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Genetica dei Procarioti - 3

Dipartimento di Scienze della VitaCdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)

Prof. Laura Marriricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail

A.A. 2014-15Variabilità genetica nei batteri

le due cellule figlie sono geneticamente identiche tra loro e alla cellula madre

un cambiamento ereditario nella sequenza delle basi nel genoma di un organismo

Come si definisce una mutazione?

Nella maggioranza dei casi le mutazioni sono deleterie…..

Variabilità genetica nei batteri

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…..ma in qualche caso possono conferire un vantaggio!

Variabilità genetica nei batteri Frequenza di mutazione

La frequenza con cui avvengonoi diversi tipi di mutazioni èestremamente variabile.

Come si originano le mutazioni?

Max Delbruck (1906 -1981) & Salvador Luria (1912 - 1991)Cold Spring Harbor Laboratory, Long Island NY, Summer 1953

Nobel Prize, 1969

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coltura pura di Escherichia colisensibile al fago T1

L’esperimento di Salvador Luria e Max Delbruck test di fluttuazione (1943)

colonie di E. coliresistenti al fago

(lamarckiana)

(darwiniana)

Mutazione "tardiva": pochi batteri resistenti

Mutazione "precoce": molti batteri resistenti

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Conclusione:

Batteri sensibili al fago diventano resistenti prima di entrare in contatto con il virus.

Il numero di mutanti dipende dal momento in cui si verifica ciascun evento di mutazione (e dal numero di eventi) in ciascuna coltura.

L’esposizione al virus non induce l’insorgenza della mutazione.

L’esposizione al virus seleziona mutanti preesistenti

Basi molecolari delle mutazioni

Il cambiamento del fenotipo dipende dal punto esatto in cui la mutazione è situata nel gene e da quale prodotto è normalmente codificato dal gene.

Mutazioni puntiformi

Mutazioni per sostituzione di base

TRANSIZIONI: purina purina G A

pirimidina pirimidina C T

TRASVERSIONI: purina pirimidina

G T G C

A T A C

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Basi molecolari delle mutazioni

possono risultare per sostituzione di una base nel DNAo per inserzione e delezione di una base (microinserzioni e microdelezioni).

Mutazioni puntiformi • Base substitution (point mutation)

• Missense mutation

• Change in one base• Result in change in amino

acid

The Expression of Mutations

• Nonsense mutation • Results in a nonsense codon

The Expression of Mutations

• Frameshift mutation • Insertion or deletion of one or more nucleotide pairs

The Expression of Mutations

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Basi molecolari delle mutazioni

Le inserzioni si verificano per aggiunta di nuove basi al DNA e inattivano il gene in cui accadono. Molte mutazioni da inserzione sono dovute a sequenze di DNA specifiche, lunghe 700-1400 bp, dette sequenze di inserzione. Le mutazioni da inserzione possono regredire per reversione.

Mutazioni che coinvolgono molte paia di basi

Le delezioni possono coinvolgere la perdita di centinaia o migliaia di paia di basi; non regrediscono per reversione se non per ricombinazione

Reversione

Le mutazioni possono essere:

Spontanee Indotte da mutageni

Mutageni chimici Mutageni fisici

analoghi delle basi agenti alchilanti agenti intercalanti

Radiazioni non ionizzanti:UVRadiazioni ionizzanti:

raggi gammaraggi Xraggi cosmici

(frequenza molto bassa)

Agenti alchilanti

Nitrosoguanidina, Acido nitroso, Idrossilamina sono responsabili di reazioni di metilazione, deaminazione, ecc.

NTG

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Agenti intercalanti

Acridine (arancio di acridina, bromuro di etidio): sono molecole planari che si inseriscono tra due basi del DNA, separandole

Questa conformazione anormale può portare a microinserzioni e microdelezioni durante la replicazione

Radiazioni non ionizzanti: raggi UVformazione di dimeri di pirimidine (due C o T adiacenti sono legate covalentemente tra loro).

Radiazioni ionizzanti

Sono radiazioni a lunghezza d’onda corta (raggi X, gamma, raggi cosmici). Più potenti dei raggi UV e altamente penetranti.

Causano la ionizzazione dell’acqua e di altre sostanze con la produzione di radicali liberi come lo ione ossidrile (OH-)

La loro azione mutagena è indiretta in quanto il danno è prodotto dai radicali liberi.

DNA replication fidelity in Escherichia coli

FEMS Microbiology ReviewsVolume 36, Issue 6, pages 1105-1121, 5 APR 2012 DOI: 10.1111/j.1574-6976.2012.00338.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6976.2012.00338.x/full#fmr338-fig-0003

SOS mutagenesis

TLS: translesion synthesis

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Nomenclatura genetica batterica

wild-type strain phenotypically Arg+

mutant incapable of synthesizing arginine: phenotype will be Arg-

and genotype arg.

arginine biosynthesis, for example, requires more than one gene.

In such cases, a fourth letter is added to the gene symbol, each identifying a different gene: argA, argB,argC, etc.

