13. GLI INDICATORI DI CONTAMINAZIONE · batteri di diverso genere e specie, aventi però le...

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13. GLI INDICATORI DI CONTAMINAZIONE

L’esame microbiologico quantitativo della popolazione microbica di un qualsiasi campione si

basa essenzialmente sulla possibilità di coltivare i batteri contenuti nel campione esaminato,

utilizzando particolari metodologie finalizzate alla individuazione e al conteggio

differenziale di specie o di gruppi microbici, chiamati indicatori di contaminazione, che

si ritengono significativi ai fini del giudizio igienico e/o di qualità del campione in

esame.

Utilizzando terreni differenti contenenti agenti selettivi, agenti cromogenici e/o fluorogenici,

indicatori di pH e coloranti ed incubando ad opportune temperature è possibile rendere selettivo

il metodo al fine di coltivare solo i gruppi microbici di interesse e, talora, una singola specie

batterica.

Si definisce indicatore di contaminazione un parametro o una specie (chimica, fisica,

biologica) avente una relazione, razionale o empirica, stretta con un fenomeno o una

caratteristica ambientale, per cui esso è in grado di riassumere le caratteristiche generali del

fenomeno e del comparto ambientale anche se ne descrive fisicamente solo una parte.

Ad esempio, il batterio Escherichia coli è un indicatore di inquinamento fecale.

I ricercatori stanno ancora cercando il microrganismo indicatore “ideale” da usare nella

microbiologia sanitaria.

Alcuni dei criteri suggeriti per la scelta di un buon indicatore sono:

1. Il batterio indicatore dovrebbe essere adatto all’analisi di qualsiasi tipo di matrice

(campione in esame).

2. Il batterio indicatore dovrebbe essere presente ogni volta che sono presenti patogeni

enterici.

3. Il batterio indicatore dovrebbe sopravvivere più a lungo dei patogeni enterici resistenti.

4. Il batterio indicatore non dovrebbe riprodursi nel campione in esame per non dare valori

sovrastimati.

5. Il batterio indicatore dovrebbe avere un’elevata specificità; in altre parole, non si

dovrebbero avere falsi positivi dovuti a batteri diversi dall’indicatore. Inoltre il saggio

dovrebbe avere alta sensibilità, rilevare cioè gli indicatori anche se presenti in quantità

ridotte.

6. Il test dovrebbe essere veloce da eseguire.

7. L’indicatore dovrebbe essere innocuo per l’uomo.

8. Il livello del batterio indicatore nel campione contaminato dovrebbe avere una relazione

diretta con il grado di contaminazione fecale.

Vengono di seguito riportate le caratteristiche degli indicatori di contaminazione trattati a livello

analitico quantitativo nei successivi capitoli.

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13.1. COLIFORMI

Coliformi totali Si indicano con questo nome un gran numero di batteri di diverso genere e specie, aventi però le seguenti caratteristiche comuni:

Famiglia Enterobatteriaceae

Morfologia cellulare Bastoncelli o coccobacilli, asporigeni, mobili, Gram negativi.

Condizioni di

crescita Temperatura ottimale di crescita 32°-37°C in 48 ore, aerobi ed anaerobi facoltativi.

Metabolismo

Sia respiratorio che fermentativo del destrosio (glucosio) e del lattosio con produzione finale sia di cataboliti acidi che di gas; sintetizzanti l’enzima nitrato reduttasi (perciò riducono i nitrati a nitriti); sintetizzanti l’enzima -galattosidasi

(perciò in grado di idrolizzare un legame glicosidico); privi dell’enzima ossidasi.

Ubicazione

Sono presenti nell’intestino dell’uomo e degli animali (il materiale fecale di origine umana ne possiede una concentrazione media di 109 UFC/g), ma sono largamente presenti anche nel suolo, sulle piante, nell’aria e nell’ambiente acquatico.

Coliformi fecali Costituiscono un sottogruppo dei Coliformi totali.

Caratteristiche colturali (oltre a quelle degli altri Coliformi totali)

Presentano tutte le caratteristiche già elencate per i Colorirmi totali, ad eccezione della temperatura ottimale di crescita che per i Coliformi fecali è di 44°45°C in 24 ore.

Ubicazione

Così come i Coliformi totali, sono presenti nell’intestino dell’uomo e degli animali (il materiale fecale di origine umana ne possiede una concentrazione media di 107 UFC/g), ma sono largamente presenti anche nel suolo, sulle piante, nell’aria e nell’ambiente acquatico. Rappresentano un indice indubbio di contaminazione fecale del campione esaminato.

Escherichia coli È una specie batterica tassonomicamente definita, facente parte del sottogruppo dei Coliformi fecali.

Caratteristiche colturali (oltre a quelle degli altri Coliformi fecali)

Presenta tutte le caratteristiche già elencate per i Coliformi totali. In più, rispetto agli altri Coliformi, presenta le seguenti caratteristiche colturali:

idrolizza il 4-metilumbelliferil--D-glucuronide (MUG) con produzione di

colonie fluorescenti osservabili con una lampada ad UV (lampada di Wood);

idrolizza il 5-bromo-4-cloro-3-indoil -D-glucuronide (X-GLUC) con

produzione di un pigmento blu-verde grazie all’enzima -glucorinidasi;

sintetizza l’enzima triptofanasi, perciò produce indolo dal triptofano.

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13.2. STREPOTOCOCCHI FECALI

Streptococchi

fecali

Si indicano con questo nome (oppure con Enterococchi) un gran numero di batteri di diverso genere e specie, aventi però le seguenti caratteristiche comuni:

Famiglia Micrococcaceae

Morfologia cellulare Cocchi che si dispongono a coppie o a catene, asporigeni, in genere immobili, Gram positivi.

Condizioni di crescita

Temperatura ottimale di crescita 32°-37°C in 48 ore, ma crescono anche a 10°C e a 45°C; aerobi ed anaerobi facoltativi.

Metabolismo

Sono tutti chemioeterotrofi che attingono la propria energia soprattutto dalla fermentazione degli zuccheri con produzione di acido lattico ma non di gas; non sintetizzanti l’enzima catalasi (perciò non degradano l’acqua ossigenata ad acqua ed ossigeno).

Ubicazione

Sono ospiti abituali del tratto intestinale dell’uomo e di molti altri animali. Tradizionalmente considerati come indicatori di contaminazione fecale delle acque potabili, sono attualmente considerati indicatori estremamente importanti nel caso delle acque marine e nelle acque sottoposte a clorazione. Nelle acque marine essi presentano infatti una capacità di sopravvivenza maggiore dei Coliformi; nelle acque clorate la loro resistenza si avvicina a quella degli Enterovirus, perciò la loro presenza può essere indice di possibile contaminazione virale. Se la contaminazione fecale è recente, il rapporto Coliformi totali/Streptococchi fecali è orientativo sulla natura dello scarico: vale circa 4 per le feci di origine umana, mentre si aggira intorno a 0,2 per quelle animali.

13.3. SALMONELLA

Salmonella spp Si indica con questo nome un genere batterico appartenente alla

Famiglia Enterobatteriaceae

Morfologia cellulare Bastoncelli, asporigeni, mobili, Gram negativi.

Condizioni di crescita

Temperatura ottimale 44°-45°C in 48 ore; le basse temperature (sotto i 7°C) limitano lo sviluppo delle Salmonelle, tuttavia, anche se si verifica una certa diminuzione numerica, esse rimangono vive e vitali; le alte temperature (sopra i 46°C) sono invece letali e la loro azione è tanto più rapida e completa quanto più essa è elevata. Aerobi ed anaerobi facoltativi. Non sono in grado di riprodursi in ambienti poveri di acqua.

Metabolismo

Sia respiratorio che fermentativo degli zuccheri con produzione di cataboliti acidi e di gas, sintetizzanti l’enzima tiosolfato reduttasi (perciò riducono il tiosolfato ad acido solfidrico); sintetizzanti l’enzima catalasi (perciò degradano l’acqua ossigenata ad acqua ed ossigeno); prive degli enzimi ossidasi, triptofanasi e ureasi.

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Ubicazione

Il genere Salmonella comprende oltre 2000 sierotipi e sono i batteri patogeni enterici più diffusi sul nostro pianeta. La loro presenza nell’ambiente indica l’esistenza di una contaminazione fecale. I diversi sierotipi di Salmonella possono essere ubiquitari e parassitare diverse specie animali, oppure strettamente adattati ad un ospite specifico (uomo). Da uomo a uomo si trasmettono attraverso il circolo oro-fecale per ingestione di acqua o di cibi contaminati da feci di malati o portatori sani. La forma clinicamente più grave di salmonellosi, la febbre enterica, è rappresentata dal tifo (tifo addominale e febbre tifoide) sostenuta da Salmonella typhi e dal paratifo causato da Salmonella paratyphi.

13.4. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus

aureus

Si indica con questo nome una specie batterica appartenente alla

Famiglia Micrococcaceae

Morfologia cellulare Forma tondeggiante (coccacea) con diametro di 0,8-1 m, riuniti a grappolo a

causa della divisione che avviene in tre piani perpendicolari; asporigeni, acapsulati, immobili, Gram positivi.

Condizioni di crescita batterica

temperatura ottimale 35°-40°C in 48 ore; sono inibiti da terreni che contengono il colorante basico cristalvioletto.

Metabolismo Sia respiratorio che fermentativo degli zuccheri; sintetizzanti l’enzima catalasi (perciò degradano l’acqua ossigenata ad acqua ed ossigeno); privi dell’enzima ossidasi.

Ubicazione

Il genere Staphylococcus comprende 20 specie; quella patogena, Staphylococcus aureus, si distingue da quelle non patogene (S. epidermidis, S. saprophyticus, ecc.) per la produzione di diversi enzimi (coagulasi, proteasi, lipasi, termonucleasi) e la fermentazione della mannite. Il nome Staphylococcus aureus deriva dalla produzione di un pigmento giallo-oro in terreni solidi; è diffuso negli animali e nell’uomo, spesso portatore sano di stafilococchi localizzati sulla cute e a livello del naso-faringe.

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13.5. LIEVITI E MUFFE

Lieviti

Sono funghi unicellulari con un solo nucleo che possono riprodursi sia asessualmente per gemmazione e divisione trasversale, sia sessualmente tramite la formazione di spore. Ciascuna gemma che si separa può svilupparsi in un nuovo lievito, mentre alcune di esse si riuniscono in gruppi, dando vita a colonie. In genere le cellule dei lieviti sono più grandi di quelle dei batteri; le forme più comuni vanno da quella sferica a quella ovale. Non dispongono di flagelli, ma possiedono la maggior parte di tutti gli altri organelli eucariotici.

Muffe

Sono formate da una serie filiforme, lunga e ramificata di cellule, dette ife (dal greco hyphae, tela), che formano un micelio, cioè un ammasso intricato o un’aggregazione simile ad un tessuto.

14. IL METODO COLTURALE MEDIANTE CONTEGGIO VITALE IN

PIASTRA

Questo metodo di analisi microbiologica consiste nel seminare aliquote del campione da

analizzare tal quale e/o opportunamente diluito utilizzando terreni solidificati all’agar all’interno

di piastre Petri.

Dopo opportuna incubazione si conta il numero delle colonie sviluppate, dal quale è possibile

risalire, tenendo conto del volume di campione seminato e della sua diluizione, al numero di

batteri presenti espressi come Unità Formante Colonia (UFC) presenti in un determinato

volume di campione liquido, o in una determinata massa di campione solido, o in una

determinata area nel caso si tratti di analisi ambientali.

L’UFC rappresenta il numero di microrganismi vivi presenti nel campione in esame che

si sono sviluppati su terreno solido, partendo dal presupposto che ogni colonia visibile

cresciuta sul terreno abbia avuto origine da una sola cellula microbica.

La semina del campione e/o delle sue diluizioni può essere effettuata

per inclusione, cioè all’interno del terreno

per strisciamento e per tamponamento, cioè sulla superficie del terreno

mediante tecnica delle membrane filtranti

14.1. SEMINA PER INCLUSIONE

La semina per inclusione viene effettuata introducendo aliquote di campione (tal quale o

opportunamente diluito nel caso di campioni aventi un’elevata carica microbica) comprese tra 1

e 2 mL (generalmente 1 mL) all’interno della piastra Petri e successivamente versando il terreno

di coltura agarizzato, mantenuto fuso a 45°-50°C; il tutto viene opportunamente mescolato,

lasciato solidificare ed infine incubato.

