popolazioni isolare con genealogie ben documentate come quella islandese. Il numero di GWAS oggetto di pubblica-zione in autorevoli riviste scientifiche è in continuo aumen-to ed è catalogato nel database http:/ / www.genome.gov/ GWAStudies. I GWAS appartengono alla categoria degli srudi ipotesi-indipendenti , ovvero non hanno la finalità di fornire la verifica sperimentale di ipotesi predeterminate. Si analizza a tappeto l'intero genoma (o regioni rappresentati-ve rli rutto il genoma) per scoprire le regioni associate a una specifica malattia, senza tenere conto rli quali geni abbiano la maggiore probabilità di essere implicati in base a dati funzionali. Per questo motivo, l' identificazione di SNP associati alla malattia non rappresenta la fine del percorso di ricerca. Infatti un SNP può essere associato alla malat-tia perché ha un ruolo causale diretto nella sua origine,

a. 10

8

6

4

ldentiflc.aiione della variante di suscettibilitÌI

Tag SNP SNP causale JGl-----+c -.. .... ... .. • •• 1

Test funz1onah - Comprensmne del processo ez1olog1co - Prevenzione -Bersagh terapeut1c1 - Biomark.er -

D1agnos1 precoce - Prognosi

e.

Capitolo 9 • Caratteri mult1fattonali 141

oppure perché è in linkage disequilibrium con una variante patogenetica. Quindi, una volta trovata un 'associazione, è necessario effettuare ultetjslri approfondimenti, anche merliante studi funzionali, per identificare l'allele o gli alleli realmente implicati nella suscettibilità (Figura 9.16).

VALORE PREDITTIVO E UTILITÀ CLINICA DEGLI STUDI GWAS Navigando sul web si incontrano sempre più spesso offerte commerciali di "profili genomici " che possono fornire indicazioni utili sulla condotta di vita più adatta a prevenire la comparsa di malattie verso cui il singo-lo "cliente" sia risultato particolarmente suscettibile. Si tratta, come vedremo, di un fenomeno che desta preoc-cupazione nel momento in cui la gestione di aspetti così

. .. . . . . :-. . .. . .

145900000 146000000 146100000 146200000

c.

d.

f . :. fasi di un GWAS: C?opo (da migliaia a decine d1 m1gha1a d1 1nd1v1du1) ben caratterizzato fenot1picamente per caratteri sia quant1tat1v1 sia dicotomici (caso-controllo) si i_ Qenotip_i d! m_ig1iaia _di.SNP graz_ie_all'usc:> _della tecn?l.ogia microarray (a) e si calcola per

la s.1gn1f1cat1v1tà stat1st1ca. dell .assoe1az1one. S1. npor:tano '· m d1 istogramma, disponendo in ascissa i SNP ordina.ti secondo loro locahzza.z10.ne e m ordinata 1 livelli d1 _significatività in scala logaritmica negativa, -log, (P), per cui; per esempio, un valore una P d1 lo-6: A _questo d1 rappresentazione grafica è stato dato l'evocativi nome. d1 una del.le. reg1on1 (e) da cui provengono i SNP con livelli di significatività

alla u: correzione di Bonferroni per il numero di confronti, in cui sono 1 d1 singoli SNP (asse y di sinistra) e la frequenza di ricombinazione (asse

Y d1 _tra 1 d.1. linkage (LO) presenti nella regione (d). Nella parte inferiore del pannello d sono 1 presen!1 del loro orientamento (frecce); i triangoli rappresentano i blocchi di LO !! 1 d1vers1_ toni d1 1':1d1can? I er:1t1tà d1 tra .ciascl!na coppia di SNP. Dopo validazione del dato in uno 0 più campioni

e d1 altri al fine d1 restringere l'intervallo che mostra associazione si procede con una serie di mdagm1 volte all'1dent1f1caz1one della vanantè causale {e). '

_____ ___--.---:::-:-_-.i per l'utilit.'i clinica

screening delicati e complessi come quelli propri della predittiva rischiano di sfuggire al coni rollo delle autorita sanitarie, le quali negli USA stanno comunque cercando di monitorare questo genere di in iziative e di 111· formazioni urili ai consumatori sui loro limiti e SUI loro rischi (h1tp://ghr.nlm.nih.gov/handbookltesting/direct-toconsumer). Infatti allo stato arruale non ci sono pro,•e per sostenere che i profili genomici siano cli una qualche utilità per misurare_il rischio genetico cli un individuo nei confronti delle malame comuni, né per stabilire diete personalizzate o suggerire stili di vita ai fini di prevenirne l'insorgenza. È inoltre parados-sale che questa consapevolezza ci sia anche da pane di chi propone questo genere cli 1est. Per esen1pio nel documento che deve essere letto e approvato dal fruitore del test (il cosiddetro "consenso infom1ato"} si leggono in maniera ri-corrente frasi quali "[. .. ] anche se alcuni.marcatori genetici sono associati a una più alta incidenza di alcune malattie in cen e popolazioni, l'accesso ai suoi dati generic i non si traduce direttamente in una predizione personalizzata [ .. .]",oppure "( .. . ] quello che le stiamo fornendo non è un test per diagnosticare W1a malartia presente o futura e non intende essere W1 çonsiglio medico [ . .. ]". È tuttavia legittimo domandarsi, in una prospetciva clinica e di salute pubblica, dove possano panare le conoscenze cli base fornite dagli studi GWAS. Si è visto nei precedenti paragrafi che le varianti alleliche individuate banno ciascu-na un effetto fenotipico modesto (OR "' 1,2) e che spiegano solo una piccola parte della varianza genetica attesa dai calcoli di creclitabilità. Ciò comporla che molto deve essere ancora fatto, anche da un punto di vista metodologico, per valutare la significatività e la relazione cli causalità con tali deboli effetti, per individuare altre fonti di variabili-tà di potenziale interesse quali le CNV e per integrare.le inforrnazioni derivanti dagli studi di trascrittomica e me-tabolomica (si veda_il Capitolo Il ). Perché i tesi genetici preclim'" sviluppabili dagli srudi GWAS abbiano validità clinica occorrerebbe che fossero basati sull'uso di marcatori specifici e sensibili, in modo da risultare dotati di elevato valore predittivo posi rivo o negativo (Tabella 9. 7). L'analisi delle variabili genetiche (numero e frequenza delle varianti a rischio) ed epidemiologiche (rischio cli malattia e rischio rela,tivo dei singoli genotipi) conosciute pona al calcolo dell A UC (Ar"'.' Uadenhe operating characteristic Cuive), un mclicatore smteaco di validità clinica che val t la capacità del test di riconoscere nella popolazione che si ammaleranno. AUC varia tra 0,5 (nessuna ca · , di · · ) . . . pama scrumnanre e I (1nd1v1duazione perfetta). Perché un test sia considerato c101camente valido si ritiene debba

AUC 2: 0:8. s: si prendono in esame gli srudi con-dom fino a oggi sull accenamento di questo . . .

h requmto si osseiva c e nessun test finora messo a punto lo . d,

I, · poss1e e con eccezione della degenerazione maculare 1 ara ' : (si veda il Capitolo 28) e eg È ali eta valutato che, in assenza di detenninanti genenuet· a: •e stato . I · per raggmngere a soglia fissata sono neces . , 320 marcatori con frequenze di eterozigoti tra 20 e elevate (frequenza dell'allele mia MAFr aavamente

ore - , Minor Allele

Malat i (n : 158) Sani (4630) 119 (a) 926 (b)

Test positivo 39 (e) 3704 (d) Test negativo e dei positiifl al rest rra i malati, a I (a + cJ.

. , ne1resempt0 numenco . dei negativi al test era i sam. d I (b + dJ. speaficrtà 370414630 = 80% netr.dmpio numerico ;PP) proporzione dei malau tra i pos111vi al Valore P,IfdtrtNO Posmvo io numerico VPP= 1191 (119 + 926) = 11% test. a I (a+ b). nell'esefflP FWt prop0rz1one dei sani tra i negatM al Valore Prediruvo nu;,,enco VPN = 37041(39+ 3704) = 99% cesc,d l(c +dJ,n l t:".><'"'"

VPN oltre che da Se e Sp dipendono anche dalla S1 noti cm: :ae malart1a nella popolazione: se essa fosse 1 O volte ptU

a panta di Se e Sp del rest, avremmo VPP 65% e VPN 87%. 6:;,usttfica l'interesse per questo tipo di approcci alle malattie comun1

Freque::-Cy. 5-30% ) e OR 1)5-1,5. Ma quandranche se ne stab ilisca la validità, s1 d evo n_o altri aspetti affinché si possa parlare_ di un effemva utilità c.linica di un test genetico predimvo. t.Jon ultimi, gli aspetti più squisitamente te cnologici (affidabilità ed economicità della genotipizzazione), ma in questo con-testo interessa premere maggiormente sulla disponibil1à di misure preventive in grado di ridurre il rischio ac-certato con il test e di consulenti genetici in grado di comunicare in maniera efficace al soggetto il risultato del test e le opzioni preventive e/ o terapeutiche.

DISSEZIONE GENETICA DI UN CARATIERE COMPLESSO: LA CELIACHIA

Alcune malattie mostrano un'associazione con particolari antigeni HLA (Box 9.3 e Tabella 9.8). La cdiachia è un 'enteropatia indotta dal glutine, una protema presente in buona parte dei cereali, in soggeni geneacameme predisposti. La mala_tria insorge per un meccanismo autoimmune, quando il stStema imn · · . . . al dal gl . fin . lUnttano, attivato m nusura anom a

L udnne, . isce con il danneggiare l' intestino stesso.

a pre isposmone all li h. h . Co dim a ce ac ta a una base geneaca,

me ostrato dall · • la freq e seguenti osservazioni: uenza della malattia · . dei probandi , ell' . tra 1 parena di primo grado

denziale del 10%, a fronte di una stima pru-• la concord uenza nella popolazione generale cli 1:200.

anza tra ge elli .. elevata rispett ellm monozigoti (80%) è piu 0 a qu a tra dizigoti.

Come avviene in predisposizion _gendere nelle malattie autoimmuni, tale

. e ns1e e nel si t d. d li antigeni alle cellul . s ema 1 presentazione eg • fratelJj HLA .d e ltllmunocompeten ti:

al 1 ent1c1 m d lii m arria del JO% . ostrano una concordanza e • oltre il 90o/, d . ' .

molecola ch0

ei pazienti celiaci possiede l'HLA-])Q2: e mvece ' de• soggetti appare e nel 20% circa

ntemente sani.

Capitolo 9 • Caratten multlfattorìah 143

BOX 9.3 - COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA

dalla trap1antolog1a spenmentale che uno o più genetici determinano se un trapianto verrà accettato o nget-tato. 11 complesso maggiore d1 1Stocompat1b1htà (MHC, Ma1or H1stocompatlb1hty Complex) nell'uomo è localizzato sul braccio corto del cromosoma 6, dove occupa circa 4 Mb. La regione è stata completamente sequenziata nel 1999 e contiene 224 geni, d1 cui quasi metà hanno un ruolo nella nsposta 1rnmum-tana. I geni dell'MHC responsabili delle reazioni d1 rigetto dei trapianti codificano ghcoproteine d1 membrana estn!mamente polimorfiche espresse pressoché ub1quitariamente ma sco-perte per la pnma volta sui leucoc1t1, da cui 11 nome Human Leukocyte Antigens (HLAl. Le molecole HLA sono dNeBe, nel loro complesso, in ogni individuo. Pertanto. quando si ese-guono trap1ant1 d1 organi sohd1 è necessario somministrare farmaci immunosoppressori per cercare d1 prevenire o ndurre le reazioni immunitarie rivolte verso gli alloantigeni HLA del donatore. Il trapianto d1 midollo osseo (TMO) è il più sensibde alle differenze HLA. Fortunatamente, all'interno delle famigl1e la diversità HLA è evidentemente ridotta e 1 fratelli hanno 1/4 d1 probabilità d1 essere HLA 1dent1ci tn quanto hanno ncewto

Il

Malattia

Il

M arcatore

-... ' l

"'< 1 medesimi aplobpt HLA da• gernton. Gli antigeni pnoopali per 1 quafi è necessano garantire idenlltà nel TMO sono HLA-A. HLA-B e HLA-DR la cui segregarone è illustrata nella figura I /oo A e B codificano, rispettivamente, una trentina e una sessantina di antigent defintll SJerologicamente, ma al !Nello del DNA esistono ri5pett1vamente oltte 1000 e 1600 alleli. Esistono ma venti antigeni definiti Slelologicarnenle a1 1orus HA-ORBr. ma al liveUo di sequenza nucleolidica è possibile nconoscere ormat quasi 800 alleli diwet5i! Al'anagene DR4. per eseqJIO, comspondouo 120 alleli DR81 *04. L'eleva!Dgrado di poli11uf&110 dei geni HlA è vantaggiOSO da un pun1D di vista ewduzionisticD in quanto reterozJgOSI permet-te UN rniglion! e diversificata risposta immunitaria nei confronti d1 mbolganislni patogem. Tra i meccanismi evolutM invocati per garantìn! M polimorfismo figura l'incrocio non casuale. La presenza di geni per recettori olfattM nela regione MHC è stata infatti messa 11 ll!lazione con la scelta sessuale: studi condotti in ceppi di topi congenoa hanno mostrato che le femmine erano in grado di distinguere rodare delle urine dt maschi appartenenti a <;eppt dM!rsi solo per la R!glOfle MHC.

staio ipOliZlato che le malattie autoimmum associate ad alcuni particolari antigeni HLA siano prezzo che la specie ha pagato per oo'efticac:a resistenza alle malattie infettive. Esemplare è il caso dela celiachia: l'atrofia dei villi intestinali, assooata all'ipelplasia compan! anche in corso cl *ali. infezioni elmintiche La ridu-ZIOfle intestinale e la fonnazione di oo ambiente proinlianinillorio pos50n0 essere considerati parte cl un IW&llisl110 generale di difesa contro le infezioni. I soggetti con rearone celiaca potrebbero aver goduto di un sostanziale vanlaggio selettivo in pi1Sl5élto; gli effetti con la COlllpal5il dela malattia celiaca. sarebbero Consegl8D dei cambianltlJti intlOdotti dala CD5iddetla rivoluzione neolllillr <aumentato consumo di glutine) e, lllÌI di recente, del miglior controllo delle 111feziom.

