti multicanale
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Sono due i tipi di spettrofotometri utilizzati in spettroscopia
infrarossa:
➲ strumenti dispersivi
➲ strumenti in trasformata di Fourier
Spettrofotometri nell’infrarosso
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Differiscono dallo spettrofotometro a doppio raggio per la posizione del portacampione rispetto al monocromatore; le
cuvette sono posizionate fra la sorgente e il monocromatore poiché la radiazione infrarossa non è sufficientemente
energetica da provocare decomposizione.
Strumenti dispersivi
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◆ Le sorgenti infrarosse sono costituite da solidi riscaldati piuttosto
che lampade al deuterio o al tungsteno.
◆ I reticoli infrarossi sono più grossolani di quelli utilizzati per la radiazione ultravioletta/visibile.
◆ I rivelatori infrarossi rispondono al calore più che ai fotoni.
Strumenti dispersivi
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Nei primi anni ’70 gli spettrofotometri in trasformata di Fourier
erano molto ingombranti e altrettanto costosi per cui il loro utilizzo
era limitato ad applicazioni speciali per le quali le loro
caratteristiche uniche risultavano essenziali.
Strumenti in trasformata di Fourier
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Chimica Analitica
Adesso le dimensioni sono state ridotte a dimensioni da banco, i
prezzi sono più accesibili e la facilità ed affidabilità nell’utilizzo li
sta facendo diventare gli strumenti di scelta nella maggior parte dei
laboratori.
Gli strumenti in trasformata di Fourier non contengono elementi
dispersivi e tutte le lunghezze d’onda sono rivelate e misurate
contemporaneamente.
Strumenti in trasformata di Fourier
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Interferometro di Michelson
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Interferenza di due fronti d’onda monocromatiche
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Interferenza di due fronti d’onda monocromatiche
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Interferogramma
Spettro di una sorgente Di luce continua
