Trasporti attraverso la membranaProteine di trasporto

Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico è impermeabile alle proteine e alla

maggior parte delle piccole molecole

Gas

EtanoloPiccole molecole polari non cariche

AcquaUrea

Grosse molecole polari non cariche

Glucosio

Ioni

Molecole polari cariche

AminoacidiATPGlc-6-P

Proteine di trasporto

2 principali classi di proteine di trasporto:

Proteine Carrier Proteine Canale

bilayer

lipidico

soluto

sito di legame del soluto

ione

poro acquoso

Diffusione Facilitata

Caratteristiche dei trasporti mediati

• I carriers sono dotati di specificità

• Sono soggetti a saturazione

• Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi

• Hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH

I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi

• I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi

• Legano selettivamente il loro substrato, cioè la molecola che deve essere trasportata

• Cambiano di conformazione per rilasciare il substrato dall’altro lato

• Ritornano alla conformazione originale per legare un’altra molecola di substrato

• Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

0 50 100 150 2000

5

10

15

20

Flu

sso

netto

[mol

i/(cm

2 s]

C (mM)

104

Ck

FF

a

1

max

Fmax

0 10 20 300

100

200

300

F

C

F=kdC

Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione

In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione

Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers

I flussi mediati da carriers -a differenza della diffusione libera - sono saturanti

Ciò accade per due motivi:1. Sulla membrana è presente un numero finito di carriers;2. Ciascun carrier opera ad una velocità finita

0 800 1000

0

10

20

30

40

50

Flu

sso

(Par

ticel

le/C

arrie

r/s)

N. particelle

N. partic. Flusso1 110 1050 50

100 501000 50

Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico

Velocità del carrier: 50 p/s

Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier

Quesito su cui meditare

Distruggendo la metà dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?

?

C1

1. Si introduce nella provetta substrato S radioattivo ad una concentrazione C1

2. A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, …) si preleva un campione dalla provetta e si misura la concentrazione di S radioattivo all’interno delle cellule del campione

0 10 20 30 40 500

1

2

3

4

5

[S] in

Tempo

1][

vt

S in

pendenza

della retta

3. Normalizzando la velocità v1 rispetto all’area della membrana si ottiene il primo valore del flusso F1 riferito alla concentrazione C1

Flu

sso

netto

[mol

i/(cm

2 s]

C (mM)0 20 40 60 80 100

0

5

10

15

20

C1

F1

Cellule in sospensione

Come è stato ottenuto il grafico che illustra come varia il flusso al variare della concentrazione?

C2 C3 C4

Successivamente si introduce in ciascuna provetta substrato S radioattivo alle altre concentrazioni C2, C3, C4 …. crescenti e si ripete la stessa procedura descritta precedentemente

Flu

sso

netto

[mol

i/(cm

2 s]

C (mM)0 20 40 60 80 100

0

5

10

15

20

C1

F1

0 10 20 30 40 50

0

10

20

30

40

[S] in

Tempo

C2

F2

C3

F3

V4F4

V3F3

V2F2

C4

F4

0 50 100 150 2000

5

10

15

20

Flu

sso

netto

[mol

i/(cm

2 s]

C (mM)

104

Fmax

+Ic

+Ic

I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva

Quindi, in presenza di inibitore competitivo il valore di Fmax non cambia.

0 50 100 150 2000

5

10

15

20

Flu

sso

netto

[mol

i/(cm

2 s]

C (mM)

0 10 20 300

5

10

15

20

Flu

sso

netto

[mol

i/(cm

2 s]

C (mM)

maxF

2

maxF

ka1 ka2

ka3

In presenza di Ic varia ka

Calcolo della costante di affinità ka

ka è quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è la metà di quello massimo

ka è inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il substrato

.00110.01

Prob[Ic][S]

.01010.1

.091101

.51010

.90910100

.990101000

.9991010000

Come funziona un inibitore competitivo?