Spondilite anchilosante HLA-827 827 presente tn > 95% dei pazienti e in -7% dei sani. 11 -3% dei soggetti 827 + svjupperà la malattia. Anche se la presenza d1 827 non è diagnostica, la sua assenza virtualmente esclude la malattia

) arcoless1a

Diabete insulino-d1pendente

HLA-DR15 DQ81"0602

HLA-DQ2 HLA-DQ3

L'aplot1po DRBI *15.'01-DQB1*06·02 è presente m quasi tutti; pazienti La frequenza nei sani è -25%. Anche se la presenza d1 DQBI *06:02 non è d1agnost1ca, la sua assenza virtualmente esclude la malattia

Gli antigeni DQ2 e DQ3 contenenti pecuhan sequenze intorno alla posizione 57 della catena sono strettamente associati alla malattia Tale associazione può essere teoncamente usata per meglio definire 11 rischio di ncorrenza nei parenti d1 pnmo grado dei pazienti

(segue)

Malattia

Artrite reumatoide

Celiach ia

Marcatore

HLA-DR4

HLA-DQ2 HLA-DQ8

Commento . . . . -----70% dei pazienti e in -25% dei sani La

L'antigene DR4 è prese.nte in - resenza dell'ep1topo QKRAA condiviso suscettibilità è determinata dalla p ·05 assente in ORB 1 *04:02, 04 03 da li alleli ORBI •04:01, 04-04 e 04. • ma · e g . umentato rischio d1 sviluppare la malatt1a11 04 07 non assoc1at1 con un a . "' · ' t ·co più che diagnostico: DR4 è associato .a forme può avere valore prognos 1 . . . d . stato anche descritto un effetto dose (gh omoz1gob DR4 p1u aggressive e e . . . li eterozigoti) sono colp1t1 in forma,p1u grave rispetto ag

DQ2 presente in > 90% dei pazienti e in - 20% dei sani; 11 - 6% dei paz;;; presenta DQ8. Tali associazioni possono essere usate p.er meglio definire 11 rischio di ricorrenza nei parenti di primo grado dei paz1ent1 DQ2+ e DQ8+ La presenza di DQ2 0 DQ8 è diagnostica nei casi che mostran.o un quadro clinico comunqu.e sug,gest1vo .in assenza delle caratteristiche s1erolog1che che rientrano tra 1 cnten d'iagnost10 ...

li sistema HLA (si veda il Box 9.3) è un insieme di ge-ni che codificano proteine coinvolte nel meccanismo di riconoscimento degli antigeni da parte dei linfociti T. Sono espresse sulJa superficie cellulare come eterodimeri

formati da una subunità a. e una subunità L'elevato grado di polimorfismo nei domini d<!putati al legame con l'antigene si traduce in una selezione dei peptidi an-tigenici derivati daJJa processazione di proteine estrànee

Eteroclimero HLA-DQ2 codificato in cis Eterodimero HLA-DQl codifiuto in trans

DR3-DQ2 DR5-DQ7

DR7-DQ2

OQBI' OQAI' ORBI' DQBI* DQAI* ORBI '

HLA-DQ2

FIGURA 9.17 - Assetti genotipici che portano alla costituzio d la molecola recettoriale OQÀ<)no codificate dai geni 0 0 8 7 ne el la molecola HLA-DQ2 Le questi foci mantengono uno !l!retto linkage disequilibrium e OQA 7 • Essi distano 20 catene e DQo che DR3-DQ2 presenta gli alleli DQB1•02:01 e OQA,.OS:OI che si estende e pertanto gli alleli presenti 1n anche in quegli ind1v1du1 che hanno gli aplotipi DRS-DQl a c0st1tuire l'eterod· c e al gene ORBI . t:aplot1po . . l'allele DQB1 •02:02, che insieme vanno a formare u e . -DQ2: •I J>nmo aploti 1m.ero Allo stesso risultato SI arfl'I• '" cis dall'aplotipo DR3-DQ2. Le sigle numeriche si ,.7 eterod1mero DQ2 sierologicam':' contiene I allele OQA1 •os:OS, il secondo Le prodotti allelici costituiscono ai .dtve!'Si al.leli distinti mdistmguibile da quello codificato (Mod1f1cata da: Soll1d LM. Coeliac disease: d issectin 1 antigeni, distinguibir ase alla sequenza nucleotidica.

g a comp ex mflammatory disord • con metodi sierOlogici. er. Nat Rev lmmunol 2002; 2: 647-655.)

145

da presentare ai linfociti T. Alcuni peptidi codificati da proteine procione dallo stesso individuo (peptidi sel/J pos-sono essere legati e presentati da alcune molecole HLA, ma non da aie re. Questa osservazione fornisce le basi per l'associazione era HLA e malattie autoimmuni. L'intolleranza al glutine è principalmente legata alla pre-senza di alcuni geni HLA di classe Il, sierologicamence definiti DQ2, nell'asseno genetico della maggior parte dei pazienti celiaci. Circa il 6 % dei malati possiede la speci-ficità DQ8 e soltanto il 3 % circa mostra altre specificità DQ (per esempio DQl o DQ7 ). L'eterodimero DQ è costituito da una catena a codificata dal gene DQA 1 e da una codificata dal gene DQBl. Gli eterodimeri possono essere codificati da geni posti sullo stesso cro-mosoma (cis) ovvero sui due omologhi (trans): pertanto, un individuo doppio eterozigote sarà dotato di 4 diversi eterodimeri DQ (Figura 9.17).

implicati nell'eziopatogenesi della malattia (Tabella 9.9 e Figura 9.18). È aperta così la strada per l'identificazione dei

· singoli geni predisponenti alla celirichia con owie importanti prospettive di ricadute in ambito clinico.

CONCLUSIONI

I dati epidemiologici mostrano che nella celiachia l'aggrega-zione familiare è >..,. = 20. Dagli studi sulle coppie di fratelli concordanti per il fenotipo malartia è stato stimato che il rischio attribuibile all'HLA è 1',,,,. = 4. Il rischio è quindi determinato in maniera preponderante da fanori genetici non-HLA. Tanto gli studi di linkage quanto quelli di associa-zione hanno evid=iato la presenza di kxi di suscettibilità in regioni cromosomiche che contengono geni potenzialmente

In questo capitolo è stato mostrato che la variabilità di molti caraneri, normali e patologici, è causata dall 'azio-ne concertata di un numero, ancora largamente scono-sciuto, di geni e di fattori ambientali. L'applicazione dei modelli della distribuzione statistica normale per lo studio dei caraneri quantitativi e semiquantitativi ha permesso di dimostrare e di "quantificare" il sostanziale contributo dei fattori genetici al rischio di sviluppare moire malattie comuni. Si è visto che è ora in corso la sfida per individuare i geni che concorrono alla suscet-tibilità nei confronti di queste malattie "complesse", sfida condotta con le armi della statistica, dell 'epide-miologia, della bioinformatica e delJa biotecnologia, discipline che hanno elaborato strategie sempre più po-tenti per esplorare il genoma anraverso studi di linkage e di associazione condotti su grandi coorti di pazienti. La pubblicazione della sequenza del genoma umano

:

LOCUS OMIM'" Regione Individuato tramite Geni candidati cromosomica studi di linkage (L)

e/o associazione (A)

CELIAC l 2 12750 6p21.3 L. A HLA-DQAI, HLA-DQBI, MICA

CELIAC2 609754 5q31-q33 regione troppo amp<a (18cM)

CELIAC3 609755 ..... i\. 2q33 'A CD28, CTLA4, ICOS

CELIAC4 609753 19p13.1 L, A MY0 98

CELIAC5 607202 15ql 1-ql3 regione troppo ampia

CELIAC6 611598 4q27 A KIAA 1109, TENR, IL2,

"' IL21

CELIAC7 61 2005 r l q31 A RGSI

CELIAC8 612006 2ql l-q12 A /LIBR I, ILIBRAP CEUAC9 6 12007 3p21 A CCRI, CCR2, CCRL2,

CCR3, CCR5, XCRI CEUAClO 612008 3q25-q26 A IL12A CEUACll 612009 3q28 A LPP CELIAC12 612010 6q25.3 A TAGAP CEUAC13 612011 12q24 A SH283

Online Mendehan lnherrtance m Man

146 Parte I • Le basi della genetica umana ----.. n i .. I .. I

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N . FIGURA 9.18 - lstogra!'!'ma .dei d i sig nificatività stat istica tra . • - . .--..- • • · • · esaminati in un campJ.Q!le !78 cor1trolli . Oltre la re per ciascuno degli oltre SNP cromosomica 4q27 Il hvel_lo d1 s1gn1f1cat1v1tà d1 10-1 (richiesto per HLA, so!o un marcatore della Nella figura (per genti.le DA van Heel) sono individuati dell elevato numero di P< 10_. e che sono stati d1 insieme a un altro migliaio con P< 1 1 che C?ttenuto valori d1 . . . nel complesso da 1.643 paz1e nt1 celiaci e Sull'asse y i valori di ro b. camp1?n1 indipendenti negativa, - loglf(P). (Da: Hunt et al. Novel cellac d1sease genetic abilità riportati in scala logaritmi<' Nat Genet 200 , 40: 395-402) •ted to the immune response.

e la scoperta di milioni di SNP ha ingenerato tra gli studiosi un cauto ottimismo sulla possibilità di arrivare · all'identificazione dei geni coinvolti, la cui conoscen-za permetterebbe a sua volta di identificare soggetti a rischio, di condurre interventi di medicina preventiva, e di proporre approcci terapeutici mirati per specifici profili genetici. Perché la genotipizzazione di SNP e altri tipi di polimorfismi possa entrare tra le indagini di rou-

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Capitolo 9 • Caratteri multifattoriali 147

tine per le malattie però richiesta una migliore conoscenza della strutturà\genetica delle popolazioni umane e un grande lavoro di ricerca clinica. In questo contesto, l'importanza dei test genetici "predittivi" per una specifica malattia sarà tanto maggiore quanto più ampia sarà la possibilità di intervenire poi con dieta, farmaci e altri cambiamenti nello stile di vita mirati a ridurre il rischio.

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Giovanni Neri, Pietro Chiurazzi CAPITOLO

Malattie da mutazioni dinamiche 15

INTRODUZIONE

Di norma una mutazione genica insorge per un errore di replicazione del O A o per un danno non correttamente riparato dovuto all'esposizione della cellula a radiazioni ionizzanti o ad agenti chimici. Tali mutazioni "convenzio-nali" possono modificare un solo nucleotide (mutazioni puntiformi) o coinvolgere una sequenza più o meno estesa (delezioni, inserzioni o riarrangiamenti). In ogni caso, tali mutazioni sono trasmesse invariate alle generazioni successive, seguendo le leggi di Mendel. Le mutazioni dinamiche invece sono caratterizzate dall'instabilita a i una breve sequenza di O A altamen-te ripetiilva, vanamente detta SRS ( 1mple Repetitive Sequence), SfR Repeat) o sequenza mi-crosatellite:Un"a simile sequenza, una una

, determinata lunghezza soglia, può modificarsi durante la QJCÌosi o anche nelle divisioni post-zigotidie e può quindi trasmettersi, in forma amplificata alla progenie. L'effetto deU'es ansione della equenza ripetitiva dipen e, oltre che dal tipo e dalla dell'unità riperura (dinu-cleotidica, trinucleotidica ecc.), della sequenza stessa (esonica, intronica o intergeni,ca) e dal grado di espansione. l Il concetto di mutazione dinamica è relativamente recente per la storia della genetica, essendo staro definito 1991 dopo l'individuazione della prima patologia geneaca riconducibile aJl'espan ione di una tripletta ripetuta: la sindrome del cromosoma X fragile.

,, Microsatelliti e meccanismi di espansione

>Circa il 3 % del genoma umano è costituito da sequenze microsatelliri, distribuire omogeneamente su tuta 1 ero: mosomi ed estremamente utili come marcacon polimorfic1 in studi di associazione e di linkage per il mappaggio Posizionale di geni (si veda il Capi colo l ). le _se_guenze microsarelliti sono costituire da 10-30 unita

relativamente stabili neUa trasmissione inre_rge· nerazionale, per quanto polimorfiche nella popolazione

generale. Oltrepassata una certa lun hezza so Lia (fra 3Q riperure s1 osserva pero un'insrnbilità meiotica,

limitata a quella data sequenza ripetitiva, che può risul-tare in un'ulteriore espansione. Il rimo meccanismo di

ione SQ!glare le piccole es__llilfilio.ni , limitate a una porzione dell'intera sequenza microsatellite, e quello del o dello scivolamento e riappaiamento errato del lilamento neosintetizzato (slip-ped strand misparing) durante la replicazione del tratto

(Figura 15.1). Durante la sintesi del D A, infatti, la DNA ..oolimerasi compie delle pause e i due fìlamen-ti possono temporaneamente distaccarsi ; qualora uno dei due venga riappaiato in una posizione leggermente arretrata, data fàì:1petitiv1ta della sequenza, è possibile elle il mi match risultame non venru! riQarato e ne derivi

unità ripetute. È stato inoltre osservato che il grado di instabilità della sequenza ripetuta è approssimativamente proporzionale alla lunghezza totale, mentre diminuisce in presenza di interruzioni o imperfezioni all'interno del tratto di Dt A riperiti\•o. Infarti, la presenza di ripetizioni imperfette contribuisce a stabilizzare la sequenza microsatellire, perché può ostacolare il dei filamenti in posi.zione non Le patologie da mutazioni dinamiche in ogni caso caratterizzare da una.not= · rica delle_si;m1enze microsatelliti, che si manisfesra dopo Che sia stara oltrepassata una cena soglia di lunghezza. Le es ansioni n ive devono originarsi con un necessariame!'!e diverso da quello illusrraro ';ieu; Figura 15. I, probabilmente asaro sulla sin resi reiterala del D A riperuto mediara dalla formazione di più strntcure a for-cina (hairpin) su frammenti di Okazaki adiacenti (Figura 15.2). Queste srrurrure secondarie formate sul filamento neosintetizzato sono stabilizzate dall'appaiamento in-rramolecolare di basi complementari (pre\'alentemenre citosina e guanina) o dalla formazione di appaiamenri non ortodossi fra due o anche quattro guanine (G quarters). Anche in questo caso, un 'inappropriata riparazione del DNA condurrebbe alla notevole espansione della sequen-za ripetuta iniziale.

(CAG)n ................ (GTC)n

(GTC)n ................ (CAG)n

Replicazione del DNA

sul filamento neos1ntet1uato

/ stampa

S1ntes1

;?/. -----il Riparazione del DNA .