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14.2. SEMINA PER STRISCIAMENTO E PER TAMPONAMENTO

La semina per strisciamento e per tamponamento viene effettuata sulla superficie del terreno

già solidificato, utilizzando aliquote di campione non superiori a 1 mL; è pertanto evidente che

questa metodica è utilizzabile solo per mettere in evidenza microrganismi presenti nel campione

in numero relativamente elevato e che quindi siano in numero consistente in volumi ridotti.

Per l’indagine microbiologica delle superfici si possono utilizzare particolari tecniche di

tamponamento per contatto diretto della piastra sulla superficie da campionare che verranno in

seguito meglio dettagliate

SEMINA MEDIANTE FILTRAZIONE SU MEMBRANA FILTRANTE (MF)

Lo scopo della filtrazione su membrana filtrante come metodo di sterilizzazione è quello di

rendere sterile un determinato liquido, perciò la membrana contenente i microrganismi viene

smaltita, mentre viene conservato il liquido reso sterile. La stessa tecnica viene anche utilizzata

per lo scopo opposto, come metodo di semina: si conserva la membrana contenente i

microrganismi per scopi analitici, mentre il liquido filtrato viene smaltito.

La tecnica analitica consiste nel filtrare in depressione, cioè con beuta e pompa da vuoto,un

determinato volume del campione in esame tal quale o opportunamente diluito attraverso

particolari filtri dotati di membrane filtranti per uso batteriologico, costituite da dischi di esteri

di cellulosa con pori uniformemente distribuiti. Generalmente per le analisi microbiologiche si

utilizzano membrane con pori aventi un diametro di 0,45 µm. A causa della loro porosità, esse

hanno la capacità di trattenere sulla loro superficie, all’atto della filtrazione, i batteri contenuti

nel volume di campione sottoposto a filtrazione.

Al termine della filtrazione le membrane vengono collocate all’interno di piastre Petri sopra al

terreno di coltura, che si presenta o sottoforma di dischi assorbenti imbevuti di liquido colturale

o sottoforma di terreno di coltura agarizzato solidificato; durante la fase di incubazione i

componenti contenuti nel terreno di coltura attraversano per capillarità la membrana, perciò le

colonie batteriche si sviluppano sulla superficie della membrana stessa e possono essere

riconosciute e contate.

Esistono numerosi tipi di imbuti da impiegare con le membrane filtranti; possono essere in

acciaio inossidabile, vetro, policarbonato o polipropilene. Esse devono essere sterilizzate prima

dell’uso mediante flambatura (acciaio e vetro) o in autoclave a 121°C per 15 minuti (materiali

plastici).

La metodica delle membrane filtranti presenta i seguenti vantaggi:

consente di esaminare volumi molto grandi di campione, perciò è indicata per matrici a

bassa concentrazione microbica; d’altro canto, però, campioni aventi elevate

concentrazioni microbiche devono essere opportunamente diluiti prima di essere

sottoposti a filtrazione;

semplifica notevolmente le procedure di laboratorio e ne abbrevia i tempi operativi;

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consente, di solito, di rilevare direttamente (per conta diretta) il numero di microrganismi

presenti nel campione esaminato, contando le colonie sviluppatesi su membrana senza

necessità di ricorrere ad ulteriori prove di conferma in quanto si utilizzano terreni colturali

fortemente selettivi e differenziali.

L’unico svantaggio che presenta tale metodica è dovuto alla torbidità del campione in esame:

non può essere infatti utilizzata quando nel campione in esame sono presenti particelle in

sospensione o che comunque presenti un valore di torbidità superiore ad 1 unità nefelometria,

in quanto esse verrebbero trattenute durante la filtrazione insieme ai microrganismi rendendo

non solo molto lenta la filtrazione stessa, ma provocando notevoli interferenze durante la

crescita e il conteggio dei microrganismi.

Procedimento

Disinfettare il piano di lavoro

con alcool denaturato e lavorare

nelle vicinanze di una fiamma

accesa.

Collegare la pompa da vuoto

alla beuta e al rubinetto dell’aria

compressa.

Sistemare la base del filtro con

il setto poroso metallico sulla

beuta e flambare il setto con la

fiamma del bunsen. Flambare

anche la base e l’interno

dell’imbuto.

Aprire l’involucro della

membrana filtrante, prelevarla

con pinzette flambate e

raffreddate ed appoggiare la

membrana filtrante con il foglio

di protezione rivolto verso l’alto

sul setto poroso metallico

raffreddato.

Rimuovere con le pinze il foglio

di protezione, sistemare sopra

l’imbuto metallico e fissarlo alla

base.

Versare il volume di campione

da filtrare nell’imbuto; per

misurare questo volume si

possono utilizzare o le tacche di

graduazione impresse nella

parte interna dell’imbuto stesso,

oppure delle pipette tarate o

graduate o dei cilindri sterili.

Per volumi di campione inferiori

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a 5 mL prelevare dapprima il volume di campione dentro ad una provetta sterile con tappo, aggiungere

10-20 mL di acqua sterile o di soluzione fisiologica sterile (soluzione acquosa di NaCl allo 0,9%), quindi

filtrare il tutto attraverso l’imbuto lavando la provetta con un po’ di acqua sterile.

Filtrare il campione applicando una debole aspirazione con la pompa da vuoto, risciacquare l’interno

dell’imbuto con acqua sterile o con soluzione fisiologica sterile ed aspirare anche il liquido di lavaggio.

Togliere l’imbuto metallico, sollevare la membrana con pinze flambate e raffreddate e depositarla sulla

superficie del terreno in piastra, evitando la formazione delle bolle d’aria.

15. IL METODO COLTURALE IN PROVETTA MEDIANTE TECNICA

DEL NUMERO PIÙ PROBABILE (MPN)

Il metodo colturale mediante tecnica del numero più probabile (MPN, Most Probabile

Number) o dei tubi multipli fornisce una stima statistica della densità batterica del campione

analizzato quando l’inoculo viene effettuato all’interno di un terreno di coltura liquido (brodo).

In questo caso, non essendo possibile determinare il numero delle UFC sviluppate, si utilizza

un’elaborazione statistica dei risultati positivi (ovvero provette o tubi in cui si è verificata la

crescita microbica) e negativi (ovvero provette o tubi in cui non si è verificata la crescita

microbica) ottenuti.

Partendo dal presupposto che i microrganismi siano distribuiti in modo casuale nel campione, ci

si può aspettare che, anche quando il campione contenga una cellula microbica per mL, circa il

37%1 dei tubi inoculati con 1 mL del campione possa essere negativo. Infatti, a causa della

distribuzione casuale dei batteri nel campione stesso, la positività dei tubi può essere dovuta

all’inoculo di 1 o più microrganismi.

1 Approfondimento a cura del Prof. Roberto Zanasi

Denominiamo V mL = volume totale nella provetta (tubo)

v mL = volume di campione nella provetta (tubo)

b = numero totale di microrganismi presenti nel campione

La probabilità che sia presente un solo microrganismo nel campione è uguale al rapporto v/V.

Di conseguenza la probabilità che questo microrganismo NON sia presente nel campione è V

v-1 .

Ora consideriamo il numero totale di microrganismi presenti nel campione b: la probabilità che nessuno di essi sia presente

nel campione è:

b)V

v-(1p

Supponendo che il rapporto v/V sia piccolo, si può usare il limite notevole

e)x

1(1lim x

x

che può essere scritto come

b

V

vb

V

v

v

V

x

1

0xe

V

v1 ex1lim

Indicando con V

b la densità (ovvero il numero di microrganismi per mL), la probabilità che il campione sia sterile è:

-vep

Se si sceglie v in modo tale che contenga 1 microrganismo, allora 1v , quindi la probabilità che il campione sia sterile è

%37ep 1-

Non siamo certi che il campione contenga un microrganismo, questo è solo il valore atteso.

È come la statistica dei polli: se in media c’è 1 pollo a testa, non tutti ne mangiano 1!!!

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15.1. CARATTERISTICHE DELLA TECNICA MPN

La tecnica colturale mediante tecnica MPN viene utilizzata per l’analisi di campioni torbidi e/o in cui è

presente un’elevata concentrazione microbica della specie batterica oggetto dell’analisi, casi in cui non è

possibile ottenere risultati accurati con in metodo colturale mediante conteggio vitale in piastra.

Si utilizzano dei terreni di coltura selettivi e differenziali liquidi (brodi), pertanto le semine vengono

effettuate in provette (tubi) sterili.

Il metodo è meno preciso rispetto al conteggio in piastra ed è molto più lungo e laborioso per diverse

ragioni, in quanto per ottenere risultati sufficientemente attendibili si devono inoculare diverse provette

(minimo 9) di terreno di coltura liquido con il campione in esame e con le sue diluizioni (prova presuntiva), i

cui risultati vanno confermati con una prova di conferma; perciò sia il materiale da utilizzare, sia il tempo

(che varia dalle 48 alle 96 ore) di attesa per la lettura dei risultati finali è superiore, in generale, a quello

dei metodi quantitativi in piastra.

I volumi di campione che possono essere esaminati con questa tecnica sono ridotti a causa delle difficoltà

tecniche di preparazione e distribuzione di aliquote elevate del campione da esaminare.

Questo metodo colturale consiste nell’inoculare con il campione in esame tal quale e diluito 3 serie di 3 tubi

o 3 serie di 5 tubi contenenti 10 mL di un brodo di coltura selettivo per il microrganismo che si vuole

ricercare. Dopo opportuno periodo di incubazione ad una determinata temperatura si contano il numero dei

tubi risultati positivi per ogni serie, che andranno poi confermati con una prova di conferma.

Il risultato si ottiene calcolando il valore dell’indice MPN in base alla formula di Thomas:

tubi i tutti in campione dimL negativi tubi nei campione dimL

100 positivi tubi di n mL MPN/100

L’indice MPN rappresenta il numero più probabile della specie microbica ricercata necessario a produrre combinazioni di tubi positivi e negativi in repliche di diluizioni decimali del campione.

Dato che si tratta di un’elaborazione statistica, è di fondamentale importanza che siano

contemporaneamente presenti risultati positivi e negativi:

se i tubi sono tutti negativi occorre ripetere la prova utilizzando inoculi con diluizioni minori (ovvero

campioni più concentrati),

mentre se sono tutti positivi occorre ripetere la prova utilizzando inoculi con diluizioni maggiori

(ovvero campioni più diluiti).

Anziché utilizzare la formula di Thomas, il risultato può essere ricavato, in base alle combinazioni dei tubi

positivi e negativi, da una Tabella già predisposta (riportata a pag. 184), relativa ai risultati che si possono

ottenere o con 3 serie di 3 tubi (in totale 9 tubi) o con 3 serie di 5 tubi (in totale 15 tubi) inoculati

rispettivamente con 10 mL, 1 mL e 0,1 mL di campione in esame.

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Vediamo come si analizzano i risultati con 3 serie di 3 tubi inoculati:

Campione nell’inoculo (g o mL) 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01

Brodo di coltura nei tubi 9 9 9 9 9 9 9 9 9 (mL)

Risultati ottenuti - - + - + - + - -

Combinazioni positive 1 1 1

Calcolo dell’MPN mediante la formula di Thomas

110722

300

301031031201021021

1003

,)],(),()[()],(),()[(mL MPN/100

Calcolo dell’MPN mediante la Tabella

Esiste una Tabella già predisposta che permette di risalire direttamente al valore dell’MPN noto il numero

delle combinazioni positive ottenute.

Nell’esempio precedente esso è:

combinazioni positive 1-1-1

da cui si ricava:

1101011mL MPN/100

Ovviamente in entrambi i casi i risultati si equivalgono.

Il valore numerico calcolato o ricavato dalla Tabella significa che:

Con una probabilità del 95%, il numero dei batteri presenti nel campione esaminato è pari a 110

colonie/100 mL di campione e cade nell’intervallo fiduciale 30-360 colonie/100 mL di campione.