0 2000 4000 6000 8000 10000

0

5

10

15

20

Flu

sso

[S]

S S+Ic

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

0

5

10

15

20

Flu

sso

[S]

S S+Ic

substratoInibitore comp.

solo S S << Ic S >> Ic

Se si vuole costruire un grafico che rappresenti un range di

concentrazioni molto ampio (alcuni ordini di grandezza)

conviene usare una scala logaritmica

Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata all’interno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella.

1. Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che l’area di membrana su cui sono state fatte le misure è 3·10-2 cm2;

2. Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica;

3. Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.

Quesito del giorno

Conc. mM v (mmol/s)

1 10.05 16.7

10 18.220 19.030 19.450 19.6

100 19.8200 19.9

0.1 3.0

Risposta al quesito

0 50 100 150 2000

100

200

300

400

500

600

700

mm

oli/s

/cm

2

Concentr.

0.01 0.1 1 10 1000

100

200

300

400

500

600

700

mm

oli/s

/cm

2

Concentr.

Esempio di Diffusione facilitataIl Trasportatore del Glucosio

Glucosio Permeasi

extracell.

intracell.

poro: formato da 5 a-eliche transmembrana anfipatiche

Diffusione Facilitatasoluto

statoA

statoB

esterno

interno

sito di legamedel soluto

proteinacarrier

gradiente diconcentrazione

bilayerlipidico

es. Trasportatore del glucosio negli epatociti

La driving force per il tranporto in qualsivoglia direzione è determinata dal gradiente di concentrazione attraverso la membrana

Attivita' di RicercaResponsabili Prof. M. Toselli e Dr. Gerardo Biella

 Il LABORATORIO DI FISIOLOGIA E BIOFISICA DEI CANALI IONICI del Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia Cellulari e Molecolari dell'Universita' di Pavia, diretto dal Prof. Mauro Toselli svolge attivita’ di ricerca sui seguenti argomenti:       Canali ionici voltaggio-dipendenti: proprieta' biofisiche e loro correlazione ad aspetti funzionali dell'eccitabilita' elettrica nei neuroni durante lo sviluppo.       Modulazione dei canali del calcio e Regolazione del traffico intracellulare: meccanismi molecolari e biofisici dei processi di regolazione dell'attivita' dei canali del calcio voltaggio-dipendenti da parte di protein chinasi e proteine G, e conseguenze nel controllo della trasmissione, ricezione e immagazinaggio dell'informazione nei neuroni.  Neurofisiologia cellulare: Identificazione e caratterizzazione funzionale dei circuiti sinaptici delle cortecce paraippocampali. In particolare: ruolo che l'attività ritmica sincronizzata dei neuroni del sistema limbico esercita sui processi di apprendimento e memorizzazione.       Cellule staminali neuronali: caratterizzazione elettrofisiologica di cellule staminali neuronali in coltura. Le tecniche correntemente impiegate comprendono misurazioni elettrofisiologiche di patch-clamp sui seguenti preparati: a) linee cellulari stabili di origine neuronale, wild-type o opportunamente ingenierizzate per l'espressione di specifiche proteine ricombinanti normali o mutagenizzate; b) colture primarie di neuroni; c) sezioni sottili di tessuto; d) cellule staminali in coltura.

 Numero di posti disponibili: tre posti disponibili dall’inizio del secondo semestre a dicembre 2005; Requisiti per l'accettazione: verra’ data la priorita’ agli studenti che abbiano superato gli esami di Fisica e Chimica Generale.

Alcune considerazioni di bioenergetica

L’energia è la capacità di compiere un lavoro

Un sistema all’equilibrio non può compiere un lavoro. Esso è al minimo della collina energetica

En

erg

ia d

el S

iste

ma

Equilibrio

La parte di Energia che il sistema può utilizzare per compiere un lavoro è definita energia libera del sistema

Una reazione può essere forzata a procedere in senso non spontaneo.