{CAG)n .............................. (GTC)n

Espansione

Classificazione delle patologie da mutazioni dinamiche

Nella Tabella 15.l sono elei1cate 30 patologie ereditarie umane riconducibili a mutazioni dinamiche, divise in 3 categorie in base alla localizzazione della sequenza espansa (incergenica, incronica o esonica non tradotta; esonica codificante per tratti di poliglutamina o di polia-lanina). La maggior parte delle mutazioni dinamiche è ri-conducibile a rriplette Instabili (CAG, CGG, CTG, GAA ecCJ ncche d1 citosine e guanine, ma sono stati individuati anche un retranucleotide (CCTG), un pencanucleotide (ATTCT) e un dodecamero instabili. È probabile che le triplette siano meglio tollerate nelle sequenze esoniche (tradotte in proteine), in quanto non comportano scivo-lamenti della cornice di lettura (frameshift). È possibile fare alcune generalizzazioni relative alle vafie-9'._egorie: la classe A (Figura 15.3) è com osta da es ansioni massive

non codificanti (inrroniche, esoniche n Y 0 nel 3 1 non trado o del gene o anche nel suo promotore); la classe B (Figura 5.4) è riconducibile a espansioni limi-.m.re di ujplene CAG nella pçczione codificante di diversi geni e determina la produzione di proteine con estesi trarti di poliglutarnina; infine, la 155) è

(GTC)l\-

liJilloliJiliJiliJi

(CAG)n

Delezione

caratterizzata dall' ljmjrata e stabile di tripleue imperfette (G.CN) codificami per tratu di polialanine. Alla 8aSsè'i appartengono la sindrome del cromosmnJ

Xf!:E.gjk, la distrofia miotonica e l'atassia tJi trleJreiJ, trattate più avanti nel capitolo. Ricadono inoltre in quest.a classe di mutazioni dinamiche tre condizioni con um· tà ripetute diverse dalla t ripletta e precisamente: la di· stro/ia miotonica di tipo 2, cararrerizzata dall'espansione del terranucleotide CCTG in un inrrone del gene ZNft. l'atassù1 spino-cerebellare di tipo 10, dovuta all'espansio ne del pentanucleoride ATTCT inrronico e l'eprlessll mioclonica progressiva, riconducibile a un CCCCGCCCCGCG nel gene CSTB. Soltanto in quest . rima condizione e nel! ' espansione CAG nel promotore del gene PPP2R2B (associata ad atassia spino-cerebeUart di tipo 12) si osservano espansioni patologiche alle 100 · - · 1 dizioni untta ripetute mentre in rune le a tre con . e di ' · aia questa classe le espansioni raggiungono le cenun talvolta le migliaia di unità d L I - . t9 I d" c. B di mutazioni dinamiche è rappresentardi'' '

neurodegeneracive a insorgenza ca J ite accomunate dalla presenza di un;;equenza di ttlPc;nP CAG lifi d. aJuet • amp cara nella ri;gione codificante 1

Forane mulbple su frammenti

d1 Okazaki

/

Capitolo 15 • Malattie da mutazioni d1nam1che 243

(CAG}n

(GTC)n

Replicazione del DNA

Riparazione del DNA

(CAG)n .............................. (GTC)n

Espansione massiva

FIGURA 15.2 - Formazione di strutture a forcina multiple su frammenti di Okazaki ed espansioni massive di una sequenza microsatellite. l'espansione massiva di una sequenza ripetuta (owero superiore alla lunghezza iniziale del tratto ripetuto stesso) potrebbe comportare la formazione di molteplici forcine a carico dei frammenti di Okazaki interamente compresi nella sequenza ripetuta.

gèni, che determina la sintesi delle corrispondenti protei-ne con un tratto espanso di poliglucamina (poliQ). Tutte queste pacolog1e sono trasmesse con modalità aucosomica dominante, tranne l'atrofia muscolare spino-bulbare (si veda più avanti) che è X-linked. Di queste malattie neuro-logiche, sette si presentano come atassie spino-cereQellari (SCA, Spinocerebellar Ataxia), mentre la malattia di ff un-tmgto11 comporta un disturbo complesso aei movimenti fuiì:ea e tic multjplìfassociaco a demenza. La classe C è costitwta da mutazioni meno propriamen-te dinamiche. Infatti in questa categoria eterogenea, comprendente la distrofia muscolare oculo-faringea, una forma di ritardo mentale X-linked con deficit deWor-mone della crescita la sindrome da ipoventilazione con-gemta centrale (la :osiddetta maledizione di e diverse sindromi malformative, si ritrovano espansioni pc;lo polimorfiche di una sequenza imperfetta GCN (per questo molto più stabili) codificanti per tratti di polialanina in proteine aventi per lo più funzione di fanori di trascrizione. ln tutti questi casi l'espansione è sempre minima e com· pana al massimo un raddoppio della lunghezza del trat-to di polialanina iniziale (tipicamente da 10-15 a 20-25 residui). È opportuno ricordare che tratti di polialanina

superiori a 15 residui sono rarissimi nelle proteine nom1ali e, ancor più dei tratti di poliglutamina, causano la forma-zione di aggregati intracellulari estremamente tossici per motivi ancora da chiarire. Di tutte le patologie sopra elencate, soltanto alcune di maggior interesse clinico·genetico, verraJ}no illustrate dettagliatamente in 'questo capitolo.

SINDROME DEL CROMOSOMA X FRAGILE

Cenni storici ed epidemiologia

È noto da tempo che i con ritardo men-cli sesso maschile,

larga misura di forme eredit · dovute a mutazione di qmnd1 destinate a manifestarsi maggiormente nei maschi. I mas_ch1, -;he possegg_ono un solo X, non sono infacu m grado di compensare eventuali mutazioni de!ecene che interessino geni localizzaci su questo cromo-soma, mentre le femmine, che hanno due cromosomi X compensano con l'allele selvatico un eventuale allele m : rance. Sono descritte più di 200 forme di ritardo mencJe

... t Anno Modalità di Cromosoma Gene/i OMIM ge ne Localizzazione Unità Alleli Alleli scoperta trasmissione ripetuta normali patologici

Grandi espansioni fuori da sequenze codificanti

lrome X fragile (FRAXA) #300624 1991 XL Xq27 3 FMR1 *309550 5' UTR CGG 6-50 200-> 1000 Sindrome da premutazione d1 FMR1 2001 XL Xq27.3 FMR1 •309550 5' UTR CGG 6-50 50->200 (FXTAS) #300623 "' @· Ritardo mentale associato al sito fragile 1993 XL Xq28 FMR2 *300806 5' UTR CCG 6-25 200-1700 " r FRAXE # 309548 '" " Ritardo mentale associato al sito fragile 2007 AD 12q13.12 DIP28 *611379 5' UTR CCG 6-23 200-300 §).

FRA 12A # 136630 Q "

Atassia di Friedreich (FA) #229300 5 ·

1996 AR 9q13-q21 .1 FRDA *606829 lntrone GM 7-22 200-1700 Q

Distrofia miotonica 1 (DM 1) # 160900 1992 AD· 19q13.2 DMPK/SIXS •605377/ 3' UTR CTG 5- 35 50-4000 *600963

Distrofia miotonica 2 (DM2) #602668 2001 AD 3q21.3 ZNF9 *116955 lntrone CCTG 11-22 75- >10000

Atassia spino-cerebellare 8 (SCA8) #608768 1999 AD 13q21 ATXN805 *603680 RNA non tradotto CTG 1z-37 110-> 4000

Atassia spino-cerebellare 1O(SCA1 O) #603516 2000 AD 22q13 ATXN10 *611150 lntronè'" ATTCT 10-22 80Q-4600

Atassia spino-cerebellare 12 (SCA 12) #604326 1999 AD 5q31-q33 PPP2R28 *604325 Promotore CAG 7-28 66-78

Epilessia mioclonica progressiva (EPM1) #254800 1997 AR 21q22.3 CSTB *601145 Promotore CCCCGC 2- 3 40--80 CCCGCG

Espansioni limitate codificanti tratti di poliglutamina (poliQ)

Malattia di Kennedy/atrofia muscolare 1991 XL Xq13-q21 .1 AR *313700 Sequenza tradotta CAG 9-35 38-62

spino-bulbare (SBMA) #313200

Malattia o corea d1 Huntington (HD) #143100 1993 AD 4p16.3 HTT (IT15) *613004 Sequenza tradotta CAG 6-35 36-> 100

2001 AD 16q24 JPH3 *605268 Sequenza tradotta CAG 6-27 40-60

12p13.3 ATNI *607462 Sequenza tradotta CAG 7-35 49-88

; , 6p23 ATXN1 *601556 Sequenza tradotta CAG 6-38 39-83

,,_,..,

Patologia/OMIM Anno , Modalità di Cromosoma Gene/i OMIMgene scoperta trasmissione ripetuta normali patologici

Atassia spino-cerebellare di tipo 2 (SCA2) # 183090 1996 AD ' 12q24 ATXN2 •601517 Sequenza tradotta CAG 14-31 32-77

Atassia di Machado-Joseph (SCA3, MJD) #109150 1994 AD 14q32.1 ATXN3 •607047 Sequenza t radotta CAG 12-39 62-86

Atassia spino-cerebellare di tipo 6 (SCA6) #183086 1997 AD 19p13 CACNA1A •501011 Sequenza tradotta CAG 4-17 21-30

Atassia spino-cerebellare di tipo 7 (SCA7) #164500 1996 AD 3p12-p21.1 ATXN7 *607640 Sequenza tradotta CAG 7-35 37-200

Atassia spino-cerebellare di tipo 17 (SCA 17) 1999 AD 6q27 TBP *600075 Sequenza tradotta CAG 25-42 47-66 #607136

Espansioni imperfette codificanti tratti di polialanina (poliA)

Distrofia muscolare oculo-faringea (OPMD) 199!_; AD 14q1 1.2-q13 PABPN1 •602279 Sequenza tradotta GCN 10 12-17 #164300 ' S1npolidattilia 1 (SPD) #186000 1996 AD 2q31-q32 HOXD13 •142989 Sequenza tradotta GCN 15 22-29

Displasia cleidocranica (CCD) #119600 1997 AD 6p21 RUNX2 •500211 Sequenza tradotta GCN 17 27

Sindrome mano-piede-genitali (Hand-Foot- 2000 AD 7p1 4 HOXA13 • 142959 Sequenza tradotta GCN 12 18 Genital, HFG) # 140000 Sequenza tradotta GCN 18 24,26,27 Q .., Oloprosencefalia tipo 5 (HPE5) #609637 1998 AD 13q32 ZIC2 •503073 Sequenza tradotta GCN 15 25 o Blefarofimos1-ptos1-ep1canto-inverso 2001 AD 3q23 FOXL2 •505597 Sequenza tradotta GCN -14 22,24 UI

(BPES} #110100 , . ;::

Sindrome da 1poventilazione congenita 2003 AR 4p12 PHOX28 •603851 Sequenza tradotta GCN 20 25-29 O> o;-

centrale (maledizione di Ondina) #209880 i · Ritardo mentale con deficit di GH (M RGH} 2002 XL Xq26.3

a. SOX3 •313430 Sequenza tradotta GCN 15 2 O>

#300123 3 e: o; Spettro fenot1p1co dovuto a mutazioni 2002 XL Xp22.1 ARX •300382 Sequenza tradotta GCN

N 16 18,23 o

del gene ARX #308350, #309510, #300215, :! #300004, #300419

Sequenza tradotta GCN 12 20 a. 5 O>

AD=autosom1Ca dominante, ARzautosom1ca recessiva; OMIM=On-lme Mendelian lnherttance m Man, XL=X-lmked 3 ?;' =r "' i

FRAXA e FXTAS (CGG) FRAXE (CCG)

DMl (CTG) FRA 12A (CGG)

RNA non tradotto SCA 12 (CAG) FA (GAA) EPM 1 (CCCCGC DM2( CCTG)

CCCGCG) SCA10 (AITCT)

SCA8 (CTG)

FIGURA 15.3 - Patologie genetiche dovute a mutazioni . dinamiche di sequenze non comprese in regioni codificanti dei rispettivi geni. SCA 12 =atassia spino-cerebellare di tipo 12; EPMl =epilessia miodonica d i tipo 1; FRAXA=sindrome X fragile; FRAXE =ritardo mentale associato a sito fragile FRAXE; FRA 12A = ritardo mentale associato al sito FRA 12A; FA=atassia di Friedreich; DM2=distrofia.miotonica di tipo 2; SCA 10= atassia sPino-cerebellare di tipolO; DM l =distrofia miotonica di tipo 1; SCAS=atassia spinocerebellare di tipo 8.

Promotore

SBMA. HD, HOL2, DRPLA SCA 1, SCA2, SCA3/ MJD

SCA6, SCA 7, SCA 17 (CAG)

FIGURA 15.4 - Patologie genetiche dovute a mutazioni dinamiche di sequenze comprese all'interno di esoni e codificanti per tratti di poliglutamina (poliQ). SBMA=atrofia muscolare spino-bulbare o malattia d i Kennedy; HD= malattia di Huntington; HDL2 =malattia Huntington-like d i t ipo 2; DRPLA=atrofia dentato-rubro-pallidoluysiana; SCA1 = atassia spino-cerebellare di tipo 1; SCA2=atassia spino-cerebellare di tipo 2; SCA3/MJD=atassia spino-cerebellare di t ipo 3/malattia di Machado-Joseph; SCA6=atassia spino-cerebellare di tipo 6; SCA7=atassia spino-cerebellare di tipo 7; SCA17=atassia spino-cerebellare di tipo 17.

Promotore

OPMD, SPD, CCD, HFG, HPES, BPES, CCHS, MRGH, ARX

(GCN, ripetizioni imperfette)

FIGURA 15.5 - Patologie genetiche dovute a mutazioni dinamiche di sequenze comprese all ' interno d i esoni e codificanti per tratti di polialanina (poliA). OPMD=distrofia muscolare oculo-faringea; SPD=sinpolidattilia di tipo 2; CCD=displasia deidocl!'nica; HFG=sindrome mano-piede-genitali; HPES =61ì>prosencefalia di tipo S; BPES=blefarofimosi ed epicanto inverso; CCHS=sindrome da ipoventilazione centrale; MRGH =ritardo mentale con deficit di GH; ARX=spettro fenotipico delle mutazioni del gene ARX.

X-linked (il Box 15.1 ), elencate nel si to Internet http:// xlmr.interfrec.itlhome.htm, e sono attualmente noti 90 eni XLMR (X-linked Più nota

.. .e delle cond1z1on1 XLM R e k§1ndrorn d e p1u comun ) e cl X fragile (FXS . . er 1943 il neurologo James Martm e gcnetistaJulia

ll-d . ro il caso d1 una grande fam1gl1a mgl-. Be escrtsse . . . . ... · maschi rnardau mentali che per anni ha r numerosi , MR h h a · l'archetipo dell XL e c e a dato orio;._ presentato . . B li "'""' all' nimo sm4!f2Eie dr e . , .

el I 969 erbert Lubs un altra famiglia con XLMRe notò nei maschi ti fenomeno della fra il. - del cromosoma X m cornspondenza della band g na dall .. .. a Xq27.3 (Figura 15.6a); a ora SI •.parlare

comunemente di FXS. Qualche anno p1u tardi si Poté accertare che tale fenomeno era presence anche in alcuni mascpi della famiglia stud1arn da Marun e BeU e dunque si conç!use che la sindrome d1 Mart11'1.cBell e la F .sono la stessa cosa. L'accertamento c1togeneuco del in Xg27 .ffFRAXA) ha rappresentato a test di laborato-rio di conferma del sospetto diagnostico d1 FXS, fino a quando nel 1991 tre gruppi di ricerca ind.ipendenti hanno identificato il gene FMRJ , la cui mutazione causa FXS. Quest'ultima scoperta occupa un posto significativo nella , storia della generica, in quanto descrive per la prima volta una mutazione dinamica, cioè una mutazione che tende a modificarsi nel passaggio da una generazione all'altra. La FXS è la forma più comune di ritardo ron una prevalenza stimata nella popolazione generale di 1:4000 pér i maschi e 1:6000 per le femmine.