137

continua

15.2. TABELLA PER IL CALCOLO DELL’MPN

3 tubi 5 tubi ATTENZIONE

L’indice MPN che si ricava dalla Tabella è

riferito a tubi inoculati rispettivamente con

10, 1 e 0,1 g o mL di campione.

Quando il campione ha una bassa carica

microbica occorre analizzare volumi più

grandi, ad esempio 100, 10 e 1 g o mL di

campione, In questo caso l’indice MPN che si

ricava dalla Tabella deve essere moltiplicato

per 0,1.

Quando il campione ha un’elevata carica

microbica occorre analizzare volumi più

piccoli, ad esempio 1, 0,1 e 0,01 g o mL di

campione, In questo caso l’indice MPN che si

ricava dalla Tabella deve essere moltiplicato

per 10.

3 tubi

5 tubi

segue

≥

≥

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16. L’ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE SUPERFICI

Il controllo microbiologico delle superfici ha come scopi:

determinare l’efficienza dei cicli e delle procedure di sanificazione;

determinare la frequenza richiesta per l’esecuzione dei cicli di sanificazione;

individuare le fonti di microrganismi inquinanti nell’ambiente;

determinare la frequenza richiesta per interventi di manutenzione speciale.

Nella seguente tabella sono riportati i microrganismi indicatori e i rispettivi valori guida

attraverso i quali è possibile valutare lo stato igienico delle superfici:

Indicatore dello stato igienico

Valori guida Stato igienico

Carica batterica totale Stafilococco spp

5 UFC/cm2

5 – 10 UFC/cm2 sanificazione corretta

11 – 100 UFC/cm2 sanificazione dubbia

101 1000 UFC/cm2

1000 UFC/cm2 sanificazione non

corretta

Coliformi totali Stafilococco aureo Escherichia coli

0 UFC/cm2

3 UFC/cm2 sanificazione corretta

3 – 10 UFC/cm2 sanificazione dubbia

11 50 UFC/cm2

50 UFC/cm2 sanificazione non

corretta

Listeria spp assente sanificazione corretta

Salmonella spp assente sanificazione corretta

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16.1. CAMPIONAMENTO CON TAMPONE

Tale metodo di campionamento permette il controllo di superfici molto contaminate o irregolari,

anche in posizioni poco accessibili.

Consiste nello strisciare un tampone sterile imbevuto di soluzione eluente sterile su un’area nota

della superficie da campionare; in questo modo i microrganismi presenti sulla superficie

aderiscono al tampone che viene quindi immerso in un volume noto di soluzione eluente.

Successivamente un prelievo noto della soluzione eluente viene poi seminato, tal quale o diluito,

in piastra contenente terreno selettivo adatto per gli indicatori microbici che si vogliono

analizzare. Dopo incubazione, si contano le colonie cresciute e, tenendo conto dei volumi

prelevati e dell’area della superficie campionata, si esprime il risultato in UFC/cm2.

Materiale occorrente 1 confezione sterile SQUARE SAMPLE KIT contenente:

1 maschera 10x10 cm, 1 tampone sterile, 1 provetta con soluzione eluente

Procedimento

Scegliere la superficie da campionare ed eseguire le seguenti operazioni in prossimità di questa.

Aprire la confezione sterile di SQUARE SAMPLE KIT ed estrarre la provetta contenente la soluzioneeluente di liquido isotonico e il tampone di cotone sterile e lasciare all’interno la maschera in plasticasterile.

Inumidire leggermente il tampone nella soluzione eluente immergendolo con tecnica sterile.

Estrarre sterilmente la maschera in plastica dalla confezione ed appoggiarla sulla superficie dacampionare (100 cm2) reggendola per l’apposita linguetta sagomata.

Strofinare il tampone inumidito di eluente sulla superficie delimitata dalla mascherina con movimento azig-zag incrociato ripetuto per 2-3 volte.

Immergere il tampone nella provetta contenete la soluzione eluente e, facendo una lieve pressione sulbordo della provetta, spezzare il tampone all’interno della provetta.

Siglare la provetta indicando il tipo di superficie campionata e il nome dell’operatore.

Agitare vigorosamente la provetta tappata in modo da trasferire i microrganismi dal tamponeall’eluente.

Se non la si utilizza immediatamente, conservare la soluzione eluente in frigorifero fino al momentodell’uso ed utilizzarla per le semine in piastra.

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CAMPIONAMENTO CON PIASTRA DA CONTATTO

Rispetto al metodo di campionamento con tampone, tale metodo presenta delle limitazioni, in

quanto è utilizzabile solo su superfici secche o lisce e poco contaminate in quanto non permette

la diluizione del campione.

Consiste nel far aderire il terreno agarizzato, selettivo per la specie microbica che si vuole

determinare, contenuto in piastre Petri particolari, chiamate piastre da contatto, direttamente

sulla superficie che si vuole campionare; queste piastre hanno il terreno agarizzato che sporge

leggermente dalla base della piastra: in questo modo capovolgendo la piastra sulla superificie

che si vuole campionare i microrganismi aderiscono al terreno di coltura.

Dopo incubazione, si contano le colonie cresciute e, tenendo conto della superficie di contatto

della piastra, si esprime il risultato in UFC/cm2.

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LA CARICA BATTERICA TOTALE

La determinazione permette di valutare il numero di tutte le specie microbiche vive presenti nel

campione al momento dell’analisi, perciò rappresenta un indicatore dello stato igienico della

superficie campionata.

Campionamento con tampone

Materiale occorrente soluzione eluente campionata con SQUARE SAMPLE KIT

terreno di coltura AGAR CONTA in PIASTRA (ACP) sterile liquefatto 2 piastre Petri sterili 1 portaprovette 1 pipetta di plastica sterile da 1 mL bunsen

Procedimento

Siglare le piastre con il nome del gruppo, ACP e il volume di inoculo che verrà immesso.

Effettuare gli inoculi, utilizzando tecnica e pipetta sterili, come rappresentato nel seguente schema:

Soluzione eluente 10 mL

Inoculo nelle piastre 1 mL 0,1 mL

Terreno ACP Versare sui due inoculi 15-20 mL di terreno ACP liquefatto a 45°-50°C, chiudere le piastre e omogeneizzare con leggero movimento rotatorio. Lasciar solidificare il terreno senza spostare le piastre.

Incubazione 37°C per 48 ore

Lettura dei risultati

Contare le colonie isolate che si sono sviluppate in ciascuna piastra puntandole con un pennarello

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UFC) per cm2 di superficie in ogni piastra analizzatacome segue, quindi calcolarne la media:

Campionamento con piastra da contatto

Materiale occorrente 1 piastra da contatto con terreno AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) +

lecitina + polisorbato 80

Procedimento


Togliere il coperchio della piastra, capovolgerla e premere con una pressione costante il terreno dicoltura sulla superficie da campionare per almeno 1 minuto.

Riapplicare il coperchio, siglare la piastra e incubarla capovolta a 37°C per 48 ore.


Contare le colonie isolate che si sono sviluppate puntandole con un pennarello.

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UFC) per cm2 di superficie analizzata come segue,dove 20 cm2 rappresenta l’area del terreno venuto a contatto con la superficie campionata:

2

2

cm 20

1 piastra in contate colonie di n UFC/cm

2

2

cm 100

1

(mL) eluente soluzione di seminato volume

(mL) eluente soluzione di totale volumepiastra in contate colonie di n UFC/cm

142

16.4. I COLIFORMI

Con questo nome sono indicati un gran numero di batteri le cui caratteristiche sono descritte al

§ 13.1.

Campionamento con tampone

Materiale occorrente soluzione eluente campionata con SQUARE SAMPLE KIT

terreno di coltura AGAR ENTEROBATTERIACEAE-ESCHERICHIA COLI (AEEC) sterile liquefatto addizionato, il giorno stesso dell’uso, del supplemento cromogenico selettivo EE-EC 2 piastre Petri sterili 1 portaprovette 1 pipetta di plastica sterile da 1 mL bunsen

Procedimento

Siglare le piastre con il nome del gruppo, AEEC e il volume di inoculo che verrà immesso.

Effettuare gli inoculi, utilizzando tecnica e pipetta sterili, come rappresentato nel seguente schema:

Soluzione eluente 10 mL

Inoculo nelle piastre 1 mL 0,1 mL

Terreno AEEC Versare sui due inoculi 15-20 mL di terreno AEEC liquefatto a 45°-50°C, chiudere le piastre e omogeneizzare con leggero movimento rotatorio. Lasciar solidificare il terreno senza spostare le piastre.

Incubazione 37°C per 18-24 ore; in caso di crescita leggera, di pigmentazione scarsa o di assenza di crescita, re-incubare per ulteriori 18-24 ore.


Contare come Enterobatteriaceae tutte le colonie rosse e le colonie blu che si sono sviluppate inciascuna piastra puntandole con un pennarello.

Contare come Escherichia coli solo le colonie blu che si sono sviluppate in ciascuna piastra puntandolecon un pennarello.

Per ciascuna specie microbica calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UFC) per cm2 disuperficie in ogni piastra analizzata come segue, quindi calcolarne la media:

2

2

cm 100

1

(mL) eluente soluzione di seminato volume

(mL) eluente soluzione di totale volumepiastra in contate colonie di n UFC/cm

143


Materiale occorrente 1 piastra da contatto con terreno AGAR ROSSO VIOLETTO BILE

(ARVB)

Procedimento



Riapplicare il coperchio, siglare la piastra e incubarla capovolta a 37°C per 24 ore.


Contare tutte le colonie isolate, sia quelle colorate in rosse (lattosio fermentanti) che quelle nonpigmentate (lattosio non fermentanti) che si sono sviluppate puntandole con un pennarello.

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UFC) di coliformi totali per cm2 di superficie analizzatacome segue, dove 20 cm2 rappresenta l’area del terreno venuto a contatto con la superficiecampionata:

2

2

cm 20

1 piastra in contate colonie di n totali/cm Coliformi UFC

144

16.5. I LIEVITI E LE MUFFE


Materiale occorrente 1 piastra da contatto con terreno AGAR GLUCOSIO

CLORAMFENICOLO ESTRATTO DI LIEVITO (AGCEL)

Procedimento



Riapplicare il coperchio, siglare la piastra e incubarla capovolta a 25°C per 5 giorni.


Contare le colonie isolate che si sono sviluppate puntandole con un pennarello.

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UFC) per cm2 di superficie analizzata come segue,dove 20 cm2 rappresenta l’area del terreno venuto a contatto con la superficie campionata:

2

2

cm 20

1 piastra in contate colonie di n UFC/cm

145

Alunni

Classe

Data di consegna dei risultati

L’ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE SUPERFICI

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA TOTALE

Metodo di campionamento con tampone

Superficie analizzata

Terreno di coltura AGAR CONTA in PIASTRA (ACP)

Area analizzata 100 cm2

Volume totale di soluzione eluente 10 mL

Piastra Inoculo (mL) N° colonie contate UFC/cm2

Prima

Seconda

Media

Metodo di campionamento con piastra da contatto


Terreno di coltura AGAR TRIPTONE SOIA (ATS)


Numero di colonie contate

UFC/cm2

DETERMINAZIONE DEI COLIFORMI

Metodo di campionamento con tampone


Terreno di coltura AGAR ENETEROBATTERIACEAE-ESCHERICHIA COLI (AEEC)


Volume totale di soluzione eluente 10 mL

Piastra Inoculo (mL) N° colonie contate UFC/cm2

Prima

Seconda

Media



Terreno di coltura AGAR ROSSO VIOLETTO BILE (ARVB)



UFC/cm2

DETERMINAZIONE DEI LIEVITI E DELLE MUFFE



Terreno di coltura AGAR GLUCOSIO CLORAMFENICOLO ESTRATTO DI LIEVITO (AGCEL)


UFC/cm2

146

17. L’ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE ACQUE

L’acqua durante il suo ciclo fisico e biologico nella biosfera diviene anche un mezzo di trasporto

di sostanze patogene per l’uomo.

L’origine dell’inquinamento delle acque può essere naturale oppure associata alle attività

domestiche, agricole e industriali dell’uomo.

Le acque superficiali, spesso destinate al consumo umano, diventano il contenitore ultimo di

molteplici inquinanti chimici e biologici e quindi fonte di rischio per la collettività.

