TERAPIA GENICA

Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un difetto genetico ereditato o acquisito o per introdurre nuove funzioni o proprietà.

TERAPIA GENICA

Speculazioni sulla possibilità di effettuare una terapia genica sono degli anni ’60

Primo trial clinico approvato in USA nel 1989. Primo trial clinico in Italia per la correzione del deficit di adenosina deaminasi (14 settembre 1992)

al 2001: 596 clinical trials di terapia genica (3464 pazienti)

al 2007: circa 650 clinical trials di terapia genica (problemi inefficacia, tossicità)

1) Understanding of the disease process

2) Structure/function of gene to be introduced

3) Animal model and assessment of function

4) Efficient delivery of gene

5) Control of gene expression

6) Prevention/control of immune responses

7) Clinical trial

What is required for Gene Therapy to be possible?

What is required for Gene Therapy to be possible?

TERAPIA GENICA-applicazioniMalattie ereditarie (es. distrofia muscolare, fibrosi cistica) per far esprimere la proteina mancanteMalattie neoplastiche in cui i geni introdotti possono contribuire a distruggere le cellule neoplasticheAlterazioni del sistema immunitario per modificare la risposta immuneMalattie infettive per potenziare i meccanismi di difesa

Gene Transfer: getting genes into

cells

Gene Transfer: getting genes into

cellsTwo main routes:

In vivo: i.v. or i.m. injectable; or non-invasive (eg “sniffable”)

Ex vivo: hepatocytes, skin fibroblastshaematopoietic cells

Gene delivery approaches

Gene delivery approaches

• Physical methods

• Non-viral vectors

• Viral vectors

Physical methodsPhysical methods

Injection of naked DNA

Electroporation in vivo or ex vivo

Ballistic technology – the “gene gun”

Effect of Electric Field on Cell Membrane

cells obtained from

skin biopsy

gene introduced

into cells byelectroporation

genetically engineered

cells are propagated

cells are reinjected

Ex vivo electroporation

Gene Gun

Metodi fisici

• Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene

• Scarsamente efficiente se non per certi tipi cellulari

• Reazioni immunitarie per DNA batterico

• Solo per tessuti superficiali

Vantaggi Svantaggi

Strategie per migliorare l’efficienza:

associazione del DNA a polimeri cationici (pol. lineari, es. poli-lisine; pol.ramificati, es. polietilenimine o PEI; pol. sferoidali, es. poliamidoamine)

Metodi fisici

Vettori non virali -Liposomi

–Vescicole sferiche costituite da un doppio strato fosfolipidico

idrofilico

idrofobico

liposome

nucleus

DNA

endocytosis

complex

membrane fusion

Liposome-mediated Gene Transfer

Liposomi

• Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene

• Facili da produrre• Scarsa tossicità (?)

• Efficienza modesta

• Espressione a breve termine

Vantaggi Svantaggi

TERAPIA GENICA

Caratteristiche ideali di un vettore per terapia genica:

produzione ad elevate concentrazioni con metodo facile e riproducibile; transgene regolato dai suoi elementi di regolazione;

abilità di raggiungere specifici tipi cellulari;mancata stimolazione di risposta immunitaria da parte dell’ospite

TERAPIA GENICA

Integrazione del transgeneVantaggi:perpetuo; può consentire un’espressione stabile ed una cura.Svantaggi:un’inserzione random può rendere silente il transgene o disregolare geni dell’ospiteeffetti a lungo termine (?)

TERAPIA GENICA

Transgene episomaleVantaggi:assenza di mutagenesi inserzionale o effetti a lungo termine.Svantaggi (?):espressione transiente;necessità di trattamenti ripetuti

Vettori viraliQuelli utilizzati per terapia genica sono modificati affinchè possano infettare cellule di mammifero, ma non siano in grado di replicarsi.Retrovirus

AdenovirusLentivirusAdeno-associated virusHerpes simplex virus

Therapeutic gene

Vector DNA

Helper DNA

Engineering a Virus into a VectorEngineering a Virus into a Vector

wildtype virus

Viral vectorBased on Kay et al 2001

replicationproteins

replicationproteins

structuralproteins

Packaging

essential viral genes

Packaging cell

RETROVIRUS

RNA virus di circa 10 kb con conversione di RNA a DNA mediante una trascrittasi inversa

Vettori principalmente utilizzati sono derivati dal virus Moloney della leucemia murina.transgene si integra stabilmente in cellule in mitosiinattivato dal complemento

Potenziale tossicità:

generazione di virus replicazione-competenti (per ricombinazione in fase di produzione o nell’ospite)

mutagenesi inserzionale (tumori?)

RETROVIRUS

Vettori retrovirali descritti per la prima volta nel ’96Basati sul virus HIV-1

LENTIVIRUS

Possono transdurre anche cellule non in divisionePotenziale tossicità:Simile a retrovirus con l’aggravante che si tratta di un patogeno per l’uomo (studio di lentivirus felini o equini)

DNA virus di circa 36 kb causano infezioni benigne del tratto respiratorio;

ADENOVIRUS

infettano cellule in divisione e non;facili da produrre in grande quantità;ospitano geni di grandi dimensioni;entrano nelle cellule mediante endocitosi;trasgene episomale;

Effetti sfavorevoli:

Espressione a breve termine Reazioni infiammatorieRisposta immune dell’ospite:

cellulare (prod. di linfociti T contro le cellule infettate)umorale (prod. di anticorpi che preclude altri trattamenti)

Tossicità acuta

ADENOVIRUS

Infettano cellule in divisione e nonPuò ospitare transgeni non superiori a 4.5 kbIntegrazione del transgeneInserzione sito-specifica nel cromosoma 19 (?)