Fenotipo clinico

ei..!!!aschi, la sindrome si presenta con ritardo mentale di rado_variabile, nella maggior parre dei cas1<lilìVello medio-grave. LI ritardo mentale esordisce di norma come ritardo dello sviluppo psicomotorio, in particolare della deambulazione autonoma e del linguaggio. TI fenotipo comportamentale è caratterizzato da iperattività, difetto <Ii attenz1oae, stato d'ansia, evita mento dello sguardo, mo-vimenti stereotipi come per esempio l'agitare le mani. li fenotipo fisico può essere molto sfumato, specie alla nascita e nella prima infanzia, quando le uniche note di rilievo possono essere una macrocefalia un modesto eccesso c:.:iltezza, ipotonia e iperlassità artico are. Tipicameme, il maschio adolescente o adulto presenta alta statura, macrocefalia relativa, viso lun o .e

fronte e mandibola prominenti, stanza gli occ!ii (i otelorismo), ipoplasia della regione ztgomanca, Qrecchie grandi, palato ogivale, aumento dd volume testicolare (macrorchidismo) e persistente ip<>!O-rua muscolare generalizzata (Figura 15.6b). . Come verrà spiegato successivamente, anche le femmine possono un fenotjpo clinico, di solito più lie>t d! quello dei maschi e caratterizzato da sviluppo cognllJ\'O aJ · d U d' eotO . """''°" e a norma, difficoltà di appren un d' scolasaco, carattere timido e introverso. Non ci sono i

BOX 15 1 - RITARDO MENTALE X-LINKED (XLMR)

Tra 1 t1p1 d1 ritardo mentale (RM) monogemco, quello n-conduob1le a mutazioni in geni localizzati sul cromosoma· X (X-Llnked Menral Retardation o XLMR) è certamente il più studiato e 11 più frequente Già nel 1938 Penrose aveva md1v1duato un eccesso di maschi fra i soggetti con RM pan a

SHROOM4 ( KIAA/202) KDMSC (JARID I C)

IQSEC2

MIDI HCCS OFDI

FANCB APIS2

ARX ILIRAPLI

OMO MAOA

NDP ZNF674

ZNF41

Capitolo 15 • Malattie da mutaz1om dinamiche 247

orca 11 25% e, nel 1974, che tale eccesso di maschi fosse dovuto alla presenté d1 numerosi gern locailzza-t1 sul cromosoma X, il cui mancato o alterato funzionamento può causare RM, accompagnato o non da malformaz1on1 o difetti congemt1.

223 NLGN4

NHS CDKLS (STK9) PDHA I

221 RPS6KA3 (RSK2) MHTPS2 SMS

OTC TM4SF2 BCOR ATP6AP2 SYNI CASK ZNFBI

FTSJI SMCIA (SMCILI) -----------! PORCN

HSD /78 10 (HADH2) HUWEI

PHFB FGDI

DLGJ MED/2 NLGNJ

1121

SLCl6A2 (MCTB) ---""

SRPX2) nMMBA

NXFS PLPI

FMR2 IDS ND(JFAI

MTMI LAMP2 SLC6AB CUL48 ABCDI LICAM MECP2

FLNA RPLIO

GDll IKBKG DKCI

RAB398

PQBPI SYP

ARHGEF9 OPHNI

13.1

KIAA2022

ATRX MAGTI ATPlA PGKI BRWDJ ZNFlll

ACSL4 PAKJ DCX AGTR2

GRIAJ OCRLI

GPC3 ZDHHC9 PHF6 HPRT SLC9A6 ARHGEF6

i:t.tl?Ji;)li.i;i.I.lftlj,lf.!ljjli'l9i·iblfai.Jltttltii@ tz neuromuscolare, mentre m blu sono 1 20 Qeni °",,. assooano a RM isolato (XLMR non specifico o MRX)

importante ricordare che alcuni geni XLMR <ARx. MECPi RSKZ. etc.) sono co1nvolt1 sia nella patogenesi d1 ferme 'P<-cifiche (sindromiche o neuromuscolari) sia non sJlcifich,

X) 1 arucolare 11 gene ARX è stato trovato mutato illustrato nella Figura 5 15 Alcuni casi d1 portatrici affette. (MR · n P f 1 M RX e in tutte la stessa occasionalmente nscontrati. sono probabilmente dovuti a11'1nat- "' almeno 8 grandi amig te mutaziorie

Come nel caso d1 altre patologie monogeniche legate al cromo-soma X, l'XLMR si trasmette per lo p1u con modalità recessiva. per cui negli alben genealogici s1 evidenziano soggetti maschi affetti collegati da femmine portatno sane e non s1 venf1ca mai una trasmissione masch10-masch10 (da padre a figlio). come

tivazione preferenziale del cromosoma X normale rispetto a ricorrente (una duplicazione di 24 bp) è responsabile del RM quello con l'allele mutante. "' La stessa duplicazione intragenica è stata però La prevalenza totale dell'XLMR è stimata pan a orca 1 su 600 in pazienti con le cosiddette "sindromi" d1 West e d1 Parting. maschi. La sindrome X fragile è la forma più comune rappre- ton, due distinte condmoni neurologiche caratterizzate da sentando circa il 15% di tutti i casi d1 XLMR. Finora sono stati RM e. rispettivamente, spasmi infant1h e distonia. 1dent1ficat1 90 geni le cui mutazioni causano XLMR La Figura troncanti o ampie delezioni del gene che aboliscono la fu1121one riporta la localizzazione dei van geni XLMR noli, distr1bu1t1 \ della proteina corrispondente sono invece causa della molto lungo futto 11 cromosoma X, co'n una densità particolarmente '-Più rara condizione nota come XLAG (X-hnked alta nelle regioni Xq28 e Xp 11 . Considerato che 11 numero w1th Ambiguous Genitaha). caratterizzata da lissencefaha. RM totale di geni del cromosoma x è pari a orca 900 (si veda la gravissimo e amb1gu1tà dei genitali Tabella 1 1 ), la frequenza d1 geni responsabili di XLMR è pan Una Situazione simile è stata osservata per 11 gene MECP2, almeno al 10% del totale. Tale alta frequenza ha portato a cui mutazioni troncanti o delezioni SI as90C1ano a un quadro li ipotizzare che sul cromosoma x si sia accumulato un numero XLMR dominante, letale nei maschi, noto come sindrome di d1 geni importanti per 11 funzionamento intellettivo, anche se Rett Tale condizione è caratterizzata da una perdita ptbgres-le cause di tale accumulo non sono state chiarite e rimangono s1va delle acquis1z1on1 psicomotorie raggiunte dopo 1-2 anni ma tena di speculazione (deambulazione. hnguagg10). La sindrome è ingravescente e• la presentazione clinica delle diverse forme d1 XLMR è vana- caratterizza per RM grave. autismo, stereot1pte motone. atasS&a bile a seconda del gene mutante e del diletto proteico corri- ed epilessia. Per contro, mutazioni missenso nella pomone spondente. Nella Figura, i 90 geni XLMR sono 1nd1cati con colon carboss1terminale della proteina sono responsabili d1 XLMR differenti proprio a seconda della presentazione: in nero sono recessivo e possono ritrovarsi in figli maschi d1 portatna sane 1nd1call i 40 geni responsabili d1 una vera e propria sindrome Per approfondire questo argomento SI suggerisce la seguente (RM accompagnato da malformazioni in d1vers1 organi e appa- referenza: Ch1urazz1 P et al. XLMR genes: update 2007 Eur J rati). 1n viola 1 30 geni che oltre al RM causano una patologia Hum Genet 2008, 16:422-434.

'-FIGURA 15.6 - Il sito fragile FRAXA visto al microscopio elettronico sul braccio lungo del cromosoma X (a). Fenotipo facciale di un paziente con sindrome del cromosoma x fragile Si notino il con fronte SJ?aziosa, l'ipoplasia · malare (regione zigomatica). le orecchie grandi e antiverse (b).

solito manifestazioni fisiche paragonabili a quelle <kr m aschi, salvo che nei casi più gravi. Alla risonanza magnerica cerebrale si può notare uru diminuzione del rapporto fra sostanza bianca e sostam2 grigia, aumento di volume del nucleo caudato e dell'ip-pocampo, ipoplasia del verme cerebellare e conseguen1c ampliamento del rv ventricolo.

Gene e mutazione

ome già il gene responsabile della rsx e FMRl, localizzato in Xq27 .3. Si rrana di un mente conservaro nelle diverse specie studiate. E coin-posro ?a 17 esoni che occupano quasi 40 kb di DNA

e codifica un mRNA di 4,3 kb. ella rradorta del primo esone è presente una sequenzl

çGG, il cui numero varia soggerti a mcirca fra 5 e 45, con una moda intorno a JO. N quasi roralirà dei soggetti con f'X la mutazione (OltSblt nell 'amplifi · d' I I 2CMJ tO I cazione 1 u esta se uenza o tre e lli_ette J mutazione comeleta), fino a più di 2()00 (fi 15·7>· li superamento d c lii! soglia di 200 tripleue CO"'

+-- S,2kb

+-- 2,Skb

2 3 4 5 6 7 8

FIGURA 15.7 - Analisi molecolare del DNA mediante Southern blotting e ibridazione con sonda specifica per il promotore del gene FMR1 dopo digestione del DNA genomico con gl i enzimi di restrizione Hindlll ed Eagl. I due frammenti da 5,2 e 2,5 kb corrispondono rispettivamente al cromosoma X inattivo e attivo senza espansione della tripletta CGG. Le bande al d i sopra di quelle indicate sono patologiche. Corsia 1 = maschio affetto con mutazione completa metilata; Corsia 2=femmina normale; Corsia 3 =femmina portatrice di premutazione; Corsie 4 e S=maschi normali (con solo un cromosoma X attivo); Corsia 6=maschio portatore di premutazione; Corsia 7=femmina con mutazione completa metilata; Corsia 8=femmina con premutazione di grandi dimensioni (presente soprattutto sul cromosoma X inattivo).

22!!ll1na metilazione com p rese quelle del promoto re immediatamente a monte dell'espansione, e in e<>nseguenza di ciò un blocco della trascrizione del genee quindi <leua p roouz1one della proteina FMRP. Si ritiene che l'assenza di FMRP inneschi una seq uenza di eventi, ancora da caratte rizzare, il cui risultato finale è il fenotipo della sindrome e in p rimo luogo la sua manifestazione più tipica, ossia il rita rdo mentale. La FMRP è una proteina che lega-l'RNA, soprattutto a livello polisomiale, inibendo cosi l'attività di a ltri geni ancora da identificare. <'.)uesta azione si svolge con particola re intensità a livello delle sinapsi in tutto il sistema nervoso centrale, regolando ve· rosimilmente la risposta al rilascio dei neurotrasmenito ri a livello post-sinaptico.

BOX 15 2 · Il PARADOSSO DI SHERMAN

In vinù del loro espandersi nel passaggio da una generazione all'altra, le mutaz1001 d1nam1che hanno finalmente spiegato 11 fe-.!!2!neno dell'anticipazione, evidente soprattutto nel caso della dostmtia m10tomca Nel caso della sindrome del cromosoma X fragile, i fenomeno dell' ant10paz10ne si manifesta come aumen-1o cl 95! affetti con il 9eneraz1on1, ben dtmostrato dal P8digiee nportato nella Figura 15.8. Si può notare che nelle Pllme due generazioni non c'è nessun caso d1 FXS, ci sono solo 2 cast SU 13 nella terza e ben 5 su 11 nella quarta Stephanie Sher-

Capito lo 15 • Malattie da mutazioni dinamiche 249

FIGURA 15.8 - Pedigree di una famiglia con sindrome del cromosoma X fragile. A causa della mutazione dinamica e dell'espansione progressiva della tripletta CGG nel promotore del gene FMR1, la frequenza di pazienti con mutazione completa (simboli in blu) è maggiore nell'ultima generazione rispetto alle precedenti, dove sono presenti più portatori di premutazione (simboli in viola) senza ritardo mentale.

Una mutazione co'EPleca n,Q!!jpso rge mai su un allele normale. E semp re necessaria una tappa interme-d ia, ossia ITPassaggio attraverso una preiiiUìaZione, che si cararre n zza p,er la 12.resenza rutrrrnumefOaUme!1tato ..di..r.r.i.plet te variabile ill ' incfrca r ra 60 e 200, cbe conferiscono all'allele un'aumentata instabilità e tendenza all 'espansione. Questa modalità di trasmiss.io ne e reditaria fa sì che nelle famiglie in c ui segregano la premutazione e la mutazione completa di FMRl , i caM di soggetti affe tti tendano ad il passare d e lle generazio ni (Figura 15.8), feno m'=.nE q uesto che p rende il no me di paradosso di Sherman (Box 15.2). Gli alleli premutati non sono metilaci, f unzio nano no r-malmente e garantiscono una su fficiente p roduzio ne d i FMRP. I portatori di premutazione, sia maschi sia fem -mine, non presentano d unque rita rdo mentale. L'instabi-lità delle rem utazioni si nella meiosi non in quella maschile), per c;;i se portatrice di p remurazione trasmette alla propria discen-denza l'allele espanso, vi è un'alca p robabilità (tanto più alta quanto più wande è la p remutazione) che questo si espanda ulteriormente fino a diventare un allele comple-ramence mutato, metilato e quindi inattivo (mutazione completa). In a ltre parole , p.ortato ri di p remutaz io ne

sani e figliey orcacrici de lla stessa

man descnsse questo fenomeno pnma che fossero conosciuti 11 gene FMR 1 e la natura dinamica della sua mutazlOOe, facendo notare che nelle famiglie affette da FXS i fratelli delle donne por-tatna sono sani 1n proporrone superiore ali' atteso, mentre 1 figli delle portatno sono affetti nella proporzione attesa (paradosso di Sherman). Tutto è diventato dl&aro quando si è sccperta fi15fabt. htà delle premutaZIOnl di FMR 1 e la loro propensione a dMentan! mutaz1om complete nel passaggio attraverso la gametogl!IM!SI femminile, ma non attra.erso quella maschile.