Le principali fonti di approvvigionamento di acqua potabile destinata al consumo umano sono i

laghi, i fiumi, i bacini naturali ed artificiali e le falde acquifere sotterranee, dalle quali l’acqua

sgorga spontaneamente (sorgenti) o a seguito di perforazione (pozzi).

Le acque superficiali contengono numerose specie microbiche, alcune delle quali patogene,

come i batteri intestinali (tipo, paratifo, dissenteria, colera), i virus (enterovirus, epatite A,

poliomielite) i protozoi e le uova di elminti (vermi) intestinali (tenie, ascaridi, ecc.) che si

schiudono nell’intestino originando una larva in grado di liberare decine di migliaia di uova.

147

http://www.irsa.cnr.it/ShPage.php?lang=it&pag=metod#

Metodi Analitici per le Acque

Questa nuova edizione del manuale “Metodi Analitici per le Acque” (ISBN 88-448-0083-7)

rappresenta il risultato di un'attività di revisione periodica e armonizzazione dei metodi analitici

per la caratterizzazione fisica, chimica, biologica e microbiologica delle acque. L'attività è stata

avviata nel 1996 dall'Istituto di Ricerca sulle Acque (IRSA) del CNR e nel 1999 l'APAT ha

partecipato alla revisione del manuale dopo l'attivazione di una convenzione tra i due Enti che

attesta l'impegno alla continuazione di un lavoro di integrazione dei metodi analitici per le acque

richiesti dalla normativa ma non ancora presenti sul manuale. L'opera si articola in tre volumi,

suddivisi in sezioni e capitoli singolarmente scaricabili come files PDF.

17.1. I REQUISITI MICROBIOLOGICI DELLE ACQUE

Acque destinate al consumo umano

Il D.P.R. 236/88, in attuazione della Direttiva CEE 80/778, concernente la qualità delle acque superficiali

destinate alla produzione di acqua potabile, stabilisce i requisiti di qualità delle acque dolci superficiali

utilizzate o destinate, dopo potabilizzazione, all’approvvigionamento idrico-potabile sulla base di parametri

organolettici, chimico-fisici e microbiologici.

Art. 2 – Campo di applicazione

Per acque destinate al consumo umano si intendono tutte le acque, qualunque ne sia l’origine, allo stato in

cui si trovano o dopo trattamento, che siano:

fornite al consumo,

ovvero utilizzate da imprese alimentari mediante incorporazione o contatto per la fabbricazione, iltrattamento, la conservazione, l’immissione sul mercato di prodotto e di sostanze destinate al consumoumano e che possono avere conseguenze per la salubrità del prodotto alimentare finale. Restanoescluse dal campo di applicazione del Decreto le acque minerali e termali.

È questo un concetto più estensivo di potabilità che comprende tutte le possibili forme di utilizzazione

dell’acqua.

Art. 3 – Requisiti di qualità

La legge prevede il rispetto di oltre 60 parametri organolettici, chimico-fisici, chimici e microbiologici.

http://www.irsa.cnr.it/ShPage.php?lang=it&pag=metod%23

148

La concentrazione massima ammissibile (CMA) di ciascun parametro non può essere superata in alcun

caso, rappresentando un livello di rischio a cui l’uomo non può essere sottoposto nemmeno per un breve

periodo di tempo.

Il valore guida (VG) costituisce un obiettivo al cui raggiungimento l’Ente preposto alla potabilizzazione

deve tendere e definisce il livello di sicurezza che dovrebbe essere mantenuto costantemente.

Art. 10 – Modelli di analisi e frequenza di campionamento

Per definire la qualità di un’acqua dal punto di vista microbiologico vengono ricercati di routine solo quei

microrganismi indicatori di contaminazione, la cui presenza può essere indice anche della presenza di

patogeni, cioè di microrganismi in grado di provocare una specifica patologia nell’organismo ospite.

Per gli indicatori di contaminazione fecale sono previsti tre controlli di routine (C1, C2, C3):

Controllo minimo (C1) Coliformi totali, Coliformi fecali

Controllo normale (C2) oltre ai parametri del controllo minimo, Streptococchi fecali

Controllo periodico (C3) oltre ai parametri del controllo normale, Carica batterica a 22°C e 36°C

La presenza di questi contaminanti oltre i limiti stabiliti per legge può essere indice anche della presenza di

patogeni, che vengono invece ricercati solo occasionalmente:

Controllo occasionale (C4) spore di clostridi solfito riduttori, Stafilococchi patogeni, Enterobatteri

patogeni, batteriofagi anti Escherichia coli, Enterovirus, Pseudomonas

aeruginosa, protozoi, elminti, alghe, funghi.

La frequenza con cui deve essere eseguito il campionamento dipende dalla popolazione servita, cioè dal

numero di abitanti che sono serviti da un unico acquedotto o da più acquedotti confluenti in un’unica rete di

distribuzione; per una popolazione variabile tra i 150.000 e i 300.000 abitanti (Es. Comune di Modena) la

normativa prevede:

Controllo minimo (C1) 360 prelievi e analisi/anno

Controllo normale (C2) 36 prelievi e analisi/anno

Controllo periodico (C3) 12 prelievi e analisi/anno

Controllo occasionale (C4) viene effettuato con una frequenza variabile, fissata dalle autorità

sanitarie competenti, secondo le circostanze.

Requisiti microbiologici

delle acque destinate al consumo umano

Parametro Valore guida

(VG)

Concentrazione massima

ammissibile (CMA)

Osservazioni

Coliformi totali 0 (5) UFC/100 mL

Non più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di 2 campioni consecutivi prelevati nello stesso punto possono eccedere tale limite, comunque mai il numero di Coliformi può essere superiore a 5 UFC/100 mL. La presenza di Coliformi fa ritenere l’acqua sospetta: in tal caso si dovranno avviare indagini e prendere provvedimenti del caso.

Coliformi fecali

0 UFC/100 mL

Streptococchi fecali

0 UFC/100 mL

Carica batterica a

36°C

10 UFC/mL Ogni superamento di tali valori che persista durante prelievi successivi richiede indagini ed accertamenti appropriati.

Carica batterica a

22°C

100 UFC/mL Per le acque disinfettate il valore della carica dopo il trattamento deve essere nettamente inferiore di quello prima del trattamento.

149

ACQUE MINERALI

Il D.L. n.105 del 25 gennaio 1992, in attuazione della Direttiva CEE 80/777 relativa alla utilizzazione e alla

commercializzazione delle acque naturali, considera acque minerali naturali le acque che, avendo origine da

una falda o giacimento sotterraneo, provengono da una o più sorgenti naturali o perforate e che hanno

caratteristiche igieniche particolari e proprietà favorevoli alla salute.

Il riconoscimento di un’acqua minerale è concesso dal Ministero della Sanità in relazione alla presentazione

di una apposita documentazione.

L’acqua deve possedere caratteristiche di purezza alla sorgente. È vietato sottoporre l’acqua minerale

naturale a trattamenti di potabilizzazione. Sono vietati l’aggiunta di sostanze battericide o batteriostatiche e

qualsiasi altro trattamento suscettibile di modificare il microbismo dell’acqua minerale naturale. È consentita

l’aggiunta di anidride carbonica.

La composizione dell’acqua minerale potrebbe non rientrare nei limiti previsti per le acque potabili.

Le caratteristiche delle acque minerali naturali devono essere valutate sul piano geologico, organolettico,

fisico, chimico-fisico, chimico, microbiologico, farmacologico, clinico e fisiologico.

Per quanto riguarda gli indicatori microbiologici di contaminazione fecale, i limiti di carica microbica sia su

campioni prelevati alla sorgente, sia alla fine della catena di imbottigliamento e su campioni prelevati dal

commercio sono indicati nella successiva Tabella:


delle acque minerali naturali

Parametro Valore guida (VG)

Concentrazione massima ammissibile

(CMA)

Coliformi fecali ed Escherichia coli 0 UFC/250 mL

Streptococchi fecali 0 UFC/250 mL

Carica batterica alla sorgente a 36°C 5 UFC/mL

a 22°C 20 UFC/mL

ACQUE DA PISCINA

Le acque da piscina ospitano numerose specie batteriche provenienti dalla pelle, dalla saliva e dalle

secrezioni nasali ed orofaringee che formano una sottile pellicola sulla superficie dell’acqua, meno soggetta

alla clorazione.

Il giudizio favorevole o sfavorevole è subordinato alla determinazione del cloro residuo nei vari punti della

vasca ed ai parametri batteriologici.

La concentrazione del cloro residuo nella vasca deve essere compresa tra 0,4 e 0,6 mg/L e in nessun

momento si può superare la soglia di 1 mg/L.

Per quanto riguarda gli indicatori microbiologici di contaminazione, i limiti di carica microbica stabiliti per

legge sono indicati nella successiva Tabella:


delle acque da piscina

Parametro Concentrazione massima ammissibile

(CMA)

Coliformi totali 1 UFC/100 mL

Coliformi fecali 10 UFC/100 mL

Conta batterica a 37°C 200 UFC/mL

Staphylococcus aureus 10 UFC/100 mL

Pseudomonas spp 30 UFC/100 mL

150

ACQUE DA BALNEAZIONE

Per acque da balneazione si intendono le acque dolci, correnti o di lago, e le acque marine nelle quali la

balneazione non è espressamente autorizzata ovvero non vietata.

La zona di balneazione è intesa per profondità non inferiore a 10 m e distanze dalla spiaggia fino a 300 m.

Per “stagione balneare” si intende il periodo compreso tra il 1 maggio e il 30 settembre, fatta salva la

facoltà di ampliare la stagione balneare secondo le esigenze o le consuetudini locali.

Il periodo di campionamento inizia un mese prima della stagione balneare e termina con la fine della stessa.

Per quanto riguarda gli indicatori microbiologici di contaminazione, i limiti di carica microbica stabiliti per

legge sono indicati nella successiva Tabella:


delle acque da balneazione

Parametro Concentrazione massima ammissibile

(CMA)

Coliformi totali 2000 UFC/100 mL

Coliformi fecali 100 UFC/100 mL

Streptococchi fecali 100 UFC/100 mL

Salmonella spp 0 UFC/1000 mL

17.2. LE MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO

Il prelievo dei campioni di acqua per l’esame microbiologico deve essere sempre effettuato con

recipienti sterili e seguendo le normali norme di asepsi. Occorre tuttavia tener presente che

l’osservanza di tali norme deve essere scrupolosamente rispettata se si tratta di un campione di

acqua destinato all’uso potabile, mentre non è richiesta per campioni di acqua destinata ad altri

usi

Norme generali di campionamento per l’acqua potabile

Evitare l’inquinamento del campione da parte di agenti microbiologici esterni.

Utilizzare contenitori sterili (solo per acque potabili) ed aprirli appena prima del prelievo.

Il recipiente non deve essere avvinato prima del prelievo.

Se il prelievo è effettuato da un rubinetto, far scorrere acqua e flambare il rubinetto (solo se il materiale

lo consente) prima del prelievo.

Se il prelievo è effettuato per immersione della bottiglia (mari, laghi, fiumi, raccolte idriche in genere),

la bottiglia va immersa nell’acqua con una pinza o con altro strumento idoneo, evitando di prelevarla in

superficie.

Se l’acqua è stata clorata (acqua da piscina e, di solito, quella di acquedotto) occorre aggiungere

sterilmente nella bottiglia 0,1 mL di una soluzione acquosa al 10% di tiosolfato di sodio ogni 100 mL di

capacità della bottiglia.

La bottiglia non va riempita fino all’orlo, ma deve rimanere un po’ d’aria.