In questo caso la reazione assorbe energia: cioè occorre compiere un lavoro sul sistema

Una reazione di questo tipo è detta endoergonica

Le reazioni non all’equilibrio spontaneamente procederanno nella direzione che porta all’equilibrio

Tali reazioni sono dette esoergoniche

Le reazioni chimiche accoppiate

Un processo endoergonico può avvenire se esso viene opportunamente accoppiato ad un processo esoergonico

Consideriamo la seguente reazione endoergonica:

A + B A-B G>0Affinchè essa possa avvenire deve attingere energia da una reazione esoergonica:

X-P X + P + Energia G<0

La sequenza di reazioni accoppiate sarà la seguente:

A + X-P A-P + X A-P + B A-B + P

I contenitori di energia nelle cellule

Legami ad alta energia: ATP

GTP

Gradienti transmembranari:Gradienti ionici a cavallo del plasmalemma

Contenitori intracellulari di Ca2+

bilayerlipidico

diffusionesemplice

mediatada canale

mediata da carrier

trasportopassivo

trasportoattivo

proteinacarrier

gradiente diconcentraz.

molecola trasportata

Trasporti passivi e attivi a confronto

Trasporti passivi e attivi a confronto• Il gradiente di concentrazione attraverso la

membrana determina la direzione e la velocità della diffusione passiva.

• Nella diffusione passiva le molecole si muovono dalla zona ad alta concentrazione a quella a bassa concentrazione (trasporto “in discesa”)

• Diffusione semplice: le molecole diffondono attraverso il bilayer lipidico

• Diffusione facilitata: diffusione attraverso la membrana mediata da proteine di trasporto (non è richiesta energia)

• Muovere un soluto “in salita” (contro il gradiente di concentrazione) richiede un ingresso di energia - Trasporto Attivo

Trasporti AttiviIl trasporto di un soluto contro un gradiente elettrochimico richiede l’utilizzo di energia

Due strategie sono adottate dalle cellule animali:

Pompe ATP-dipendenti Trasporti accoppiati

Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di un’altra

Trasporto in salita accoppiato direttamente all’idrolisi dell’ATP

Gradiente elettrochimico

Na+/K+ ATPasi

Na+/K+ ATPasi

gradiente di Na+

gradiente di K+

cytosol

sito di legame del Na+

sito di legame per K+ e ouabaina

Na+/K+ ATPasi

• La pompa idrolizza l’ATP ad ADP per trasportare simultaneamente 3 Na+ dalla cellula e 2 K+ dentro la cellula ad ogni ciclo della pompa

• La Na+-K+ ATPasi è responsabile di >30% del consumo totale di ATP

• Mantiene un gradiente del Na+ (ext>int) e del K+ (int>ext)

• Contribuisce a creare un potenziale di membrana negativo all’interno

• È bloccata dalla ouabaina

Ione Intracellulare Extracellulare

Na+ 5-15 mM 145 mMK+ 140 mM 5 mM

Ciclo della pompa Na+/K+ ATPasi

ext

intil Na si legaal sito citosolico

fosforilazioneATP-dipendente

la proteina subisce un cambiamento conformazionale, il Na è rilasciato all’esterno

il K si legaal sito extracellulare

defosforilazione

la proteina ritorna alla conformazione originale,il K è rilasciato all’interno

1 ciclo 10 millisecondi

Alcune importanti caratteristiche della pompa

Stechiometria - 3 Na+ fuori, 2 K+ dentro, 1 ATP usato

Velocità di attività dipendente dalla concentrazione intracellulare di Na+

Bloccata dal glicoside cardiaco ouabaina e bassa [ATP]i

Elettrogenica, può generare direttamente da -2 a -20 mV

Tiene la pressione osmotica sotto controllo, prevenendo il rigonfiamento cellulare

Gradiente elettrochimico • A cavallo della membrana della maggior parte delle

cellule c’è una differenza di potenziale elettrico – il potenziale di membrana

• Il potenziale di membrana influenza il movimento transmembrana di tutte le molecole cariche (ioni)

• Il lato citoplasmatico della membrana plasmatica di solito ha un potenziale più negativo rispetto all’esterno

• La forza elettrostatica spinge i cationi nella cellula e guida gli anioni fuori

• Quindi, quando consideriamo la diffusione passiva di soluti carichi attraverso una membrana, due forze devono essere considerate:

• (a) il gradiente di concentrazione transmembrana

• (b) la differenza di potenziale transmembrana

• La driving force netta = Gradiente Elettrochimico

Gradiente Elettrochimico

potenziale dimembrana=0

fuori

dentro

potenziale di membrananegativo dentro

trasporto dei cationi aumentato

potenziale di membranapositivo dentro

trasporto dei cationiridotto

In base a quanto detto a lezione, stabilire se la pompa Na+/K+, che è elettrogenica dal momento che trasporta un numero netto di cariche elettriche, aumenterà o diminuirà la sua velocità d’azione qualora la membrana venga depolarizzata.