Viceversa, femmine con premutazione o mutazione completa hanno un rischio fino al 50% di generare con mutazione completa: se sara,;;;o avranno inevitabilm;:;'te fo FXS se rlsUJreranno moderatamente affe;te solo in un terzo dei casi circa. E opporru;:.o spiegare più in dettaglio questo fenomeno: in una malattia X-linked dovuta alla mutazione cli un gene recessivo ci si attenderebbe che la portatrice della mutazione fosse invariabilmente sana, grazie alla compensazione da parre dell 'allele selvatico. el caso della FXS, lapparente eccezione a questa regola si spiega invocando un'inattivazione sbilanciata del cromosoma X. Nel Capitolo 5, dedicato all'ereditarietà mendeliana, si è già accennato a questo feno meno: per compensare la presenza di un solo cromosoma X nel maschio, nella femmina uno dei due cromosomi X viene inattivato già dalle prime fasi dello sviluppo embrisnale. L'inattiva-zio ne è di norma casuale, interessando nel 50% delle cellule il cromosoma X paterno e nell'altro 50% quello materno. Occasionalmente, l'inattivazione può interessare prevalenremenre uno dei due cromosomi X. e dunque in una po rtatrice di mutazione completa fosse inartivaro preferenzialmente il cromosoma X con l'allele nonnale, il meccanismo della compensazione verrebbe meno e quella portatrice risulterebbe affetta.

SINDROMI DA PREMUTAZIONE DI FMR1

Menopausa precoce

La menopausa precoce, definita come cessazione com-pleta dei cicli mestruali prima dei 40 anni in presenza di livelli elevati di FSH, è un fenomeno che si osse rya nell' l % circa delle donne in età riproduttiva. Una serie di stucli ampi e documenrati nell'ambito delle famiglie con FXS ha climostrato che fra le portatrici di premutazione la frequenza di menopausa precoce è stimabile intorno al 20% . Viceversa, non c'è menopausa precoce fra le portatrici di mutazione completa. A livello cellulare/molecolare il fenomeno non è ben ca-ratterizzato e tanto meno spiegato. Le donne premurate che ancora hanno cicli regolari sembrano avere livelli ematici cli FSH devati, mentre quelli di inibina A e inibina B sarebbero climinuiti. Non è chiaro se vi sia correlazione fra lunghezza della premutazione e rischio di menopausa precoce. Di fatto, nella maggior parte dei casi si osserva un numero di triplette compreso fra 75 e 100, mentre sono rari quelli in cui tale numero va oltre 100.

Sindrome da tremori e atassia

Come ricordato sopra, i m"\chi portatori di non hanno ritardo mentalé,\hsponendo di una quanma sufficiente di FMRP. In realtà la produzione di questa pro teina è leggermente inferiore alla norma, poiché la traduzione di un mRNA premurato è meno efficiente cli

ell d . n mRNA normale. Q uesta ridotta effici q_u a_ ' u re compensata da una maggiore produzenza viene m par d li . ione di mRNA. Si tratta di un ettag o un portante, in quanto

, . e la sindrome da tremon e atassia (Fragil )( puo spiegar FXTAS) Il · e Tremor-Araxia Syndrome, a a quale ' maschi

· di premuraz1one possono andare incontro portatori . . . · La sindrome consiste m tremore Intenz1onale, atassia ' con problemi di bilanciameM? e cadute_ freq_uenti, più raramente perdita d1 sens1bd1ra agli a_m A ciò

poi associarsi problenu cognmv1 e d1 memoria, fino a d!l vero e proprio staro d1 demenza. Alla risonanz. magnetica cerebrale, l'unico_ reperto s1gmfica t1vo prec0ce consiste in un' ipenntensa a del cerebellare med io anche se in fase avanzata s1 puo notare una dif. fusa atrofia corticale. Alcuni dati autoptici mostrano la presenza di inclusion_i in_rranucleari in cellule neuronhli e astrocitane. C10 suggensce cl1e la patoll!'nesi della FXTAS sia da mettere in relazione con un 'ecces. siva produzione di mRNA, come rico rdato sopra, alla precipitazione del medesimo all' interno del nucleo, alla formazione d i corp i inclusi con effetto e infine alla morte cellulare. Il rischio d i essere colpiti da FXTAS è del 30% circa incorno ai 50 anni, ma aumenra p rogressivamente con l'avanzare dell'età; tuttavia la sindrome difficilmente si manifesta se il numero di tr iplette CGG è inferiore a 80. Nella maggior parre dei casi, i maschi affetti da FXTAS hanno un numero d i triplette compreso fra 80 e 100. Anche le femmine portatrici d i premutazione possono risultare affette, ma assai più raramente.

DISTROFIA MIOTONICA

Cenni storici ed epidemiologia

La distrofia miotonica (DM) è una condizione auroso· mica dominante cbe per anni ha affascinato neurologi e genetisti, eludendo i loro tentativi di dare una spiegazione razionale a certe sue caratte ristiche clinico-genetiche. Soltanto la recente scoperta dei geni che ne sono alla base e dei rispettivi meccanismi mutazionali ha permesso di comprendere quei fenomen i che prima apparivano inspiegabili. Descritta per la prima volta da Steinert nel 1909, e per questo chiamata anche malauia di Steinert, è considerata la più frequente fra le distrofie muscolari a ereditarietà autosomica (l' incidenza è cli circa 1 su 8.000 nati), anche se il coinvolgimento muscolare rappresenta solo un aspetto di quella che a buon diritto deve esse re considerata una malattia multisisremica, che interessa anche il cuore, la muscolatura liscia, il sistema nervoso centrale, l'occhio e le

endocrine. Pur potendo colpire soggetti di l"'. ec_a, il suo esorclio è tardivo (non prima della terza di Vlt_a) nella maggior parte dei pazienti e il quadro chn1".1 vana ampiamente fra casi gravi specie quelli a esordio P'0

precoce, e casi talmente lievi da essere soggertivarnente percepiti come manifestazioni di malattia.

Nelle famiglie in cui segrega la malattia, l'età di esordio diminuisce, fino alle forme congenite, con il passare delle generazioni, mentre aumenta la gravità delle manifestazio-ni cliniche. È questo il fenomeno dell'an ticipazione. dei più grandi genetisti del XX secolo, Lione! Penrose sbagliò clamorosamente (ma giustificatamente, date conoscenze dell'epoca) nell'attribuire il fenomeno dell'an-ticipazione a un vizio di accertamento e a un basso indice di correlazione nell'età di imorgenza fra genitori e figli. Oggi s1 sa che, invece, questo fenomeno è dovuto alla natura dinamica della mutazione.

Fenotipo clinico

Come già ricordato, la DM è una malattia mulrisistemica ma con prevalente compromissione muscolare, che si manifesta come debolezza della contrazione muscolare e ritardo del suo rilassamento (miotonia). li fenomeno della miotonia è avvertito soggeccivamente come senso di rigidità muscolare e può essere apprezzato oggertiva-mente per esempio chiedendo al paziente di rilasciare rapidamente una stretta di mano. 1 muscoli maggiormente interessati sono quelli della faccia, con conseguente ami-mia e aspetto scavato del volto, e quelli delle estremità. La compromissione della muscolatura liscia può causare disfagia e sintomatologia colitica, mentre quella della muscolatura cardiaca si manifesta di solito in difetti della conduzione e quindi in aritmie. Si possono osservare an-che disturbi comportamentali come sonnolenza, apatia e talvolta deterioramento della personalità. A livello oculare il difetto più frequentemente osservato è la cataratta'. e_ a nvcllo degli annessi cutanei la calvizie frontale. I poss1bil1 disturbi endocrinologici sono rappresentati dal diabete e da un'atrofia.dei tubuli seminiferi del testicolo. Le manifestazioni descritte compaiono di norma a un 'età compresa fra i 20 e i 40 anni. Fanno eccezione le più gravi forme congenite, solitamente trasmesse _ç[alle ma-dri ca(anerizzate da ipotonia muscolare

debolezza dei muscoli della faccia, difficoltà ad alimentarsi e ritardo mentale.

Geni e mutazioni

Per anni la DM è stata considerata una malatti? <jinica-mcnte variabile ma geneticamente omogenea, ossia ?ovuta

. . . I Recentemente e stato a mutazione d1 un smgo o gene. . . . . d usale per cu1 oggi SI invece scoperto un sccon o gene ca : . ) parla di DM di tipo l (DMl) e di DM di_ upo 2 (DM2 · Dal punto di vista clinico, la DM2 differisce dalla IDM 1 solo per un maggiore interessamento della musco atura

. d !mente meno grave. prossimale e per un ecorso genera DM PK La forma DM l è dovuta alla mutazione dcl gene ' localizzato sul braccio lungo del cromosoma 1.9 09q13 ·3 ), h . . h . · (DMPK) S1 tratta d1 un e e codifica una protem-c masi · d

gene di 15 esoni contenente nella ponione 3' non tra. otta dell'ultimo esone una sequenza di triplette CTG, il c111

Capitolo 15 • Malattie da mutazioni dinamiche 251

numero è inferiore a 50 nei soggetti nonnali. Nei soggetti asintomatici, ma portatori obbligati della mutazione, e in quelli con manifestazioni inime il numero di triplette varia fra 50 e 80. Negli adulti con manifestazioni tipiche della malattia questo numero è generalmente compreso fra 100 e 500, mentre nei casi congeniti si può osservare un'amplificazione delJa sequenza fino a oltre 4000 triplette. Se si segue la mutazione in famiglie multigenerazionali, è del tutto evidente che i casi lievi, a esordio tardivo, e con amplificazioni piccole della sequenza CTG, si trovano neUe generazioni più alte, mentre quelli gravi, a esordio precoce (fino alle forme congenite), .e con amplificazio-ni grandi della sequenza CTG, si trovano nelle genera-zioni più giovani (Figura 15.9). Esiste una correlazione diretta fra numero di triplette e gravità della malattia. Il fenomeno dell'anticipazione si spiega dunque sulla base dell'instabilità della sequenza CTG, che si amplifica a ogni passaggio generazionale. La forma DM2 è dovuta a mutazione del gene ZNF9, localizzato sul braccio lungo del cromosoma 3 (3q2 l),

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FIGURA 15.9 - Analisi molecolare del DNA mediante Southern blotting e ibridazione con sonda specifica per la 3' UTR del gene DMPK1 in una famiglia con 1. Ogni è stato caricato due volte e la sua pos1Z1one nel pedigree è indicata nell'albero genealogico riportato sopra la foto della lastra autoradiografica. La banda più bassa comune a tutti è quella normale corrispondente ad. alleli con un numero di triplette CTG compreso !'o.rmale. Le bande più alte corrispondoryo ad d1 diverso grado della tripletta CTG (alleli espansi). S1 noti inoltre_ che . all'interno dello stesso campione di DNA sono presenti alleli con amplificazioni _d_iverse; ques_to so'!latico è dovuto all'inrtab1htà anche m1tot1Ca (post-z1got1.ca) della mutazione dinamica. L'amplificazione maggiore si ha nella terza generazione, dove il soggetto 111-1 è affetto da DM1 congenita.

252 Parte Il • La geneuca nella pratica clinica

che codifica la proteina Z F9, una proteina zinc-finger con capacità di legame per gli acidi nucleici. La mutaz10· ne consiste nell 'amplificazione di una sequenza di qua· druplette CCTG, tra critta ma non tradotta, localizzata neU'introne 1 del gene. Mentre non è nota con esattezza la dimensione degli alleli normali , è invece noto che le amplificazioni tendono a essere molto grandi, fino a 5000 ripetizioni , nonostante il quadro clinico della DM2 sia generalmente meno grave di quello della DM I, come già ricordato. Detto ciò, rimane da chiedersi quale sia la ragione per cui mutazioni eterozigoti che i1ueressano porzioni non codificanti dei rispettivi geni siano patogenetiche. Sono state fatte diverse ipotesi. La prima è che il trascritto mu· tante, date le sue cospicue dimensioni , venga tradotto con scarsa efficienza, configurandÒ di fatto una condizione di aploinsufficienza. Questa ipotesi è stata ben presto smentita dall'evidenza che topi knockout, cioè deleri per uno de.i due alleli di DMPK e quindi veramente aploin· sufficienti, presentano solo una lieve miopatia e non un quadro clinico sovrapponibile a quello della DM l. ln base a una seconda ipotesi , l'amplificazione a cari-co deUa equenza di triplette CTG nell'ultimo esone di DM PK, causerebbe una ridotta espressione del gene im-mediatamente a valle, SJX5, e di altri geni vicini. Questa ipotesi, proposta prima della scoperta della DM2, è stata almeno in parte abbandonata in seguito alla constatazione che a valle di ZNF9 non ci sono geni ortologhi di S/X5. Al massimo, all' inattivazione di SIX5 si potrebbero im-putare que.i segni di deterioramento del sistema nervoso centrale che si osservano nella DM I ma non nella DM2. L'ipotesi oggi più accreditata è che la DM! e la DM2 siano

BOX 15 3 ·LA MALAITIA DI HUNTINGTON

The hered1tary chorea, as I shall cali 1t, is confmed to cena1n and fortunately few families. and has been transm1ned to them, an heirloom from generauons away back in the dim past. lt IS spoken of by those in whose veins the seeds of the disease are known to ex1st, with a k1nd of horror. and notatali alluded to except through d1n! necessrty when rt 15 men!loned as "that dlSOlder. • I! is attended generally by ali the symptorns o! common cho<ea only in an aggravated degree, ever hardly manilestmg itseli until adult or .middle hfe. and then cormng on gradually but sutely, 1ncreasing by degtees, and often occupying years in l1s deveiopment. untzl the hapless sufferer is but a qurienng wreck of his former sei!. Then! an! three rnalted pecuhanties of this disease: l, its red1tary natun!; 2, a tendency to insanity and suicide, 3• lts manliestzng rtseff as a grave dis8se only in adult hl (1) Of llS heredl!ary nature. When etlher or both of :e tia-.e shown manliestations ot the disease I I Pilents the u.-- ..i--'>-.. • · · · one or more of o .. ,,.. • .,. -·"'""l.nvariibly suffer from the dosease 11 llve IO adull age. Bui il by lK'f chance the5e chìldren • they llfe without il. the thread 15 brolten and the 90 tlwough 9'andclildren and

ticamente in quanto 1n entrambi 1 e d . RNA contenenu lunghe sequen,.e di cucas;

trascritti 1 all'interno dei nuclei delle cellule d 0

CUG forrnl anoroteici che a loro volta altercrebber •11

1. · ·b nuc eop ' . o o 10CI " odi al ·RNA e quindi l'espressione di altri gt'll splicmg trl '( 1.