Nomenclatura genetica batterica

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Lac-lacZ

Lac-lacY

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Lac+lacI

Genotype Phenotype (Lac)+ IPTG - IPTG

wild typelacZlacPlacOlacI

-

+

+- -- -

++ +

Tipi di mutanti batterici

MORFOLOGIAdelle colonie (forma , colore)

CAPACITÀ/INCAPACITÀ DI CRESCEREdelle celluleIn particolari condizioni ambientali (temperatura, luce, terreno)

ALTRE PROPRIETÀ motilitàpatogenicità, …..

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Mutazioni “neutre”

gyrA NalR rpsL SmR

Mutazioni “neutre”

gyrA NalR rpsL SmR

Mutanti condizionali: esprimono la mutazione solamente sotto particolari condizioni ambientali

Altri tipi di mutazioni

Mutanti letali condizionali

In seguito a mutazioni puntiformi rare:

Per Escherichia coli: tempertura permissiva: 25-30°C

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Detection and Isolation of Mutants

mutations are generally rare– one per 107 to 1011 cells

finding mutants requires sensitive detection methods

and/or methods to increase frequency of mutations

Selection

• Positive (direct) selection detects mutant cells because they grow or appear different

• Negative (indirect) selection detects mutant cells because they do not grow

Colture liquide

• 1010cellule/ml

Colonie in Agar

• 107 cellule/colonia

mutations : one per 107 to 1011 cells

Sele

zion

eD

iretta

di m

utan

ti

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Terreni di coltura per Escherichia coli

definito complesso

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Sel

ezio

neIn

dire

tta:

Arr

icch

imen

toco

n pe

nici

llina

Sel

ezio

neIn

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Arr

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Arr

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nici

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Selezione Indiretta: Replica Plating Selezione Indiretta: Replica Plating

Selezione Indiretta: Replica Plating

mutante auxotrofo

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Esther Lederberg in her home in Wisconsin (1958, the day that the Nobel Prize of Joshua Lederberg wasannounced).

Sel

ezio

neIn

dire

tta:

Isol

amen

todi

Mut

anti

Esempio di isolamento di mutanti portatori di mutazioni condizionali letali in geni essenziali.

Analisi dei mutanti: Crossfeeding

aa Ana

lisid

eim

utan

ti: C

ross

feed

ing

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F accumulates a diffusible intermediate which is excreted and can be used by E

G accumulates a diffusible intermediate which excreted and can be used by F and E

F accumulates ORNITHINE used by E

G accumulates CITRULLINE used by F & E

Complementation tests are used to determine if two mutations are in the same or different genes

necessary when different mutations in the same pathway yield the same phenotype

2 mutations on different genes: trans configuration

2 mutations on same gene: cis configuration

Analisi dei mutanti: Complementation

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Brook, Biologia dei microrganismi – 1 Microbiologia generale

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T2, T4 have been enormously useful in genetic studies because:

Viruses of two (or more) different genotypes can simultaneously infect a single bacterium.

The DNA molecules of one of the infecting viruses can recombine with that of another forming recombinant molecules.

The huge number of viruses released from a huge number of bacterial hosts enables even rare recombination events to be detected.

Genealogy of E. coli B.

Journal of Molecular Biology, Volume 394, Issue 4, 2009, 634 - 643

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rII mutants & wild-type T4 can infect and complete their life cycle in a strain of E. coli designated B.

rII mutants cannot complete their life cycle in a strain of E. coli designated K. Wild-type T4 can.

Phenotypic properties of T4 phage

r: rapid lysis

The rII protein consists of 2 separate polypetide chains, coded by the rIIA & rIIBgenes respectively

rII-rIIArIIB

A B

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Cis-trans test of mutations 1 & 2complementation occurs

mutations are in different genes

Cis-trans test of mutations 1 & 2complementation occurs

mutations are in different genes

Cis-trans test of mutations 2 & 3no complementation occurs

mutations are in the same gene

A gene as defined by the cis-trans test is called a

cistron and is equivalent to defining a structural gene

as a segment of DNA that encodes a single

polypeptide chain

Salmonella typhimurium

Ames Test

about 109 his- bacteria, <102 of whitecolonies derived from single bacteriathat have undergone spontaneousreversion mutations to his+.

Salmonella typhimurium

about 109 his- bacteria, <102 of whitecolonies derived from single bacteriathat have undergone spontaneousreversion mutations to his+.

As it diffuses outward, the chemicalfirst kills all the bacteria (clear area),but then at lower concentration is seento induce reversion mutations manyrevertants (his+) colonies due to itsmutagenic effect.

1998-Bruce Ames receives the Medal of Science from President Clinton.

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T. Zahrt isolated a strain of Salmonella typhimurium that could grow as well as the wild-type parent on rich medium, but when transferred from rich medium to minimal medium the strain a very long lag phase compared to the wild-type parent. wild-type : black squares; other strain: blue triangles.

Come si potrebbe determinare se la crescita osservata dopo la fase Lag dipende:

a) da una seconda mutazione che consente la crescita in terreno minimo

b) da un periodo più lungo di adattamento al terreno minimo

?

Come si potrebbe determinare se la crescita osservata dopo la fase Lag dipende:

a) da una seconda mutazione che consente la crescita in terreno minimo

b) da un periodo più lungo di adattamento al terreno minimo

?

la soluzione sarà discussa la prossima volta