ADENO-ASSOCIATED VIRUS

DNA virus non patogeni che richiedono adenovirus o herpesvirus per replicare

FIBROSI CISTICACFTR

Malattia a carattere autosomico recessivo causata da mutazioni della proteina transmembrana CFTR coinvolta nel trasporto degli ioni Cloro nelle cellule epiteliali di vari organi.

Alterazione di CFTR causa accumulo di muco denso e viscoso nei polmoni e alterazioni funzionali in fegato, pancreas, organi riproduttoriTerapia sintomatica.

CFTR -terapia genicaNecessità di intervenire in vivo

Risultati sperimentali:

Topo KO (patologia polmonare modesta)instillazione tracheale di liposoma-CFTR: promettente

Tossicità vettori virali testata su diverse specie animali risultato variabile

Studi clinici (instillazioni tracheali o spray nasale):Liposoma -CFTR: bassa efficienza di trasfezione e di breve durataAdenovirus-CFTR: prima generazione problemi infiammatori e reazioni anticorpali; scarsa efficacia; seconda generazione meglio tollerati, scarsa e breve espressioneAAV-CFTR: ben tollerato, ma espressione brevePEG-poliK-DNA: nessuna tossicità, effetto per 6 giorniPotenziali sviluppi futuri: cellule staminali eterologhe o modificate geneticamente

CFTR -terapia genica

ADA deficiency

Malattia a carattere autosomico recessivo causata da deficit o alterata funzionalità dell’enzima Adenosina deaminasi, coinvolto nel metabolismo delle purine.Conseguenze: accumulo di dATP, dADP, dAMP; blocco produzione linfociti T, NK, B; difetti scheletrici, disturbi comportamentali, alterazioni rene-fegato. Patologia letale per grave immunodeficienza.

ADA deficiency

Possibilità terapeutiche:

Trapianto di midollo

Terapia sostitutiva: PEG-ADA bovino i.m. 1-2/sett.;

problemi compliance, non-responders (15-20%)

Terapia genica ex-vivo

Terapia genica - ADA deficiency

In linfociti T periferici:

risultati soddisfacenti ottenuti con sospensione di PEG-ADA

vantaggi: fattibilità e sicurezza; linfociti T ingegnerizzati vivono a lungo; limiti: ripristino funzionalità confinata ai linfociti T; necessità di infusioni ripetute.

Terapia genica - ADA deficiencyIn cellule staminali del midollo osseo: Protocollo-Studio effettuato in due bambini di 6 mesi e 30 mesi Sospensione PEG-ADA. Cellule prelevate dal midollo osseo e infettate con vettore retroviraleModerata mieloablazione con Busulfan (2mg/kg/die per 2 gg) due e tre giorni prima del reimpianto

Risultati a 360 giorni:Ripristino linfociti B, T, NK e crollo livelli metaboliti purinici nel paziente più giovane. Buoni risultati solo a carico di linfociti T e NK nel secondo paziente.

SCID-X1(severe combined immunodeficiency disease)

Malattia ereditaria legata al cromosoma X

Grave immunodeficienza caratterizzata dalla mancata maturazione dei linfociti T e NK

Terapia genica ex-vivo con vettori retrovirali in cellule staminali ematopoietiche. Dopo tre anni, sviluppo di leucemia dei linfociti T in due bambini (mutagenesi inserzionale al locus LMO-2, cromosoma 11)Ad oggi 4 casi documentati

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

Struttura modificata per aumentare laresistenza alle nucleasi:

oligonucleotidi fosforotioati(stabilità in vitro, buona emivita)

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

Problematiche:SpecificitàLegame a fattori di crescita e loro recettori (es. PDGF, VEGF, EGFR)Tossicità pre-clinica : nei roditori immunostimolazione e degenerazione tubulare renale e epatica (alte dosi);nelle scimmie inibizione cascata della coagulazione, attivazione cascata del complemento

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO:applicazioni

Vitravene (Fomivirsen) - Novartis - Primo oligonucleotide antisenso approvato in terapia (FDA,1998). Distributo in USA, Europa, BrasileIndicazioni terapeutiche: trattamento locale di retinite da CMV in soggetti con AIDSBersaglio: sequenza di mRNA della regione IE2 del CMV essenziale per infettività Tossicità: infiammmazione, aumento di pressione intraoculare, danni alla retina

APTAMERI

PEGAPTANIB - Macugen® (Eyetech Pharm./Pfizer)

RNA aptamero diretto contro il vascular endotelial growth factor (VEGF)-165, isoforma responsabile di neovascolarizzazione oculare patologica e permeabilità vascolare;Indicazione terapeutica: degenerazione maculare associata all’età

PEGAPTANIB struttura e sede di

legame

Purine 2’-O-metilate

Pirimidine 2’-fluorurateHeparin-binding domain VEGF

APTAMERI

• Selettività

• Scarsa tossicità (?)

• Disponibiltà di “antidoti”

• Alternativa all’uso di

anticorpi (?)

Potenziali applicazioni: infezioni, cancro, patologie cardiovascolari