' MALATTIA DI HUNTINGTON

. torici e d epide miologia Cenn1s --- I · di ti unlir!&.ton (nota anche come corea d

La ma a_!!!.lL.- I · · h .,- - ' li tingJOll) è una delle ma atue e ptu

dlJP

0· pei:.la. ua melunabJ.!.!.!.!!, per la gravità de· e e.'ll!Stan d. I . . er la totale mancanza t ç_ure e per la tragicità d · ·d jf . del.suo non J:a _o_ comc1 e con suicidio

del paziente. La classica descnz1one che_ ne fece George Hunti.;&ion nel 1872 è u_n vero e propno pezzo_ di bra. vura scientifica e letteraria che_ merita d1 essere m pane riprodotto nella sua for":'a ortgmale 15.3). Per i genetisti, la malattia d1 ti untmgton ha da sempre rappre u_n importante d1 mal_attia, au. tosom1ca autenttcamente (11 fenotipo degli

-;;(e<ozigou non 1fféfìsce da quello degli omozigoti come mostrato nella Figura 15.10) a penetranza completa con qualche rara eccezione) e con bassissima frequenza di nuove mutazioni. La ua prevalenza nelle popolazio-ni euro ee occ· tali e in quelle da esse discendenti è stimata intorno a 3-7:100.000 e si ritiene che la maggior parte di questi casi siano riconducibili a una mutazione awenuta in candinavia nei secoli passati. La malania esiste anche in altri gruppi etnici o per effetto di nuove

great-grandchildren of the originai shakers may rest assured that they are free from the disease [ .. ]. Unstable and whimsical as the d1sease may be in other respects, in th1s it is firm, it never sk1ps a generation to aga1n manifest itself in another once hav1ng y1elded its cla1ms. it never regains them [ ... ]. , The tendency to insani"' d . wh h le •1• an sometimes that form of msarnty

1C ads to suicide 15 marked [ I the m· d bec • · · · · As the disease 111 omesmor 1 · to insani wh 1 . e or ess impaired, in many amounting until de. rer I e mthemothers mind and body both gradually fait ... ieves of their sufferings [ · ] '"' third pecuharity is lts co . . ... begins as an ordina ho mmg on· · · only m adult hfe [ ... I I! 5Pa5modic , ... __ oryf e rea might begin, by the 1rregular and

Certam muscle These lllOVements graduai s, as of the tace, arms. etc unaffected take on the ly mcrease'. when muscles hlthertO the body becomes aff 5PaSmodic actlon, until l!Ver'f muscte in the PllOr patient (except the involuntary ones). and ..,,__, a • .....,._ ,_ ,._.ng to Witness 1 h which is anyth1ng but •meliorat10n of ave known a recovery or even an n begins lt d. oms in this form of ..._ ____ .......... -

ings to the bitt '-'IUf""· "'""' ... -Gecrge H1111- er end [. .. ]. -.,, ..... 1872

Capitolo 15 • Malattie da mutazronr drnamrche 253

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IV

V

V1

FIGURA 15.10 - Albero genealogico di una famiglia in cui segrega l'espansione del gene ITl 5, responsabile della malattia di Hunt ington. Al di sotto del simbolo dei soggetti testati è riportato il numero di triplette CAG e, fra parentesi, I portatori obbligati sono indicati con simboli a bersaglio. Il soggetto IV-1 è affetto in forma lieve (tic facciali e modesti movimenti coreici); V-3, figlia di IV- 1, benché omozigote per la mutazione, è ugualmente affetta in forma lieve, e sua figlia, non sintomatica a 13 anni, è portatrice obbligata della mutazione; il soggetto IV-5 è ancora asintomatico a 67 anni; IV-9 presenta il quadro classico della malattia.

mutazioni o perché introdoua da individui provenienti dall'Europa. Merita di essere ricordata l'altissima preva-lenza deUa malattia in un piccola popolazione insediata nei pressi del lago Maracaibo (Venezuela): lo studio di questa popolazione ha portato nel 1983 al mappaggio del gene sul braccio corto del cromosoma 4, primo esempio di mappaggio di una malattia umana attraverso i polimor-fismi di restrizione del DNA.

Fe!]otipo clinico

I primi sintomi deUa malattia possono comparire a qual-siasi età, ma neUa grande ma&&ioranza dei casi l'esordio e tardivo, fra i 25 e_i 6) anni, con un picco neUa decade che va dai 36 ai 45 anni. Sono molto rari i casi che hanno esordio nei primi 15 anni di vita, e altrettanto rari quelli che esordiscono dopo i 70 anni. "' La diagnosi di malattia di Huntington si pone solitamente rn presenza di: " • una storia familiare positiva, consistente con un'eredi-

1 taneta autosomica dominante; • una di ahilità motoria progressiva sia volontaria sia

involontaria· • un mentale.

!.., manifestazioni mo1ode sono inizialmente lievi e con-i.stono in ll(equicrezza, iperreflessia, movimenti oculari

•bnomu, movimenti eccessivi e inappropriati delle mani e dei p iedi. Successivamente compaiono i moviment i

involontari, che il riesce a sopprimere e che coinvolgono i muscoli mimici, del collo, deftronco e degli arti. Più tardivamente si ha bradicinesia, distonia e rigidità. Tutti i pazienti vanno inc_Q_n_tr:Q a un J>rogressivo deterio-I:llmento menta.le che si manifesta con rallentamento dei processi-psi-Jiici, diflicoltà di concentrazione e di atten-zione, perdita della memoria. Si associano spesso disturb i psichiatrici, sia deU'umore sia del comportamento. La TAC o la RM evidenziano come unico segno significativo e non _precoce l'atrofia del nucleo caudato.

' -Gene e mutazioni

J?opo la del gene deU!'_ malattia d i Hun-tmeton sul rnm1jel cromosoma 4, sono stati necessari altri d ieci anni di studiò e ricerca -per arrivare fi-nalmente aUa sua identificazione. /TI 5 (Important Transcript 15), è composto da 67 esoni che occupano 180kb di DNA genomico e codifica per la huntingtina, una proteina di 350kD (3.144 aminoacidi) espressa neUe ceUule del sistema ne"'OSO centrale e loca-lizzata nel citoplasma in associazione con microtubuli e vescicole sinaptiche. esone del gene è _eresente una sequenza di triplette CAG, a ciii'èomsrionde una sequenza poliglutan1inrca (poltQ ) nel prodotto proteico. Gli alleli normali comprendono un numero di triplette variabile fra 10 e.ì.5, e sono evidentemente .Udi molto s abili, vista la rarità deUc nuove mutazlonrQueste ultime

consistono nell 'a!!!R!ificazione della sequenza r!.E_etuta oltre le 36 rripleue. G li alleli comprendenti lUUllllllCTO di triplette fra 36 e.39 sono considerati allel i patologici a penetranza variabile, il che significa che in :ùcuni sog-gettT danno un quadro tipico della mala11ia mentre in altri rimangono silenti anche in età molto avanzata. 9_li

I · 1 m numero_di C,AG 4Q. e_l 20 sono francamente patologici e hanno pcnecr.mza Il processo di amplihcaz1one ha ovviamente luogo durante la gametogesi, sia maschile sia femminile. Diversamente da quanto accade nel caso della sindrome dcl cromosoma X fragile, le amplificazioni pit1 cospicue avvengono nel corso della spermatogenesi e pertanto le rare forme gio-vanili (più gravi) sono solitamente ereditate dai padri. Le tecniche di analisi dcl D A consentono di riconoscere gli alleli parologici mediante un .semplice test genetico (Figura 15.I l); l'analisi genetica deve essere tunavia ef-fettuata solo dopo una consulenza genetica accurata ed esaustiva. In primo luogo va distinto il caso in cui il test è destinato a confem1are la diagnosi clinica in un paziente già s intomatico (test diagnostico), dal caso in cui il test

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43

!

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Allelli normali

2 3 4 5 6 7

FIGURA 15.11 - Analisi molecolare del DNA per malattia di Huntington mediante PCR radioattiva con primer specifici a cavallo della tripletta CAG nel gene /TI 5. In ogni corsia (corrispondente a un si distinguono due alleli di dimensioni diverse, irffiicate con il numero di triplette CAG effettivamente presenti. I soggetti corrispondenti alle corsie 3, 4 e 7 hanno entrambi gli alleli di dimensioni normali, mentre gli individui corrispondenti alle corsie 1, 2, 5 e 6 hanno un allele normale e uno con la tripletta CAG espansa e hanno (o svilupperanno) la malattia di Huntington.

. ministrato a un soggeno a rischio, per viene_ som individuo affetto, ma non (ancora) smtoma. il figlio di un . questo secondo caso ogni sforzo deve . o Soprattutto IO I d u·· uc . h . il consenso a test espresso a lllteres.

essere fotto pere e 11senso informato (Box 15.4). sia un vero CO . c G . sato . logica de lle triplette A non 11.pe.

L'espansione e e la traduzione del gene, per cui gli di la rrascnz1on ' , sce. d al· ta·" di Hunrington producono un hunting.

-"em a m '1 " I I 'V'' h · ce da quella norma e per a presenza di una c e 1 ens t. o re d i glutamine e che evidentemente un>numero magg 1 · . esercita a livello cellulare un effetto e onunante negauvo. Le rotcine alterate, anche parz1a_lmente _degradate, ten. d P d , regarsi e a formare dci prec1p1tau sia nel cu0. ono a ,1gg . d I h.

!asma sia nel nucleo, ma non e e e taro se questi P · • bbi· • no un effetto protem vo, sequestrando aogregau " " . _a: 1·Huntingtina mutante, oppure un ultertore_<::.uetto nocivo, in 'quan to sequestrano anche altre prote ine come CBP (CREB Bind ing Protem), un fatto re d1 trascn z1one con rtività di acetilasi istonica che svolge un ruolo d1 grande

nella regolazione dell 'espre!sione genica.

MALATTIA DI KENNEDY (ATROFIA MUSCOLARE SPINO-BULBARE)

Cenni storici ed epidemiologia

I.: atrofia muscolare spino-bulbare (SBMA, Spino-Bulbar Muscular Atrophy) è stata descritta per la prima volta ncl 1968 da Kenncdy in due famiglie con 9 soggetti maschi affetti. Si tratta di una condizione relativamente benigna, compatibile con una normale sopravvivenza, a insorgenza tardiva compresa fra i 20 e i 40 anni. Centinaia di famiglie sono state studiate in Europa, Giap-pone, Canada e Australia, ma la p revalenza della condi-zione non è nota, anche se il tasso di mutazione è eviden-temente alto, considerato il riscontro d i aLneno 2 aplotipi fondatori distinti in ciascuna di queste popolazioni. Poco dopo l' identificazione della regione del cromosoma X associata alla malattia d i Kennedy, nel 199 1, fu riportata l'associazione fra la condizione e l'amplificazione dcl erano CAG nel primo esone del gene del recettore per gli andro-geni (AR) in Xq12 . La SBM A è quindi stata la seconda patologia da mutazione d inamica identificata in assoluto, soltanto due mesi dopo l' individuazio ne della tripletta CGG espansa del gene FMRJ nella FX S (si veda sopra).

Fenotipo clinico

p resentazione clinica all'esordio può essere molto va-n.abile e la SBMA viene talvolta confusa con altre patolo-gi_e neuromu colari come la sclerosi late rale amiotrofica, la

muscolare dei cingoli 0 anche l'atrofia muscolare a esordio tardivo nell' ado lescenza con ipertrofia

P?P_litea e aumentata creatinina chinasi serica. _la m alattia d i Kenned y si accompagna 3

fascicolaz10111 seguite d a ipotro fi a d ella muscolatura

Capitolo 15 • Malattie da mutazioni d1nam1che 255

BOX 15.4 - UNA DIFFICILE CONSULENZA GENETICA IN UNA FAMIGLIA CON MALATIIA DI liUNTINGTON

Lucia è una donna do 28 anno, sana. So presenta al consulente genetista insieme al manto Marco, anch'egli sano. d1 32 anno. non consanguineo. Hanno già un foglio, Gianluca, do 4 anni, un bambino che sta bene e non presenta alcun problema Lucia iNf!Va avuto sentore clella presenza do una malattia genetJca nella sua famogha, ma solo per vaghi accenno, perché nessuno ne voleva parlare. Scoltanto da poco è nuscota a sapere che diversi neurologi avevano etlChettato questa malattia come "corea· di Huntmgton. La diagnosi era stata fatta inizialmente sul nonno ma-terno di Lucia. morto sulCICia all'età do 56 anno. ma anche la madre ne è eviclenternente affetta, come ha potuto constatare la stessa Lucia, per la presenza di continuo movimenti della muscolatura momKa, che lei ncorda do aver visto anche nel nonno In realtà a Lucia sembra che quakhe sintomo ornziale sia presente anche nel fratello maggoore (35 anno); tuttavia vi è solo una diagnosi chmca, perché un test genet1Co non è mao stato eseguito Lucia, come le spiega ol consulente genetista. è a rischio do avere ereditato dalla madre 11 gene della malattia d1 Huntington e questo rischio è empmcamente st1mab1le do poco infenore al rischio a priori del 50% Infatti all'età do 28 anno solo una minima parte deo portatori della mutazione ha goà cominoato a manifestare 1 primi sintomi La pnma reazione d1 Luoa a questa 1nformaz1one è nch1edere subito l'esecuzione del test genetico. ma le viene fatto notare

perìorale, disfagia e segni dì insensibilità agli andro-geni (ginecomastia ìn assenza dì obesità e involuzione progressiva delle cellule dì Leydìg e dei testicoli). Nelle fàmìglìe inizialmente descritte da Kennedy, l'esordio delle fascìcolazìoni e della debolezza della muscolatura facciale e perit1rale era avvenuro intorno ai 40 anni , con disfagia e ginecomastia in alcuni pazienti, ma assenza dì segni neurologici piramidali o cerebellari. Successi-vamente sono scati evidenziaci nuovi casi con esordio nella terza decade dì vita, ipotrofia della muscolatura prossimale (e talvolta distale) degli arti, abbondàntì fascicolazioni dei muscoli periorali , tremore intenzio-nale e ginecomastia, con deficit ipotalamico ed eccesso di estrogen ì. ln molte famiglie sì osserva una lenta progressione dei sintomi con coinvolgimento asimmetrico dei !dunque con potenziale confusione con la sclerosi laterale amiOLrofìca), ginecomastia e impotenza, ma non necessa-riamente sterilità. In alcuni casi si rileva una neuropatia se,Jsìtiva distale, per cui la SBMA sarebbe meglio definita come una neuroparia sensitivo-motoria {con riduzione dell'ampiezza dei potenziali sensitivi), a differenza delle fanne di atrofia muscolare spinale. I segni 11p1C1 della malattia dì Kennedy sono dunque il coinvolgimento talvolta asimmetrico della muscolatura facciale e oro-faringea (innervata dai motoneuroni bul-barO, con crampi, fascìcolazìonì, disfagia e disartria, e la. ginecomastia con atrofia testicolare e impotenza. A differenza delle atrofie muscolari spinali, si ritrova inoltre

che sarebbe poù logico accertare pnma la mutazione nella ma-dre, fissando la d1agnos11n modo oncontrovert1b1le. Fatto oò. SI

potrà com1noare a drscutere, eventualmente con I' atuto di uno psKologo, sui pro e suo contro di un test che per Lucia sarebbe presintomatJco. che un test di noona1i1à sarebbe liberatorio, mentre un risultato patologico potrebbe causant forti ripercusSIOfli negatiw!, data rineluttabifitll della malattia e la sua incurabilità e data anche l'estensione del rischio al piccolo Gianluca, che in quanto minore non può comunque esseA! testato. Quindi ci sarebbero ragioni a fallO!e della deciSlone dt non eseguire 11 test. anche se la prima reazione dt Lucia e stata quella do volerlo fare D'altra parte, l'incertezza sullo stato di portatrice della mutazione lascen!bbe molti dubbi circa o1 nschio do ricorrenza della malattia, nel caso on cuo Luoa e Marco deci-dessero di avere altri figli. Quelli delineato sono 1 termini essenziali del problema. In realtà una consulenza di questo genere puO durare mesì, nchiedere incontri multlpli, eYentualmente con chiamata in causa d1 altri membn deUa famiglia, in alcuni casi con la sollecitazione do un parere da parte di un comitato d1 bioetica, sempre lasciando agio interessati il tempo e la libertà di cleodere e, se necessa-rio, cambiare la propria decisione Fono a quanclo, e sper;amo 11 pnma possibile. non si trovi una cura efficace per questa tembole malattia.

l'elevazione della creatin-chinasì serica ed eventualmente l'ipertrofia poplitea. Molto raramente il coinvolgimen-to progressivo della muscolatura distale degli arti e un esordio precoce possono causare la perdita della capacità di deambulazione autonoma. Un rarissimo caso di due sorelle omozigoti per l'espansione patologica (con padre affetto e madre portatrice) presentava un fenotipo lieve caratterizzato da crampi, leggero tremore delle mani, rare fascicolazionì dei muscoli periorali e degli sterno-cleidomastoidei. Comunque, nonostante la SBMA sia considerata recessiva, Kennedy stesso aveva riportato che molte sorelle dei maschi affetti lamentavano crampi muscolari.