Ricordarsi che una depolarizzazione comporta un aumento delle cariche positive all’interno della cellula rispetto alla situazione di riposo (potenziale di riposo).

Quesito del giorno

molecola trasportata ione co-transportato

ione contro-transportato

Uniporto Simporto AntiportoTrasporti accoppiati

Alcune definizioni

Altri esempi di trasporti attivi primari

Trasporti accoppiati

Il gradiente di un soluto (es. gradiente del Na+) viene usato per guidare in salita il trasporto di una seconda molecola - trasporto attivo secondario

Gradiente elettrochimico

Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di un’altra

Trasporti accoppiati al gradiente di NaNelle cellule animali molti processi di trasporto di membrana sono accoppiati al gradiente del Na.

Es. Trasporto del glucosio in cellule dell’epitelio intestinale

Na+ glucosiostato

Astato

B

gradientedi Na

gradiente di glucosio

int

ext

carrier

Stechiometria: 2 Na+ 1 GlcBloccante: florizina

Altri esempi di trasporti attivi secondari

Trasporto del glucosio dal lume intestinale al sangue

SangueCellule dell’epitelio intestinale

Glucosio nel sangue

Glucosio assunto

Lume intest.

GLU permeasi

Co-trasportatore Na/GLUCanale del K+

Una cellula si trova immersa in una soluzione extracellulare contenente glucosio 10 mM. Trascorso un certo tempo la concentrazione di glucosio nel citoplasma sale a 50 mM.

Secondo voi, perche’ cio’ prova che la membrana plasmatica di quella cellula dispone di un trasportatore attivo del glucosio?

Come fareste a dimostrare sperimentalmente che tale trasportatore e’ Na+-dipendente (trasporto attivo secondario)?

Quesito del giorno

Mantenimento dei livelli di Ca2+ intracellulare

• Il Ca2+ è coinvolto in molti processi cellulari

• Il mantenimento di bassi livelli di Ca2+ intracellulare è critico for il normale funczionamento cellulare

• La [Ca2+] extracellulare >>>> della [Ca2+] intracellulare

• Le pompe del Ca2+ ATP-dipendenti della membrana plasmatica e del reticolo endoplasmatico pompano attivamente Ca2+ fuori dal citoplasma

• Esiste anche uno scambiatore Na/Ca (T.A.II) che pompa attivamente Ca2+ fuori dalla cellula

Quali meccanismi mantengono l’ampio gradiente di calcio?

ESTERNO

INTERNO

ADP

Ca++

ATP

Pompa del Calcio

Ca++

3Na+

Scambiatore Sodio:Calcio

Ca2+

Ca2++

Ca2+

I gradienti di calcio esistono sia all’interno della cellula che a cavallo della membrana plasmatica

Contrazione

Secrezione

Esocitosi

Espressionedi geni

Secondomessaggero

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Na+

Concentrazioni ioniche intracellulari ed extracellulari

Ione Intracellulare Extracellulare

Na+ 5-15 mM 145 mMK+ 140 mM 5 mMMg2+ 0.5 mM 1-2 mMCa2+ 10-7 mM 1-2 mMH+ 10-7.2 M (pH 7.2) 10-7.4 M (pH 7.4)

Cl- 5-15 mM 110 mMAnioni fissi high 0 mM

La [intracellulare] è molto diversa dalla [extracellulare]I cationi sono bilanciati dagli anioni

C:\Documents and Settings\Administrator\Documenti\Didattica\Univ British Columbia Biology 350

Bioenergetics.doc