Il campione deve essere conservato in frigorifero a 4°C prima di essere esaminato e deve essere

processato entro le 24 ore dal momento del prelievo

Luisa Capitani – Modulo D – L’analisi microbiologica delle acque 151

Luisa Capitani – Modulo D – L’analisi microbiologica delle acque 152

CARICA BATTERICA TOTALE E PROVA PRESUNTIVA DEI COLIFORMI TOTALI E DEGLI STREPTOCOCCHI FECALI

9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL Volume di BAD nelle provette

10-1 10-2 10-3 10-4 Siglatura delle provette di diluizione

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL Inoculo nelle provette di diluizione

9 mL 9 mL 9 mL 9 mL…… Volume di Diluente D nelle provette

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL…… Inoculo nelle piastre

100/22 100/37 10-1/22 10-1/37 10-2/22 10-2/37 10-3/22 10-3/37 Siglatura delle piastre

9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL… Volume di BLT nelle provette con

campanella

Acqua

n° __

Coliformi

totali

Prova

presuntiva

MPN

Streptococchi

fecali

Prova

presuntiva

MPN

Carica

batterica

153

Materiale occorrente campione di acqua n° _______

soluzione DILUENTE (D)

terreno di coltura AGAR CONTA in PIASTRA (ACP) liquefatto

terreno di coltura BRODO LAURIL TRIPTONE (BLT)

terreno di coltura BRODO AZIDE DESTROSIO (BAD)

2 portaprovette

21 provette sterili con tappo (oppure 22 solo per chi deve fare anche la diluizione 10-4)

8 piastre Petri

1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente)

1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare il terreno BLT)

1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare il terreno BAD)

4 (oppure 5 solo per chi deve inoculare anche la diluizione 10-4) pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi)

9 campanelle di Durham sterili

Bunsen

Procedimento

Siglare le 3 o 4 provette di diluizione.

Siglare le 8 piastre Petri.

Con pipetta sterile di vetro da 10 mL versare 9 mL di soluzione di diluente D in ciascuna delle 3 provetteD.

Con pipetta sterile di vetro da 10 mL versare 9 mL di BLT in ciascuna delle 9 provette BLT.

Mettere 1 campanella Durham capovolta in ciascuna delle 9 provette BLT senza inglobare aria.

Siglare le 9 provette BLT a tre a tre con la diluizione da seminare.

Con pipetta sterile di vetro da 10 mL versare 9 mL di BAD in ciascuna delle 9 provette BAD.

Siglare le 9 provette BAD a tre a tre con la diluizione da seminare.

Con la pipetta sterile da 1 mL rossa eseguire gli inoculi e la diluizione.

Con la pipetta sterile da 1 mL verde eseguire gli inoculi e la diluizione.

Con la pipetta sterile da 1 mL nera eseguire gli inoculi e la diluizione.

Con la pipetta sterile da 1 mL blu eseguire gli inoculi e la diluizione.

Con la pipetta sterile da 1 mL viola eseguire gli inoculi.

Versare il terreno liquefatto ACP nelle 8 piastre Petri per un altezza di 4-5 mm, roteare leggermente peromogeneizzare e lasciare solidificare.

Incubare le provette BLT a 37°C per 48 ore all’interno del portaprovette.

Incubare le provette BAD a 37°C per 48 ore all’interno del portaprovette.

Incubare 4 piastre capovolte a 22°C per 5 giorni.

Incubare 4 piastre capovolte a 37°C per 48 ore.

154

17.3. LA CARICA BATTERICA TOTALE

Metodo colturale in piastra mediante semina per inclusione

Il conteggio delle colonie, una volta ritenuto l’esame più importante nell’ambito della

microbiologia delle acque, ha oggi un significato indicativo e permette di evidenziare

microrganismi eterotrofi aerobi ed anaerobi facoltativi presenti nelle acqua.

La flora che si sviluppa a 22°C veniva tradizionalmente considerata espressione della flora

batterica autoctona dell’acqua, cioè dovuta alle specie telluriche ambientali (suolo ed aria) che

si adattano facilmente all’ambiente idrico. La flora che si sviluppa a 36°C era invece considerata

espressione della presenza di batteri ospiti degli animali a sangue caldo.

Attualmente tale distinzione non viene considerata valida in senso stretto. Inoltre la conta

batterica deve essere considerata un indice di qualità integrativo ad altri parametri analitici.

Si tratta di un’indagine da utilizzare quasi esclusivamente nell’analisi delle acque per il consumo

umano in considerazione della sua utilità per la valutazione dell’efficacia dei trattamenti

disinfettanti.

Materiale occorrente campione di acqua

terreno di coltura AGAR CONTA in PIASTRA (ACP) sterile liquefatto soluzione DILUENTE (D) 8 piastre Petri sterili 3 provette sterili con tappo 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente) 4 pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi) bunsen

Procedimento

Siglare le piastre con nome gruppo, con la diluizione del campione e con la temperatura di incubazionecome rappresentato nella successiva figura (ad esempio, nome, 100, 22°C e così via).

Allestire 3 provette con 9 mL di Diluente (D) ciascuna.

Utilizzando 4 diverse pipette da 1 mL, una per ogni diluizione che si vuole seminare, diluire eprelevare il campione in esame e gli inoculi seguendo il seguente schema:

diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3

Diluente (D) nelle provette 9 mL 9 mL 9 mL

1 1 mL 1 mL 1 mL

Inoculo nelle piastre

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Campione nell’inoculo 1 mL 1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,01 mL 0,01 mL 0,001 mL 0,001 mL

Terreno ACP Versare nelle piastre 15-20 mL di terreno ACP liquefatto a 45°-50°C, chiudere e omogeneizzare con leggero movimento rotatorio. Lasciar solidificare il terreno senza spostare le piastre.

Incubazione una serie di diluizioni a 22°C per 120 ore (5 giorni); l’altra serie di diluizioni a 36°C per 48 ore

Campione di acqua

155


Suddividere le piastre incubate a 22°C da quelle incubate a 36°C.

Per ciascuna temperatura di incubazione contare le colonie isolate che si sono sviluppate in ciascunapiastra puntandole con un pennarello.

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UCF) per mL di campione in ogni piastra analizzatacome segue, quindi calcolarne la media:

piastra 100 n° colonie contate x fattore di diluizione 1 = A UFC/mL

piastra 10-1 n° colonie contate x fattore di diluizione 10 = B UFC/mL

piastra 10-2 n° colonie contate x fattore di diluizione 100 = C UFC/mL

piastra 10-3 n° colonie contate x fattore di diluizione 1000 = D UFC/mL

4

UFC/mL D)CB(A C......... aUFC/mL

Esempio di risultati

piastra 100 250 x 1 = 250 UFC/mL

piastra 10-1 150 x 10 = 1500 UFC/mL

piastra 10-2 80 x 100 = 8000 UFC/mL

piastra 10-3 50 x 1000 = 50000 UFC/mL

41,5x104

UFC/mL 50000)80001500(250 C......... aUFC/mL

Metodo colturale in piastra mediante filtrazione su membrana


1 piastra con cartone nutriente Standard TTC 1 membrana filtrante da 0,45µm acqua o soluzione fisiologica sterile cilindro graduato sterile (o pipetta sterile) pinze di metallo bunsen

Procedimento

Preparare la piastra con il cartone nutriente Standard TTC secondo le seguenti modalità: sollevareleggermente il coperchio ed addizionare sul cartone circa 3 mL di acqua sterile; deve essere visibile unaleggera eccedenza di liquido nella zona periferica attorno al cartone, il che indica che si è raggiunto illivello di umidità ottimale.

Eseguire la filtrazione su membrana con le modalità descritte in precedenza (§ 14.3.), scegliendo ilvolume di campione da filtrare in base alla sua provenienza, secondo quanto indicato nella successivaTabella.

Depositare sterilmente la membrana sul terreno, siglare la piastra e incubarla non capovolta a 30°Cper 2 – 5 giorni.

Provenienza del campione Volumi da filtrare per il conteggio della Carica

batterica totale nelle acque (mL)

Acqua potabile e da piscina 100

Sorgenti, pozzi, laghi e bacini 100 50 10

Acqua di rete e da balneazione 10 1 0,1

Fiume 1 0,1 0,01 0,001

Acque nere clorate 1 0,1 0,01

Acque nere non trattate 0,1 0,01 0,001 0,0001

156


Su questo terreno si sviluppano prevalentemente batteri; la maggior parte delle colonie appare di colorerosso per la riduzione del Trifenil Tetrazolio Cloruro, incolore, a formazano rosso.

In base al volume di acqua filtrato, rapportare il n° delle colonie contate a UFC/100 mL:

(mL) filtrato campione di volume

mL 100 piastra in contate colonie di n mL UFC/100

17.4. I COLIFORMI

Determinazione dei Coliformi totali mediante tecnica MF


1 piastra con cartone nutriente ENDO 1 membrana filtrante da 0,45µm acqua o soluzione fisiologica sterile cilindro graduato sterile (o pipetta sterile) pinze di metallo bunsen

Procedimento

Preparare la piastra con il cartone nutriente ENDO secondo le seguenti modalità: sollevareleggermente il coperchio ed addizionare sul cartone circa 3 mL di acqua sterile; deve essere visibile unaleggera eccedenza di liquido nella zona periferica attorno al cartone, il che indica che si è raggiunto illivello di umidità ottimale.


Depositare sterilmente la membrana sul terreno, siglare la piastra e incubarla non capovolta a 37°Cper 24 ore.

Provenienza del campione Volumi da filtrare per il conteggio dei Coliformi

totali nelle acque (mL)

Acqua potabile e da piscina 100

Sorgenti, pozzi, laghi e bacini 100 50 10

Acqua di rete e da balneazione 10 1 0,1

Fiume 1 0,1 0,01 0,001

Acque nere clorate 1 0,1 0,01

Acque nere non trattate 0,1 0,01 0,001 0,0001


Conteggio dei Coliformi totali: contare tutte le colonie nettamente delineate di colore rosso scuro cono senza riflesso metallico.

Conteggio presuntivo (da confermare con prove specifiche) di Escherichia coli: contare lecolonie con riflesso metallico verdastro (dovuto alla fucsina) e un punto rosso scuro nella parteposteriore della membrana.



mL 100 piastra in contate colonie di n mL totali/100 Coliformi di UFC

158

Determinazione dei Coliformi fecali mediante tecnica MF


1 piastra con cartone nutriente COLIFORMI FECALI (M-FC) 1 membrana filtrante da 0,45 µm acqua o soluzione fisiologica sterile cilindro graduato sterile (o pipetta sterile) pinze di metallo bunsen

Procedimento

Preparare la piastra con il cartone nutriente M-FC secondo le seguenti modalità: sollevareleggermente il coperchio ed addizionare sul cartone circa 3 mL di acqua sterile; deve essere visibile unaLeggera eccedenza di liquido nella zona periferica attorno al cartone, il che indica che si è raggiunto illivello di umidità ottimale.



Provenienza del campione Volumi da filtrare per il conteggio

dei Coliformi fecali nelle acque (mL)

Sorgenti, pozzi, laghi e bacini 100 50

Acque potabili, immissioni di fiumi in canali, da balneazione 50 10 1

Impianto di trattamento delle acque nere, acque riciclate 10 1 0,1

Fiumi, stagni, acqua piovana 1 0,1 0,01

Fognature cittadine non trattate 0,1 0,01 0,001


Conteggio dei Coliformi fecali: contare tutte le colonie con diametro di 1-2 mm di colore blu-grigioazzurro.



mL 100 piastra in contate colonie di n mL fecali/100 Coliformi di UFC

Determinazione dei Coliformi mediante tecnica MPN

Prova presuntiva per Coliformi totali


terreno di coltura BRODO LAURIL TRIPTONE (BLT) soluzione DILUENTE (D) 11 provette sterili con tappo 9 campanelle di Durham sterili 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente) 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare il terreno BLT) 3 pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi) portaprovette bunsen

159

Procedimento


Allestire 9 provette con 9 mL di Brodo Lauril Triptone (BLT) ciascuna ed introdurre in ognuna 1campanella di Durham capovolta.

Utilizzando 3 diverse pipette da 1 mL, una per ciascuna diluizione che si vuole seminare,procedere con le diluizioni del campione ed effettuare gli inoculi come rappresentato nel seguenteschema:

diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2

Diluente (D) nelle provette 9 mL 9 mL

1 mL 1 mL

BLT nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo nelle provette con campanella 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Campione nell’inoculo (mL) 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01



Considerare positive le provette in cui è presente gas nella campanella e/o intorbidamento nelbrodo di coltura.