Gene e mutazioni

L' identificazione dell ' espansione della tripletta CAG nella porzione codificante del primo esone del gene del

per gli a_ndrogeni AR, localizzato nella regìo-n.e pencentromenca del cromosoma X (Xql2), spiega soa la modalità dì trasmissione X-linked recessiva sia la parzì.ale ìnsensìtìvìtà agli androgeni con ginecomastia, defictt ipotalamico, involuzione delle cellule del Leydìg, 1potrof1a testicolare e impotenza. Mutazioni del gene AR che comportino la completa perdita di funzione del recettore degli androgeni (mutazioni di stop, delezioni del gene ecc.) sono tipicamente responsabili della sindrome di Moms o smdrome di/emmmili::zai zone testicolare, una

comune fonnn di pseudoermafroditismo maschile (si veda il Capitolo 28). Viceversa, l'espansione del tratto di poli-glutamina nella porzione nminoterminale del recettore per gli androgeni (già di per sé polimorfico con un nume ro variabile di 9-35 glutamine) causa probabilmente un gain of function (acquisizione di funzione). Le espansioni pato-logiche sono comprese fra 38 e 62 CAG. È stata osservata una parziale correlazione inve rsa fra grandezza dell'espan-

ed età. d 'esordio dei crampi muscolari , anche se non e presente il fenomeno dell 'ant icipazione come in altre patologie da mutazioni d inamiche. G li alleli patologici sono relativamente stabili a livello mitotico e non è stato possibile dimostrare alcun mosaicismo somatico, mentre a Uvello meiotico sono state riscontrate sia espansioni sia contrazioni della tripletta CAG. La realizzazione d i topi transgenici con copie del gene AR umano mutante ha dimostrato che inibendo con la leuprorelina (un analogo dell' LHRH ) il trasporto e l'accu-mulo nucleare del recettore (secondario alla stimolazione ormonale), si migliora la d isfunzione motoria negli ani-mali. Questa osservazione, associata alla considerazione de lla minore gravità della malattia nelle donne omozigoti (presumibilmente collegata al minore grado di stimola-zione androgenica), suggerisce la potenziale utilità di un trattamento dei sin1omi neuromuscolari con farmaci che inibiscano la produzione di testosterone.

ATASSIA DI FRIEDREICH

Cenni storici ed epidemiologia

I: atassia di Friedreich (FA, Friedreich Ataxia) o 1110/01tia di Friedreich è la sindrome atassica più frequente nelle popo-lazioni caucasiche con una prevalenza stimata di afferti pari a 1:50.000 (per una frequenza di portatori pari a 1:120), considerando insieme le fonne dominanti e recessive. La FA è dovuta nel 97 % dei casi all'espansione di una tripletta GAA nel primo introne del gene FRDA , com-posto da 5 esoni e codificante per una piccola proteina mitocondriale, la/ra/assina. La FA è invece estremamente rara nell 'Africa subsahariana e in As.ia, probabilmente per un effetto fondatore consistente nella genesi di una triplet-ta GAA ripetuta oltre 16 volte nelle antiche popolazioni indoeuropee. Infatti , la frequenza di po rtatori di alleli con più di 16 G AA è superiore al 15% nella popolazio-ne francese, è pari al 6% in una popolazione del Nord dell'India, men tre è pressoché nulla nell 'India centrale e nelle popolazioni asiatiche e dell 'Africa subsahariana.

Fenotipo clinico

La FA è una sindrom netica trasmessa con modalità recessiva, caratterizzata da insorgenza precoce (prima dell'adolescenza) e decorso rapidamente progressivo. I pri-mi sintomi generalmente appaiono nei bambini , ma l'esor-dio può essere mo lto variabile dall ' infanzia all'età adulta.

La perdita progressiva coordinazione dei e dcli 'equilibrio fanno st che dopo di solito nelfa terza decade d1 vtta, t l·A debbano utili7.zare una sedia a rotelle: Le ca!>aetta dt comunicazione sono compromesse dalla d1ffico!ta ad a'.'ttcolarc le parole (disartria). u quadro neurologico e complicato dalla diminu. zione 0 assenza dei riflessi degli arn mfenon e dalla di sensibilità propriocertiva, che si accompagnano a piede C::vo e scoliosi. In alcuni casi la perdita della vista per atrofia dci,nervi ottici e dell'udito aggravano uherionneme la disa. bilità. Le funzioni cognitive rimangono invece intatte. A differenza delle forme dominanti cli atassia, la FA è do. vuta a un deficit cli energia imputab ile al ruolo della fratas-sina nella fosforilazione ossidativa mitocondriale e quindi o ltre all' interessamento del sistema nervoso, si

cardiomiopatia ipertrofica che in alc uni pazienti può essète grave al punto di condurre a morte ptecoce per insufficienza cardiaca o aritmia (nella quarta decade). In. fine, quando presente, il d iabete mellito da ipoproduzione insulinica è evidentemente un ulteriore fa ttore di malattia e disabiltà. La I riade sintomatologica costituita da riflessi ipovalidi (patellare e achilleo), d isfunzione cerebellare e insorgenza preadolescenziale è solitamente considerata diagnostica, anche se circa il 10% dei casi conserva i ri-flessi agli arti inferiori . Non sono infrequenti comunque fonne a esordio tardivo anche nella certa decade (dopo i 25 anni); la principale diffe renza con le forme classiche è rappresentata dall'assenza di manifestazioni scheletriche (scoliosi) e una più lenta progressione. Un caso eccezionale di esordio a 40 anni è stato descrino in un paziente con sola spasticità degli arti inferiori. Alla RM si appre-aano atrofia cerebellare, degenerazione dei tratti spino -cerebellari e delle colo nne dorsali del midollo spinale, secondarie alla precoce degenerazione dei gangli delle radici spinali dorsali. La riduzione delle velocità di conduzione nervosa (sensitiva e motoria) e le alte razioni elettrocardiografiche ed ecocardiografiche confermano la diagnosi clinica.

Gene e mutazioni

li gene FRDA è stato inizialmente mappato sul braccio lungo 9, in regione 9ql3 . Nel J 994 l'inter· vallo dt non ncombinazione era stato ridotto a 450 kb e di· ventava fattibil I' al' · d · · _11 h e "';. 1s_1 . et gem contenuti nell'interv-.wo.

e ,ha condotto ali md1v1duazione del gene X251 FRDA e cli espansione m.assiva della tripletta ripetuta GAA dd

mtrone nei pazienti con FA. La piccola protdno mitocondnale di 210 · .d . I . • bbo d

ammoac1 1 a fratassma e a n· antemente esp el ' · ' ·d I I . ressa n tessuto miocardico e nel mt o ·

0 spinale, con ltvelli infe riori nel cervelletto. È in,·e<:e praticamente ass li . è f e nte ne a corteccia cerebrale mentre ortemente espressa in organi e tessuti ad nito' mernboli·

smo, qualt fegat · L'abno o ,_ reni e grasso b runo. . .

d. . espansione della sequenza GAA (fino a miglilll9

t unità n petut ) · ·b· FRDil . f e mi 1scc la trascrizione del gene .' •nrcr erendo con l'allungamenlQ del t rascritto. Quindi J

fenotipo della FA è dovuto alla perdita di funzione (parziale) del gene e alla riduzione della quantità di fratassina dispo-nibile nelle cellule. La maggior parte dei malati ha livelli di frarassina intorno al 5-10% del normale, i casi a esordio . tardivo hanno il 20-25 % del normale, e gli eterozigoti hanno poco più del 50% del normale e sono perfenamente sani. L'assenza completa della fratassina non è compatibile con uno sviluppo fetale regolare, infatti non è staro possibile ottenere topi knockout omozigoti. La riduzione dei livelli di fratassina (e indirenamente la gravità del quadro clinico) è proporzionale al grado dell'espansione GAA riscon-trata. Circa il 3 % dei pazienti è eterozigote composro per la mutazione dinamica e una mutazione missenso o nonsenso sul secondo allele. La deplezione di frarassina a livello delle creste mitocondriali sembra comportare una minore efficienza nell'utilizzo del ferro inorganico per sintesi dell'eme e dei centri ferro-zolfo, indispensabili per il normale funzionamento della catena respiratoria. Oltre a un deficit del metabolismo energetico si osserva infatti un accumulo di ferro ossidato nei mitocondri, che a con-tatto con superossido e perossido di idrogeno aumenta la produzione di radicali liberi e lo stress ossidativo. Un meccanismo patogenetico simile a quello della FA, che comporta un abnorme aumento dello stress ossidativo cellulare, è quello dell'atassia da deficit di vitamina E . Questa condizione genetica, anch'essa recessiva, è dovuta a mutazioni nel gene 1TPA codificante la cx-tocopherol transfer protein ed è caratterizzata da un'atassia con are-flessia e perdita della propriocezione. Il quadro sintomatologico è simile a quello della FA, anche se manca il coinvolgin1ento cardiaco ed è presente ipertri-gliceridemia e ipercolesterolemia con xancelasmi e xanto-mi del tendine achilleo. Questa forma di atassia, molto più rara della FA, è sensibile al trattamento con alce dosi di vi-tamina E, tanto più efficace quanto più precoce. Nel 2005 è stato pubblictto uno studio preliminare su 10 pazienti con FA che suggerisce un effetto positivo del trattamento con farmaci antiossidanti (coenzima Q 10 e vitamina E) almeno sulla funzionalità miocardica e muscolare.

ATASSIE SPINO-CEREBELLARI AUTOSOMICHE DOMINANTI

Cenni storici ed epidemiologia

"\

"' Le atassie spino-cerebellari (SCA, Spino-Cerebellar Ata-xia) autosomiche dominanti, indicate anche con l'acro-nimo ADCA (Aurosomal Dominane Cerebellar Ataxia), a clliferenza dell'atassia di Friedreich a trasmissione recessiva rappresentano un'entità clinica molto etero-genea. La prevalenza globale delle ADCA è difficile da stimare, anche perché le singole varianti hanno frequenza estremamente mutevole nelle diverse popolaz1on1. Una prevalenza di circa 1:30.000-40.000 potrebbe essere una stima plausibile. Il primo gene SCA identificato è stato, nel 1993, quello <leU'arassina-1, localizzato sul braccio corto del cromo-

Capitolo 15 • Malattie da mutazioni dinamiche 257

soma 6. 1 ei successivi 13 anni, sono stati identificati al-tri 11 geni responsabili di SCA: in totale 10 forme sono riconducibili a mutazioni (si veda la Tabella 15.l), mentre 2 sono dovute a 11,luta.zioru convenzionali nel gene FGF14 e della protein-chinasi Cy (PKCy). Mediante l'analisi di linkage sono stati inoltre identilicati 15 ulteriori loci genetici potenzialmente responsabili di SCA, anche se soltanto 2 di questi (responsabili della SCA4 e della SCA5) sono stati associati a più di un pedigree.

ei paragrafi successivi la discussione sarà limitata alle forme di SCA dovute a mutazioni dinamiche. La fre-quenza delle mutazioni nei geni SCA identificati è estre-mamente variabile nelle diverse popolazioni, come sopra ricordato, ed è fortemente influenzata da effeni fondatori, come nel caso dell'atassia di Friedreich appena tratta-ta. Per esempio, l'espansione nel gene DRPLA è molto frequente in Giappone e rarissinrn nel resto del mondo, mentre l'espansione del pentanucleotide ATTCT nel gene della SCAlO appare limitato all'America Latina (Messi-co e Brasile). Comunque, una mutazione nei geni della SCAl, SCA2, SCA3, SCA6 o SCA7 si ritrova mediamente nel 50-70% dei casi di ADCA.

Fenotipo clinico

Storicamente le diverse forme di SCA erano state suddivi-se in tre classi: SCA I, SCA II e SCA III. La prima classe comprende le forme in cui l'atassia cerebellare è associata ad altti sintomi neurologici quali oftalmoplegia, segni piramidali ed extrapiran1idali, neuropatia periferica e de-menza (tipicamente SCAl, 2 e 3). La classe SCA II è rap-presentata da un'unica variante (SCA7) caratterizzata da degenerazione retinica e maculare, mentre la classe SCA III include le forme di atassia "pura" a insorgenza tardiva (come la SCA6). La variabilità di espressione fenotipica è comunque la regola nelle diverse forme di SCA e la non penetranza un'evenienza relativamente frequente. L'età di insorgenza è estremamente variabile, anche se tipicamente si diagnosi dopo la sernnda decade di vita. Comunque l'esordio dei sintomi è tanto più precoce quanto maggiore è l'espansione della sequenza ripetuta. La tendenza a una maggiore instabilità in presenza di se-quenze ripetute più lunghe spiega inoltre la frequente os-servazione in estesi pedigree di un '"anticipazione" dell'età di insorgenza dei sintomi al trascorrere delle generazioni. Per motivi non ancora chiariti la meiosi paterna consente un grado di amplificazione maggiore di quella materna; in quest'ultima anzi è possibile che non ci sia alcun auniento di lunghezza della tripletta ripetuta ma addirittura una contrazione. La Tabella 15 .2 riassume brevemente i segni clinici e le alterazioni delle strutture cerebrali verificabili con la diagnostica per immagini (RM e/o TC). Consideraro il ruolo preminente del ceivelletto (precisa-mente della porzione vestibolo-cerebellare) nel controllo dell'equilibrio e della postura, così come nella regolazione dei movimenti (su cui intervengono il vem1e e la porzione mediale degli emisferi), è logico aspettarsi che le principali

258 Parte Il • La genetica nella pratica clinica

conseguenze della degene razione dei neuroni di Purkinje riscontrata nelle varie forme di SCA siano disturbi del controllo oculomotorio, atassia e disartria, dismecria dei movimenti e tremore intenzionale al termine dei movi-menti volontari. Oltre alla degenerazione dei neuroni cerebellari, si può riscontrare un variabile del ponte (nucleo rosso e olivare inferiore), dei nuclei della base (putamen, caudato e subscantia nigra), dei tram spino-cerebellari e anche un deficit funzionale dei tratti conico-spinali. Il coinvolgimento di queste strutture e il malfunzionamento dei relativi circuiti neuronali conduce alle variabili manifestazioni delle SCA I, che includono deficit della memoria verbale, tremore parkinsoniano, neuropatia periferica sensitiva e sensitivo-motoria, para-plegia spastica, mioclonie, epilessia, ma anche distonia, coreoatetosi, demenza e psicosi. Questi ultimi tre segm, che si sovrappongono alle manifestazioni della malattia di Huntington, sono tipici dell'esordio tardivo deLI'atro: fia dentato-rubro-pallidoluysiana (DRPLA) e frequenu anche nella SCAl 7. In entrambi i casi l'esordio è più precoce rispetto alla malattia di Huntingron e include sempre l'atassia.

Geni e mutazioni

La Tabella 15 .2 elenca le diverse forme di SCA ricondu-cibili a mutazione dinamica. Accanto alla presentazione clinica è indicato il nome del gene, la sua localizzazione citogenetica, il tipo di unità ripetuta con relativa posi-zione nel gene e il range di alleli normali e patologici, le dimensioni medie della proteina corrispondente, la sua localizzazione subcellulare e la funzione ipotizzata. Fatta eccezione per le forme SCA8, IO e 12, tutte le altre sono dovute all'espansione (contenuta entro le 100 unità) di una tripletta CAG tradotta in un corrispondente tratto di poliglutamina (poliQ) in proteine tipicamente nucleari o in grado di essere trasportate nel nucleo. Come nel caso della malattia di Huntington, si suppone che l'eccessiva espansione del tratto poliQ conduca alla degradazione della proteina e abbia un effetto di gain of function (do-minante) che innesca un processo di apoptosi neuronale, con formazi6ne cli aggregati intranucleari. L'effetto neu-rotossico di proteine nucleari con poliglutamine espanse potrebbe essere anche mediato dall'aumentato legame con altre proteine come la polyglutamine binding protei11 PQBP 1. Comunque non è escluso che anche la perdi-ta cli funzione di un allele (aploinsufficienza) svolga un ruolo nella patogenesi delle diverse forme. Per esempio, l'aploinsuflicienza della TATA-box Binding Protein (TBP), componente essenziale del complesso cli iniziazione della trascrizione TFIID, potrebbe contribuire in modo non trascurabile alla della SCA 17.

el caso della SCA6 in"26e la proteina codificata dal gene CACNAIA, già idemifìcato come responsabile cli atassia episodica di tipo 2 e di emicrania emiplegica familiare, è una componente di un canale per il calcio voltaggio-dipendente associato alla membrana. In questo caso

. della sequenza CAG è molto limitai I' spans1one l l a e .1, e . I ici non superano e 30-33 g utamine ...._ "" alleli pato og · d" e ' "'' cu . l e Ja patogenesi i questa iorma 1 s1 suppone c' ell . d d" . d . cassia cereb are sia avuta trettament alle benigna 1 a rietà del canale per il calcio cx lA. e alrerareprop " d "ff

dell SCA8 10 e 12 e 1 erence: la mutaz,· Il caso e ' Il · onc . . on è localizzata ne a porzione dinamica n . I d. . ..,., nie d l Causa probabilmente a per na d1 funzio e gene e l . . ne ( l · nsufficienza) del a p rotetna cornspondeni ,per ap o1 . ) d" F . d . h I' e. C l'atassia (recessiva 1 n e rete , espan51· ome per · . o-n'e della SCA 10 si verifica in un mtro?e .del gene, Può

· gere le cenunata o anche le migliaia d1 copie raggmn . . . d li' . e determina la perdita di funzione e ,"ta.ssma IO, una proteina citoplasmatica cotnvolra nell amva.z1one della cascata di segnalazione della tripletta CAG della SCA12 e tnvece p1u comenu. 13 \ meno di 100 triplette) anche se .sembra,.vvenire nel

romocore del gene PPP2R2B, codificante una pro1eina regolatrice della proteina fosfarasi 2. a

ruolo dell 'espansione della triple tta CTG neLI'RNA non tradotto associato alla SCA8 è invece !:ontroverso: infa1. ti tale RNA è parzialmente sovrapposto al messaggero del gene KLHLl sul filamento opposto e l'espansÌone di SCA8 potrebbe regolare l'espressione di KLHLl, ma alcuni soggetti con l'espansione non hanno manifestazioni cliniche e viceversa.

CONCLUSIONI

Il capitolo delle mutazioni dinamiche è relativamen1enuo-vo, ma si è già arricchito di molte "voci", corrispondenti ad altrettante malattie ereditarie. Si tratta prevalememen· te, ma non esclusivamente, cli malanie neuromuscolari, cbe si presentano peraltro con manifestazioni fenotipi-che molto variabili, cui corrisponde anche una notevole eterogeneità genetica. Mentre i tratti di DNA che vanno incontro a progressiva espansione sono quasi sempre se· quenze di triplette nucleotidiche, variano il tipo di triplet· ta (CGG, CTG, CAG ecc.), l'entità dell'espansione (da poche decine a molte migliaia) e la conseguenza funziona· le dell 'espansione (b locco della trascrizione, trascrizione di una proteina anomala, effetti negativi dell'accumulo mtranucleare di trascritti anomali cli RNA). Merita un particolare richiamo la peculiarità del gen.e FMR1 •. m quanto a piccole espansioni (premucaz1ontl della tnpletta CGG corrisponde un certo tipo di pacologtl (stndrome di tremori e atassia, oppure menopausa preCO" ce), mentre a espansioni più grandi (mutazioni compleiel cornsponde la sindrome del cromosoma X fragile (ntardo mentale). La conoscenza del meccanismo mutazion:ile di· ".am.ico, o instabile, ha consentito di comprendere significato di fenomeni come quello dell'anticipazion ' d". ' t1C11 e 1 impostare con accuratezza la consulenza gene I Per molt di · · È · nevo e e con z1oni a esordio tardivo. ragia da attend.erst che la già lunga lista di malattie denvate. . mutazioni dinamiche sia destinata ad allungarsi ultertor mente, con il progredire delle rlbstre conoscenze.

Malattia Clinica e diagnostica per immagini Gene Cromosoma Unità Locai izzazione Alleli Alleli Dimensioni Localizzazione Funzione della

ripetuta normali patologici della della proteina proteina proteina

Atassia, disartria, nistagmo. oftalmoplegia, ATXN1 "6p23 CAG Esone tradotto 6-38 39-83 816 aa Nucleo/ Proteina nucleare SCAl

spasticità, neuropatia periferica, aumento citoplasma tempi di conduzione motoria - OPCA

SCA2 Atassia, disartria, movimenti saccadici rallentati, ATXN2 12q24 CAG Esone tradotto 14-31 32-77 1312 aa Citoplasma Attività iporeflessia, demenza, (raro) parkinsonismo - (Golgi) antiapoptotica OPCA+atrofia spinale e corticale

SCA3 Atassia. disartria, nistagmo, diplopia, ATXN3 14q32.1 CAG Esone tradotto 12-39 62-86 360 aa Nucleo/ Proteasi fascicolazioni faciolinguali, spasticità citoplasma dell'ubiquitina (precoce: < 35 anni), distonia, parkinsonismo - OPCA (lieve)

SCA6 Atassia "pura". disartria, nistagmo, diplopia< CNA 1A 19p13 CAG Esone tradotto 4-17 21-30 - 2500 Membrana Canale del calcio segni piramidali, neuropal!a periferica (rara . aa insorgenza tardiva e decorso benigno - CA

SCA7 Atassia, disartria, perdita di visus dovuta a ATXN7 3p12 CAG Esone tradotto 7- 35 37- 200 892 aa Nucleo Fattore di retinopatia maculare pigmentaria, movimenti trascrizione Q saccadici rallentati, segni piramidali - OPCA "O

SCA8 Atassia, disartria, nistagmo, tremori - CA ATXN805 13q21 CTG RNA non 16-37 110-> 4000 - - RNA antisenso d1 o tradotto KLHL 1 (*605332) -"' SCA10 Atassia, disartria, nistagmo, epilessia - CA ATXN10 22q13 ATTCT lntrone 10-22 800-4600 475 aa Citoplasma Attivatore di .

;:: Ras-MAPK-Elk1 "' iiJ

SCA12 Atassia, nistagmo, tremori, bradicinesia, PPP2R28 5q31-q33 CAG Promotore 7- 28 66-78 443 aa Citoplasma Regolatore della fl 1perrefless1a CA e atrofia cerebrale proteina fosfatasi Q.

"' 2A d 3 e: s SCA17 Atassia, disartria, nistagmo, movimenti saccadici TBP 6q27 CAG Esone tradotto 25-42 47- 66 339 aa Nucleo Fattore di lenti, epilessia, iperreflessia, acinesia, distonia, trascrizione corea, demenza. psicosi - CA e atrofia cerebrale Q.

fii DRPLA Atassia, mioclonie ed epilessia (precoce: < 20 ATN1 12p13.3 CAG Esone tradotto 7-35 49-88 1184 aa Nucleo/ Core pressore anni). coreoatetosi, demenza e psicosi (tardiva: citoplasma trascnzionale > 20 anni) - OPCA e lesioni sostanza bianca

aa = n d1 aminoacidi, CA •atrofia cerebellare; OPCA =atrofia ol!vo-ponto-cerebellare N

=

. ,.

Christina Brahe CAPITOLO

Malattie neuromuscolari su base genetica 16

INTRODUZIONE

Le malattie neuromusc()lari costituiscono un vast9 gruppo di malii.uk e_reoiiarie clinicamente variabili e genetica-mente eterogenee. Nella Tabella 16. I sono elencate alcu-ne tra le condizioni meglio conosciute. Una trattazione esauriente delle varie forme esula dall 'obiettivo di questo capitolo; inoltre alcune condizioni, quali la distrofia mio-tonica, la malattia di Kennedy e alcune atassie ereditarie sono state trattate nel Capitolo 14 in quanto causate da mutazioni dinamiche. In questo capitolo verranno dun-que descritte soltanto alcune condizioni neuromuscolari. Ci si soffermerà in particolare su quelle più frequenti , owero le atrofie muscolari spinali e le distrofie muscolari legate al cromosoma X.

ATROFIE MUSCOLARI SPINALI .. Aspetti clinici

Le atrofie muscolari spinali (SMA, pinal MuscuJar Atrophy) sono tra le malattie autosomiche recessive p)ù frequemi e costituiscono la prima causa di morte in età infantile per malania genetica. L 'incidenza delle SMA è compresa tra 1:6000 e l:I0.000 nari vivi e la frequenza dei portatori nella popolazione generale è d i I :40-1 :50. Le MA sono caratterizzate da degenerazione degli «-motoneuroni delle corna anteriori del midollo spinalé"'e da debolezza prevalentemente a carico dei pros'. simali degli ani e del tronco. li diafra1i:im.a e t muscoli

sono generalmente risparmtatt. . .• Le SMA si presentano con un ampio spemo d1 gr?vtta clinica che varia dalla forma più g rave, con esordio m età prenatale e decesso nei primi mesi di vita, alla forma Piuttosto rara con esordio in e tà adulta che permette la deambulazione fino a tarda e tà. Sulla base dell'età di insorgenza dei sintomi e dell'acquisizione delle tap_pe motorie, le SMA sono state classificate in tre forme 111 -

fan tili (SMA di tipo I , J I e ][!) e una dell'adulro (SMA di tipo IV).

La SMA di tipo I , detta anche malattia di Werdnig-Hof-fmann , è la forma più grave. L'insorgenza dei sintomi av-viene entro i primi 6 mesi di vira e talvolta già in utero, con riduzione dei movimenti ferali. I bambini presemano una marcata ipotonia e debolezza muscolare e non raggiungo-no mai la capacità di stare seduti senza appoggio. Talora la debolezza dei muscoli respiratori è tale da richiedere la ventilazione assistita (Box 16.1 ). La SMA di tipo II, o forma intermedia, si manifesta tra il sesto e il diciottesimo mese di vita con debolezza muscola-re che inreressa prevalentemente i muscoli prossimali degli arti inferiori. 1 pazienti sono in grado di mantenere la po-sizione seduta, ma non acquisiscono la deambulazione. È comune lo sviluppo di scoliosi e contratture muscolari. La SMA di tipo III, detta anche malattia di Kugelberg-Welander, è la forma più lieve tra quelle infantili, con insorgenza in età variabile tra i 18 mesi e i 18 anni. Lo sviluppo delle tappe motorie è inizialmente normale. l pa-zienti acquisiscono l'abilità di deambulare senza appoggio e l'esordio della debolezza muscolare è graduale. I pazien-ti hanno un'aspenativa di vita pressoché normale.

ella Tabella 16.2 sono riportate l'età di insorgenza dei sintomi e le tappe mmorie proprie dei pazienti affetti da queste tre forme infantili di SMA. Come già accennato sopra, vi è una forma a esordio in età adulta, la SMA di tipo I V che si manifesta dopo i 18 anni di vita. Si tratta di una forma rara, genetica men ce eterogenea.

Aspetti molecolari dell'atrofia muscolare spinale

Nel 1995 è stato idencificaco il gene responsabile delle ere forme di SMA a esordio in età infantile ( MA 1-lll) ed è stato denominato SM (Survival of Motor euron). Successivamente è stato dimostrato che mutazioni di M N possono causare anche alcuni casi di SMA JV. Il gene5MN è localizzato sul cromosoma 5ql3 in una regione duplicata e invertita di circa 500kb; pertanto in questa regione sono presenti due copie di SMN, denominate rispettivamente SMNI eSMN2. Come è indicato neUa Figura 16. la il gene