Contare per ciascuna serie di diluizioni il numero delle provette positive, come indicato nel seguenteesempio:

ESEMPIO DI RISULTATI DELLA PROVA PRESUNTIVA


Provette con BLT + + + - + - + + -

Prova di conferma per Coliformi totali

Materiale occorrente terreno di coltura BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB)

tutte le provette positive della prova presuntiva dei Coliformi totali altrettante provette sterili con tappo altrettante campanelle di Durham sterili portaprovette 1 ansa di metallo bunsen

CONSERVARE LE PROVETTE POSITIVE PER LE PROVE DI CONFERMA

SMALTIRE LE PROVETTE NEGATIVE

campione di acqua

160

Procedimento

Allestire con 9 mL di Brodo Verde Brillante Bile (BVBB) un numero di provette pari ai tubi risultatipositivi nella prova presuntiva in BLT ed introdurre in ciascuna 1 campanella di Durham capovolta.

Inoculare le provette di BVBB con 1 ansata prelevata dalle provette positive di BLT come indicato nelseguente schema (Attenzione: sterilizzare l’ansa alla fiamma e raffreddarla ad ognipassaggio):

PROVA PRESUNTIVA diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2

Provette positive di BLT


Esempio di risultati + + + - + - + + -

PROVA DI CONFERMA diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2

BVBB nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo da trapiantare nelle provette con BVBB 1 ansata dalle rispettive provette di BLT



Considerare positive le provette in cui è presente gas nella campanella.


ESEMPIO DI RISULTATI DELLA PROVA DI CONFERMA

Esempio di risultati + - + - + - + - -diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2


Ricavare dalla Tabella dell’MPN l’indice MPN e moltiplicarlo per 10.

Per l’esempio riportato si ha:

20010 20 campionemL totali/100 Coliformi di MPN

Prova di conferma per Coliformi fecali

Materiale occorrente terreno di coltura BRODO EC (BEC)


161

Procedimento

Allestire con 9 mL di Brodo EC (BEC) un numero di provette pari ai tubi risultati positivi nella provapresuntiva in BLT ed introdurre in ciascuna 1 campanella di Durham capovolta.

Inoculare le provette di BEC con 1 ansata prelevata dalle provette positive di BLT come indicato nelseguente schema (Attenzione: sterilizzare l’ansa alla fiamma e raffreddarla ad ognipassaggio):






BEC nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo da trapiantare nelle provette con BEC 1 ansata dalle rispettive provette di BLT






Esempio di risultati - - + - + - - - -diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2




7010 7 campionemL fecali/100 Coliformi di MPN

Prova di conferma per Escherichia coli

Materiale occorrente terreno di coltura BRODO EC MUG (BECMUG)

tutte le provette positive della prova presuntiva dei Coliformi totali altrettante provette sterili con tappo altrettante campanelle di Durham sterili portaprovette 1 ansa di metallo bunsen lampada UV Reattivo di Kovacs

162

Procedimento

Allestire con 9 mL di Brodo EC MUG (BECMUG) un numero di provette pari ai tubi risultati positivinella prova presuntiva in BLT ed introdurre in ciascuna 1 campanella di Durham capovolta.

Inoculare le provette di BECMUG con 1 ansata prelevata dalle provette positive di BLT come indicatonel seguente schema (Attenzione: sterilizzare l’ansa alla fiamma e raffreddarla ad ognipassaggio):






BECMUG nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo da trapiantare nelle provette con BECMUG 1 ansata dalle rispettive provette di BLT



Collocare le provette sotto la lampada UV e considerare positive le provette fluorescenti.

Ulteriore prova di conferma: eseguire in tutte le provette fluorescenti il test di Produzione diindolo, addizionando 1-2 mL del Reattivo di Kovacs: la formazione di una colorazione rossa nello stratosuperficiale è indice positivo della formazione di indolo.

Contare per ciascuna serie di diluizioni il numero delle provette positive,come indicato nel seguente esempio:


Esempio di risultati - - + - - - - - -diluizione 100 diluizione

10-1 diluizione 10-2




4010 4 campionemL coli/100 aEscherichi di MPN

17.5. GLI STREPTOCOCCHI FECALI

Determinazione mediante tecnica MF


1 piastra con cartone nutriente AZIDE (o di SLANETZ BARTLEY) 1 membrana filtrante da 0,45 µm

163

soluzione fisiologica sterile cilindro graduato sterile (o pipetta sterile) pinze di metallo bunsen Acqua ossigenata al 3%

Procedimento

Preparare la piastra con il cartone nutriente AZIDE secondo le seguenti modalità: sollevareleggermente il coperchio ed addizionare sul cartone circa 3 mL di acqua sterile; deve essere visibile unaleggera eccedenza di liquido nella zona periferica attorno al cartone, il che indica che si è raggiunto illivello di umidità ottimale.

Eseguire la filtrazione su membrana con le modalità descritte in precedenza (§ 14.3.), scegliendo ilvolume di campione da filtrare in base alla sua provenienza secondo quanto già indicato per il conteggiodei Coliformi fecali.



Conteggio degli Streptococchi fecali: contare tutte le colonie puntiformi (circa 1 mm di diametro)con contorni perfetti di colore tra il rosso e il rosso-bruno.

Prova di conferma: eseguire direttamente sulla piastra il test di Ricerca della catalasi addizionandosopra ad una colonia tipica 1-2 gocce di Acqua ossigenata al 3%: non si deve osservare lo sviluppodi gas (ossigeno).



mL 100 piastra in contate colonie di n mL fecali/100 chiStreptococ di UFC

Determinazione mediante tecnica MPN

Prova presuntiva


terreno di coltura BRODO AZIDE DESTROSIO (BAD) soluzione DILUENTE (D) 11 provette sterili con tappo 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente) 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare il terreno BAD) 3 pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi) portaprovette bunsen

Procedimento


Allestire 9 provette con 9 mL di Brodo Azide Destrosio (BAD) ciascuna.


164

diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2


1 mL 1 mL

BAD nelle provette 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo nelle provette 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL




Considerare positive le provette in cui è presente intorbidamento nel brodo di coltura.




Provette con BAD + - - - - - + - -

Prova di conferma

Materiale occorrente terreno di coltura BRODO AZIDE DESTROSIO ETILE VIOLETTO

(BADEV) tutte le provette positive della prova presuntiva degli Streptococchi fecali altrettante provette sterili con tappo portaprovette 1 ansa di metallo bunsen



campione di acqua

165

Procedimento

Allestire con 9 mL di Brodo Azide Destrosio Etile Violetto (BADEV) un numero di provette pari aitubi risultati positivi nella prova presuntiva in BAD.

Inoculare le provette di BADEV con 1 ansata prelevata dalle provette positive di BAD come indicato nelseguente schema (Attenzione: sterilizzare l’ansa alla fiamma e raffreddarla ad ognipassaggio):


Provette positive di BAD


Esempio di risultati + - - - - - + - -


BADEV nelle provette 9 mL 9 mL

Inoculo da trapiantare nelle provette con BADEV 1 ansata dalle rispettive provette di BAD



Considerare positive le provette in cui è presente intorbidamento nel brodo di colturaaccompagnato da un deposito grigio-violetto sul fondo del tubo.



Esempio di risultati + - - - - - + - -diluizione 100 diluizione 10-1 diluizione 10-2




7010 7 campionemL fecali/100 chiStreptococ di MPN

166

Alunni

Classe


L’ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE ACQUE



Campione in esame


Volume prelevato (mL)

Piastre incubate a 22°C per 5 giorni

N° di colonie contate

Fattore di diluizione

UFC/mL

100 1

10-1 10

10-2 100

10-3 1000

Media

Piastre incubate a 36°C per 48 ore

N° di colonie contate

Fattore di diluizione

UFC/mL

100 1

10-1 10

10-2 100

10-3 1000

Media

Metodo colturale in piastra mediante tecnica delle membrane filtranti

Campione in esame

Terreno di coltura Cartone nutriente Standard TTC

Volume filtrato


UFC /100 mL

DETERMINAZIONE DEI COLIFORMI TOTALI


Campione in esame

Terreno di coltura Cartone nutriente ENDO

Volume filtrato


UFC Coliformi totali/100 mL

Metodo colturale in provetta mediante tecnica del numero più probabile

Campione in esame

Terreno di coltura (prova presuntiva) BRODO LAURIL TRIPTONE (BLT)

Terreno di coltura (prova di conferma) BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB)

Diluizioni seminate

Campione nell’inoculo (mL) Combinazioni positive dopo prova di conferma

MPN Coliformi totali/100 mL

167

Alunni

Classe


L’ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE ACQUE

DETERMINAZIONE DEI COLIFORMI FECALI


Campione in esame

Terreno di coltura Cartone nutriente COLIFORMI FECALI (M-FC)

Volume filtrato


UFC Coliformi fecali/100 mL


Campione in esame


Terreno di coltura (prova di conferma) BRODO EC (BEC)

Diluizioni seminate


MPN Coliformi fecali/100 mL

DETERMINAZIONE DI ESCHERICHIA COLI


Campione in esame


Terreno di coltura (prova di conferma) BRODO EC MUG (BECMUG)

Diluizioni seminate


MPN Escherichia coli/100 mL

DETERMINAZIONE DEGLI STREPTOCOCCHI FECALI


Campione in esame

Terreno di coltura Cartone nutriente AZIDE

Volume filtrato


UFC Streptococchi fecali/100 mL


Campione in esame

Terreno di coltura (prova presuntiva) BRODO AZIDE DESTROSIO (BAD)

Terreno di coltura (prova di conferma) BRODO AZIDE DESTROSIO ETILE VIOLETTO (BADEV)

Diluizioni seminate


UFC Streptococchi fecali/100 mL

168

18. L’ANALISI MICROBIOLOGICA DEGLI ALIMENTI

Gli alimenti non rivestono solo un’importanza nutritiva per l’uomo, ma spesso rappresentano

ottimi terreni di coltura per i microrganismi Gli alimenti possono essere preservati dalla

fermentazione, oppure possono subire un processo di deterioramento ad opera dei

microrganismi in essi presenti.

I microrganismi possono anche essere utilizzati per trasformare alimenti naturali in specialità

gastronomiche come vini, formaggi, salumi, salamoie, salsa di soia, birra e altri prodotti alcolici.

Gli alimenti possono inoltre rappresentare un veicolo per la trasmissione di malattie; pertanto

l’individuazione e il controllo dei germi patogeni e dei microrganismi responsabili del

deterioramento alimentare costituiscono una parte importante della microbiologia alimentare.

La valutazione igienico-sanitaria degli alimenti è basata sulla determinazione dell’assenza di

microrganismi patogeni per l’uomo, nonché di microrganismi-indice (che presentano cioè affinità

in relazione alla localizzazione, la modalità di trasmissione, il comportamento) e di

microrganismi-indicatori (presenti cioè nelle materie prime impiegate nell’industria alimentare, i

quali vengono inattivati o ridotti per effetto dei trattamenti applicati).

La presenza di alcuni germi indicatori entro certi limiti è tollerata, mentre è precluso il

rinvenimento anche di un solo microrganismo-indice per unità determinata di prodotto.

Ad esempio, Escherichia coli è un batterio-indice per il latte pastorizzato (indica un

inquinamento in atto), mentre è un batterio-indicatore per i formaggi od il burro. Così gli

Enterococchi sono degli indicatori biologici di inquinamento recente, mentre Clostridium

perfringens segnala un inquinamento di vecchia data.

Durante tutto il processo di lavorazione alimentare, dal produttore al consumatore, i

microrganismi possono alterare le caratteristiche organolettiche e le proprietà nutritive degli

alimenti, come schematizzato nella seguente illustrazione:

169

La conformità del prodotto va riferita a criteri di qualità stabiliti dalla legge, che definisce:

il numero delle unità campionarie (n) che devono essere sottoposte ad analisi

microbiologica;

il valore limite del numero di batteri (m): il risultato è considerato soddisfacente se il

numero di batteri in tutte le unità campionarie è inferiore ad m;

il valore massimo tollerato del numero di batteri (M): il risultato è considerato

insoddisfacente se il numero di batteri, in una o più delle unità campionarie, è superiore

ad M;

il numero delle unità campionarie il cui valore può essere compreso tra m ed M

(c): il campione viene considerato ancora accettabile se il contenuto batterico delle altre

unità campionarie è uguale o inferiore ad m.

In base a questi parametri, un alimento viene definito di:

Qualità accettabile quando il contenuto microbico di ciascun parametro determinato è

inferiore a m UFC/g o mL di prodotto.

Qualità marginale quando viene superato il valore m UFC/g o mL di prodotto, ma il

grado di contaminazione microbica non raggiunge la soglia M, al di sopra della quale si ha

una

Qualità inaccettabile quando viene superato sia il valore m che il valore M.

Il consumo di una alimento comporta quindi sempre un rischio, il quale deve essere calcolato e

contenuto entro valori accettabili: l’auspicabile “rischio zero” è, di fatto, un’utopia.

Requisiti di qualità microbiologica di alcuni alimenti

Latte fresco pastorizzato n c m M

Tenore in germi a 21°C per mL (dopo incubazione a 6°C per 5 giorni)

5 1 5 x 104 5 x 105

Coliformi totali per mL 5 1 0 5

Salmonella spp in 25 mL 5 0 0 0

Listeria monocytogenes in 25 mL 5 0 0 0

Latte in polvere e prodotti in polvere a base di latte

n c m M

Coliformi totali per g 5 2 0 10

Staphylococcus aureus per g 5 2 10 100

Salmonella spp. in 25 g 10 0 0 0

Listeria monocytogenes in 25 mL 5 0 0 0

170

Prodotti gelati a base di latte (compresi gelati e creme gelate)

n c m M




Listeria monocytogenes in 25 g 5 0 0 0

Formaggi a base di latte crudo e latte trattato termicamente

n c m M

Escherichia coli per g 5 2 104 105



Listeria monocytogenes in 25 g 5 0 0 0

Carni macinate n c m M

Germi aerobi mesofili per g 5 2 5 x 105 5 x 106




Listeria monocytogenes per g 3 2 11 110

Paste all’uovo artigianali fresche non confezionate

n c m M

Carica microbica totale a 32°C per g 5 2 105 106




Preparati a base di uova crude (maionese, salse, ecc.)

M

Batteri aerobi mesofili per g o mL 105

Enterobatteri (Enterobatteriaceae) per g o mL 102

Staphylococcus aureus in 1 g o mL 0

Salmonella spp. in 25 g o mL 0

Surgelati (carne e preparazioni a base di carne)

n c m M

Conta totale per g 5 2 5 x 105 5 x 106

Escherichia coli per g 5 1 50 5 x 102



Staphylococcus aureus per g 5 1 50 5 x 102

171

Surgelati (piatti precucinati)

n c m M

Conta totale per g 5 < 3 x 105

Coliformi totali per g 5 < 103

Escherichia coli per g 5 < 10

Staphylococcus aureus per g 5 < 102



Surgelati (patate fritte)

n c m M

Conta totale per g 5 2 104 105

Coliformi totali per g 5 2 10 5 x 102




18.1. IL SISTEMA DI CONTROLLO HACCP

La legislazione italiana, in attuazione della Direttiva CEE 93/43, prevede che tutte le imprese agroalimentari

(produzione, commercializzazione e vendita) utilizzino il Sistema HACCP come metodologia di controllo sulla

qualità dal punto di vista igienico dei alimenti.

Il Sistema HACCP è una metodologia di controllo, alternativa al controllo di tipo ispettivo tradizionale.

HACCP significa Hazard Analysis Critical Control Point, ovvero Analisi dei pericoli e controllo dei

punti critici; in sostanza è una metodologia preventiva per assicurare l'idoneità dei prodotti alimentari

attraverso l'analisi dei potenziali pericoli microbiologici, chimici e fisici che sono presenti nel ciclo produttivo

e l'identificazione dei punti critici del processo che possono essere posti sotto monitoraggio per la

prevenzione, eliminazione, o riduzione dei pericoli a livelli accettabili.

Il sistema di controllo HACCP viene attuato secondo le seguenti fasi operative:

1. analisi dei potenziali pericoli alimentari nelle attività di un'impresa agro-alimentare;

2. individuare, durante le attività di un'impresa agro-alimentare, i punti critici in cui possono

verificarsi rischi alimentari e stabilire quali punti sono determinanti per la sicurezza

alimentare;

3. individuare e applicare procedure di controllo e di sorveglianza dei punti critici;

4. riesaminare periodicamente e ad ogni modifica dell’attività, l'analisi dei rischi alimentari, i

punti critici e le procedure di controllo e di sorveglianza.

172

18.2. LA CARICA BATTERICA TOTALE


La carica microbica totale in un determinato alimento permette di valutare il numero di germi

vivi presenti nel campione al momento dell’analisi.

Essa riveste quindi particolare importanza per stabilire le condizioni igieniche delle materie

prime utilizzate, del prodotto dopo la manipolazione ed il rispetto di adeguate procedure di

conservazione sia durante il trasporto che lo stoccaggio degli alimenti stessi.

Materiale occorrente campione di alimento

terreno di coltura AGAR CONTA in PIASTRA (ACP) sterile liquefatto soluzione DILUENTE (D) 1 sacchetto sterile 4 piastre Petri sterili 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente) 4 pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi) 3 provette sterili con tappo bunsen

Procedimento

Siglare le piastre con nome gruppo e con la diluizione del campione.


Utilizzando 4 diverse pipette da 1 mL diluire e prelevare il campione in esame e gli inoculi seguendo ilseguente schema:

diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3 diluizione 10-4

Diluente (D) nelle provette 9 mL 9 mL 9 mL

1 1 mL 1 mL 1 mL

Inoculo nelle piastre 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Campione nell’inoculo 0,1 g o mL 0,01 g o mL 0,001 g o mL 0,0001 g o mL

Terreno ACP Versare nelle piastre 15-20 mL di terreno ACP liquefatto a 45°-50°C, chiudere e omogeneizzare con leggero movimento rotatorio. Lasciar solidificare il terreno senza spostare le piastre.


In sacchetto sterile omogeneizzare

10 g o mL di campione + 90 mL Diluente

173


Contare le colonie isolate che si sono sviluppate in ciascuna piastra puntandole con un pennarello.

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UCF) per mL di campione in ogni piastra analizzatacome segue, quindi calcolarne la media:

piastra 10-1 n° colonie contate x fattore di diluizione 10 = A UFC/g o mL

piastra 10-2 n° colonie contate x fattore di diluizione 100 = B UFC/g o mL

piastra 10-3 n° colonie contate x fattore di diluizione 1000 = C UFC/g o mL

piastra 10-4 n° colonie contate x fattore di diluizione 10000 = D UFC/g o mL

4

mL o UFC/g D)CB(A mL o UFC/g


piastra 10-1 250 x 10 = 2500 UFC/g o mL



piastra 10-4 50 x 10000 =500000 UFC/g o mL

510x5,14

mL o UFC/g 500000)8000015000(2500 mL o UFC/g

18.3. I COLIFORMI

Determinazione dei Coliformi mediante tecnica MPN

Prova presuntiva per Coliformi totali


terreno di coltura BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB) soluzione DILUENTE (D) 1 sacchetto sterile 11 provette sterili con tappo 9 campanelle di Durham sterili 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente) 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare il terreno BVBB) 3 pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi) portaprovette, bunsen

Procedimento


Allestire 9 provette con 9 mL di Brodo Verde Brillante Bile (BVBB) ciascuna ed introdurre in ognuna1 campanella di Durham capovolta.


174

diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3


1 mL 1 mL

BVBB nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo nelle provette con campanella 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Campione nell’inoculo (mL) 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01 0,001 0,001 0,001



Considerare positive le provette in cui è presente gas nella campanella e/o intorbidamento nelbrodo di coltura.



Campione nell’inoculo (mL) 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 0,01 0,001 0,001 0,001

Provette con BVBB + + - + + - + + -

Prova di conferma per Coliformi totali

Materiale occorrente terreno di coltura BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB)


Procedimento

Allestire con 9 mL di Brodo Verde Brillante Bile (BVBB) un numero di provette pari ai tubi risultatipositivi nella prova presuntiva in BVBB ed introdurre in ciascuna 1 campanella di Durham capovolta.

Inoculare le provette di BVBB con 1 ansata prelevata dalle provette positive di BVBB della provapresuntiva come indicato nel seguente schema(Attenzione: sterilizzare l’ansa alla fiamma eraffreddarla ad ogni passaggio):




10 g o mL campione + 90 mL Diluente

175

PROVA PRESUNTIVA diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3

Provette positive di BVBB


Esempio di risultati + + - + + - + + -

PROVA DI CONFERMA diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3

BVBB nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo da trapiantare nelle provette con BVBB 1 ansata dalle rispettive provette di BVBB – prova presuntiva






Esempio di risultati + - - - + - + - -diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3




1100100 11 campionemL o g totali/100 Coliformi di MPN

Prova di conferma per Coliformi fecali e per Escherichia coli

Materiale occorrente terreno di coltura BRODO EC MUG(BECMUG)

tutte le provette positive della prova presuntiva dei Coliformi totali altrettante provette sterili con tappo altrettante campanelle di Durham sterili portaprovette bunsen lampada UV Reattivo di Kovacs 1 ansa di metallo

176

Procedimento

Allestire con 9 mL di Brodo EC MUG (BECMUG) un numero di provette pari ai tubi risultati positivinella prova presuntiva in BVBB ed introdurre in ciascuna 1 campanella di Durham capovolta.

Inoculare le provette di BECMUG con 1 ansata prelevata dalle provette positive di BVBB della provapresuntiva come indicato nel seguente schema (Attenzione: sterilizzare l’ansa alla fiamma e raffreddarla ad ogni passaggio):

PROVA PRESUNTIVA diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3

Provette positive di BVBB


Esempio di risultati + + - + + - + + -

PROVA DI CONFERMA diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3

BECMUG nelle provette con campanella 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

Inoculo da trapiantare nelle provette con BECMUG 1 ansata dalle rispettive provette di BVBB – prova presuntiva


Lettura dei risultati per i Coliformi fecali

Conteggio dei Coliformi fecali: considerare positive le provette in cui è presente gas nellacampanella.


ESEMPIO DI RISULTATI DELLA PROVA DI CONFERMA DEI COLIFORMI FECALI

Esempio di risultati + - - - + - - - -diluizione 10-1 diluizione 10-2 diluizione 10-3




700100 7 campionemL o g fecali/100 Coliformi di MPN

Lettura dei risultati per Escherichia coli

Conteggio di Escherichia coli: collocare le provette positive della prova di conferma dei Coliformifecali sotto alla lampada UV.

Considerare positive per Escherichia coli le provette che emettono fluorescenza bianco-azzurra.

Ulteriore prova di conferma: eseguire in tutte le provette fluorescenti il test di Produzione di indoloaddizionando 1-2 mL del Reattivo di Kovacs: la formazione di una colorazione rossa nello stratosuperficiale è indice positivo della formazione di indolo.


ESEMPIO DI RISULTATI DELLA PROVA DI CONFERMA DI ESCHERICHIA COLI

Esempio di risultati + - - - - - - - -

177



Ricavare dalla Tabella l’indice MPN e moltiplicarlo per 100.


400100 4 campionemL o g /100 coli aEscherichi di MPN

18.4. LO STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Metodo colturale in piastra mediante semina per spatolamento


soluzione DILUENTE (D) 1 sacchetto sterile 1 pipetta di vetro sterile da 10 mL (per prelevare la soluzione Diluente) 2 provette sterili con tappo 3 pipette di plastica sterili da 1 mL (per diluire il campione e prelevare gli inoculi) 3 piastre Petri sterili terreno di coltura AGAR BAIRD PARKER (ABP) con emulsione di potassio tellurito e tuorlo d’uovo di gallina (addizionato al terreno lo stesso giorno dell’uso) 3 anse di plastica piegate ad “L” (per spatolare le diluizioni del campione nelle 3 piastre) bunsen

Procedimento

Con tecnica sterile allestire 3 piastre Petri con il terreno ABP, siglare con il nome del gruppo e con lediluizioni con dovranno essere seminate, 10-2, 10-3, 10-4 e lasciare solidificare il terreno.

Nel frattempo in sacchetto sterile pesare 10 g o mL di campione, quindi addizionare 90 mL di Diluente(D).

Chiudere il sacchetto, quindi triturare fino ad ottenere un miscuglio il più omogeneo possibile.

Lasciare a riposto per 15-20 minuti per promuovere la rivivicazione dei microrganismi e lasciardepositare il solido.

Utilizzando 3 diverse pipette da 1 mL, una per ciascuna diluizione che si vuole seminare,procedere con le diluizioni del campione (1 mL) ed effettuare gli inoculi depositando sulla superficie delterreno 0,1 mL del campione e delle sue diluizioni come rappresentato nel seguente schema.

In ogni piastra distribuire l’inoculo immesso su tutta la superficie con 3 diverse anse di plastica piegatea “L”, continuando a spatolare fino a quando l’inoculo non è stato completamente assorbito nel terreno.



1 mL 1 mL

Piastre con ABP

Inoculo nelle piastre 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL


10 g o mL di campione + 90 mL Diluente

178

piastra 10-2 diluizione 10--3 diluizione 10-4 Campione nell’inoculo 0,01 g o mL 0,001 g o mL 0,0001 g o mL

Incubazione 37°C per 24 ore; le piastre negative vanno re-incubate per altre 24 ore


Contare in ogni piastra solo le colonie che presentano le caratteristiche colturali tipiche diStaphylococcus aureus:

Caratteristiche colturali

Staphylococcus aureus

Colonie nere (per riduzione del tellurito ad opera di Staphylococcus aureus), brillanti, convesse, con diametro di 1,0-1,5 mm, con margine biancastro continuo circondato da un alone chiaro largo 2-5 mm. Alcuni ceppi mostrano questi aloni chiari ben definiti soltanto dopo 36 ore di incubazione. Si possono produrre larghi aloni opachi che si estendono all’interno del terreno chiarificato ma soltanto dopo 48 ore o più.

Altre colonie

Stafilococchi coagulasi-negativi: crescono occasionalmente, ma raramente producono la chiarificazione. Staphylococcus epidermidis: cresce occasionalmente senza colorazione nera brillante; raramente presenta chiarificazione. Staphylococcus saprophyticus: può produrre la chiarificazione, ma le colonie sono più irregolari di quelle di Staphylococcus aureus; ampie zone opache si estendono dentro il terreno chiarificato dopo 24 ore. Micrococchi: crescono occasionalmente con colonie molto piccole, con sfumature variabili dal marrone al nero, senza chiarificazione. Lieviti: crescono occasionalmente con colonie di colore bianco senza chiarificazione. Bacillus: compaiono occasionalmente e rendono talvolta il terreno chiaro dopo 48 ore, ma presentano colonie di colore bruno scuro opaco. Escherichia coli: cresce occasionalmente con colonie grandi di colore bruno-nero. Proteus: cresce occasionalmente producendo colonie bruno-nere senza chiarificazione.

Calcolare il numero delle Unità Formanti Colonia (UFC) per g o mL di campione in ogni piastra analizzatacome segue, quindi calcolarne la media:

piastra 10-2 n° colonie contate x fattore di diluizione 100 = A UFC/mL

piastra 10-3 n° colonie contate x fattore di diluizione 1000 = B UFC/mL

piastra 10-4 n° colonie contate x fattore di diluizione 10000 = C UFC/mL

3

mL o UFC/g C)B(A mL o aureus/g ccusStaphyloco di UFC


piastra 10-2 8 x 100 = 800 UFC/mL

piastra 10-3 5 x 1000 = 5000 UFC/mL

piastra 10-4 2 x 10000 = 20000 UFC/mL

38,6x103

UFC/mL 20000)5000(800 mL o aureus/g ccusStaphyloco di UFC

179

18.5. LA SALMONELLA

Pre-arricchimento in acqua peptonata tamponata


terreno di coltura ACQUA PEPTONATA TAMPONATA (APT) 1 sacchetto sterile 1 becher da 400 o 600 mL

Procedimento

In sacchetto sterile pesare 10 g o mL di campione, quindi addizionare 90 mL di Acqua PeptonataTamponata (APT).

Chiudere il sacchetto, quindi triturare fino ad ottenere un miscuglio il più omogeneo possibile.

Lasciare a riposo per 15-20 minuti per promuovere la rivivicazione dei microrganismi e lasciardepositare il solido.

Siglare il sacchetto, introdurlo in un becher per mantenerlo verticale e incubare a 37°C per 16-24 ore.

Arricchimento selettivo in Brodo Rappaport Vassiliadis

Materiale occorrente sacchetto di pre-arricchimento in APT

terreno di coltura BRODO RAPPAPORT VASSILIADIS (BRV) 1 provetta sterile con tappo 1 pipetta di plastica sterile da 1 mL portaprovette bunsen

Procedimento

Allestire con tecnica sterile una provetta con 10 mL di Brodo Rappaport Vassiliadis (BRV).

Prelevare 1 mL del brodo di pre-arricchimento in APT e trapiantarlo nel BRV.

Lasciare a riposo per 15-20 minuti per promuovere la rivivicazione dei microrganismi e lasciardepositare il solido.

Siglare la provetta e incubare a 42°C per 24 ore.

Isolamento selettivo in Agar Hektoen Enterici

Materiale occorrente provetta di arricchimento selettivo in BRV

terreno di coltura AGAR HEKTOEN ENTERICI (AHE) 1 piastra Petri sterile 1 ansa di plastica o di metallo bunsen

Procedimento

Allestire con tecnica sterile una piastra Petri con Agar Hektoen Enterici (AHE) liquefatto e raffreddatoa 45°-50°C e lasciare solidificare.

Trasferire un’ansata della colonia cresciuta nel brodo di arricchimento selettivo BRV vicino al bordo dellapiastra con AHE solidificato e strisciare a linea continua su tutta la superficie del terreno.

Siglare la piastra e incubarla capovolta a 37°C per 24 ore.


180

Conteggio presuntivo di Salmonella spp.: contare le colonie tipiche di Salmonella in base alleseguenti caratteristiche colturali:

Specie microbiche Caratteristiche colturali

Salmonella spp Colonie verde-blu o blu con o senza centro nero; il terreno vira al blu

Shigella Colonie verde chiaro; il terreno non vira

Coliformi Colonie salmone; il terreno vira al salmone e si opacizza per la precipitazione dei sali biliari

Proteus spp saccarosio/salicina fermentanti Colonie salmone

Proteus spp saccarosio/salicina non fermentanti Colonie verde-blu con o senza centro nero

In base alla quantità di campione analizzato e alla sua diluizione (1:10), rapportare il n° delle coloniecontate a UFC/1 g o mL:

(10) diluizione di fattore

1

campione di (mL) volume o (g) massa

piastra in contate colonie delle n mL o /gSalmonella di UFC

Prova di conferma su Agar Ferro Triplo Zucchero

Materiale occorrente piastra di isolamento selettivo in AHE

terreno di coltura AGAR FERRO TRIPLO ZUCCHERO (AFTZ) 1 provetta sterile con tappo 1 ago di plastica portaprovette bunsen

Procedimento

ATTENZIONE Il conteggio di Salmonella è solo presuntivo e va confermato con una o con entrambe le seguenti prove di conferma. Perciò occorre conservare la piastra di isolamento selettivo.

181

Allestire con tecnica sterile una provetta con 10 mL di Agar Ferro Triplo Zucchero (AFTZ) liquefatto eraffreddato a 45°-50°C e lasciare solidificare su piano inclinato.

Prelevare con ago di plastica una colonia tipica di Salmonella cresciuta sulla piastra di isolamentoselettivo di AHE e trapiantarla prima per infissione e poi per strisciamento sulla superficie dell’agarinclinato di AFTZ.

Siglare la provetta e incubarla a 37°C per 18-48 ore.


La prova di conferma è positiva per la presenza di Salmonella spp. (perciò il conteggio delle colonieeffettuato al termine dell’isolamento selettivo è confermato) solo se sono presenti le seguenticaratteristiche colturali:


Salmonella spp

Reazione acida sul fondo del terreno, che appare di colore giallo per il viraggio del Rosso fenolo.

Reazione basica sul becco di clarino, che appare rosso per il viraggio del Rosso fenolo. Le Salmonelle fermentano solo il glucosio e non il lattosio e il saccarosio contenuti nel terreno di coltura.

Scarsa produzione di gas, che si rileva dalle spaccature nel terreno. La produzione di gas è scarsa sempre perché le Salmonelle fermentano solo uno dei tre zuccheri presenti.

Annerimento più o meno esteso del terreno, dovuto alla formazione di solfuro ferroso formatosi grazie alla riduzione del tiosolfato presente nel terreno ad acido solfidrico da parte delle Salmonelle.

Prova di conferma su Agar Mobilità Indolo urea

Materiale occorrente piastra di isolamento selettivo in AHE

terreno di coltura AGAR MOBILITÀ INDOLO UREA (AMIU) 1 provetta sterile con tappo 1 ago di plastica portaprovette bunsen Reattivo di Kovacs

Procedimento

Allestire con tecnica sterile una provetta con 10 mL di Agar Mobilità Indolo Urea (AMIU) liquefatto eraffreddato a 45°-50°C e lasciare solidificare su piano inclinato.

Prelevare con ago di plastica una colonia tipica di Salmonella cresciuta sulla piastra di isolamentoselettivo di AHE e trapiantarla prima per infissione e poi per strisciamento sulla superficie dell’agarinclinato di AMIU.

Siglare la provetta e incubarla a 37°C per 18-48 ore.


La prova di conferma è positiva per la presenza di Salmonella spp. (perciò il conteggio delle colonieeffettuato al termine dell’isolamento selettivo è confermato) solo se sono presenti le seguenticaratteristiche colturali:


Salmonella spp

Crescita diffusa che si dirama dalla linea di infissione. Le Salmonelle sono microrganismi mobili.

Nessun cambiamento di colore del terreno. Le Salmonelle non sono in grado di idrolizzare l’urea in prodotti basici, pertanto l’indicatore rosso fenolo contenuto nel terreno non vira.

Dopo aver aggiunto 3-4 gocce del Reattivo di Kovacs sulla superficie dell’agar inclinato non si osserva cambiamento di colore. Le Salmonelle non producono indolo dal triptofano.

182

Alunni

Classe


L’ANALISI MICROBIOLOGICA DEGLI ALIMENTI



Campione in esame


Quantità prelevata (g o mL)

Piastre N° di colonie

contate Fattore di diluizione

UFC/mL

10-1 10

10-2 100

10-3 1000

10-4 10000

Media

DETERMINAZIONE DEI COLIFORMI TOTALI


Campione in esame

Terreno di coltura (prova presuntiva) BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB)

Terreno di coltura (prova di conferma) BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB)

Diluizioni seminate

Campione nell’inoculo (g o mL)

Combinazioni positive dopo prova di conferma

UFC Coliformi totali/100 g o mL

DETERMINAZIONE DEI COLIFORMI FECALI E DI ESCHERICHIA COLI


Campione in esame

Terreno di coltura (prova presuntiva) BRODO VERDE BRILLANTE BILE (BVBB)

Terreno di coltura (prova di conferma) BRODO EC MUG (BECMUG)

Diluizioni seminate

Campione nell’inoculo (g o mL)

Coliformi fecali


UFC Coliformi fecali/100 g o mL

Escherichia coli


UFC Escherichia coli/100 g o mL

183

Alunni

Classe


L’ANALISI MICROBIOLOGICA DEGLI ALIMENTI

DETERMINAZIONE DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Metodo colturale in piastra mediante semina per spatolamento

Campione in esame

Terreno di coltura AGAR BAIRD PARKER (ABP)

Quantità prelevata (g o mL)

Piastre N° di colonie

contate Fattore di diluizione

UFC/mL

10-2 100

10-3 1000

10-4 10000

Media

DETERMINAZIONE DI SALMONELLA

Metodo colturale in piastra mediante semina per strisciamento

Campione in esame

Quantità in esame (g o mL)

Terreno di coltura (pre-arricchimento) ACQUA PEPTONATA TAMPONATA (APT)

Terreno di coltura (arricchimento selettivo) BRODO RAPPAPORT VASSILIADIS (BRV)

Terreno di coltura (isolamento selettivo) AGAR HEKTOEN ENTERICI (AHE)

Terreno di coltura (1ª prova di conferma) AGAR FERRO TRIPLO ZUCCHERO (AFTZ)

Terreno di coltura (2ª prova di conferma) AGAR MOBILITÀ INDOLO UREA (AMIU)

Numero di colonie contate (dopo prove di conferma)

UFC Salmonella/g o mL

13. GLI INDICATORI DI CONTAMINAZIONE · batteri di diverso genere e specie, aventi però le...

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