“Alla ricerca del ciclo perduto”: la citofluorometria nell’analisi del

ciclo cellulare

Obiettivo dell'esperienza

Saccharomyces cerevisiaeCiclo Vitale Ciclo di Divisione Cellulare

Identificare:*la ploidia della popolazione*la fase del ciclo cellulare in cui si trovano le cellule di una coltura di lievito

Protocollo

●Ogni partecipante sceglie un campione da analizzare, contenente una coltura di lievito (una provetta a testa)

1) Trasferire 1 ml di coltura in una provetta eppendorf (GUANTI!)

2) Centrifugare la provetta 2 minuti, eliminare il surnatante

3) Aggiungere 1 ml di etanolo 70% e mettere in ghiaccio per fissare

...15 minuti...

FACSFluorescence Activated Cell Sorter

A cosa serve? Analisi di parametri biologici nelle singole cellule di popolazioni cellulari

Contenuto di DNA (→ Studio della Ploidia e del Ciclo Cellulare) Presenza di antigeni superficiali (→ Esame emocromocitometrico, )

Controllo di qualità nelle produzioni alimentari (→ Individuazione di microorganismi indesiderati durante le fermentazioni, Conta delle cellule somatiche nel latte)

Per cosa lo useremo?Quantificare il contenuto di DNA nelle singole cellule per identificare la ploidia e la fase delciclo cellulare in cui si trovano

VantaggiMisurazione contemporanea di diversi parametri (Analisi Multiparametrica)

FACSCome funziona?

UV Det.Fluoroforo

Parametri Misurati:*Fluorescenza*Forward Scattering*Side Scattering

FACS

Scanner Ago Monitor Dati

FACS Flow

Fissaggio

Preparazione dei campioni

RNAsi

Uccidere le cellule e bloccare la progressione del ciclo cellulare

Degradare completamente l'RNA che interferisce con

le lettureProteinasi K

Degradare completamente le proteine interferiscono

con la colorazione del DNA

Protocollo

1) Centrifugare I campioni fissati 3 minuti, eliminare il surnatante

2) Aggiungere al pellet 500 μl di RNasi

3) Vortexare per risospendere perfettamente il pellet

4) Incubare 60 minuti a 37°C per digerire completamente l'RNA

...60 minuti...

Il contenuto del DNA nelle diverse fasi del ciclo cellulare

G1

S

G2

M

1C

1<C<2

2C

Ciclo cellulare aploide

G1

S

G2

M

2C

2<C<4

4C

Ciclo cellulare diploide

Analisi dei risultati

Intensità della fluorescenza=

Contenuto di DNA

Numero di Cellule

1C 2C 3C 4C1C = contenuto di DNA di un genoma aploide

Il profilo FACS nel ciclo cellulare

1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C

1C 2C 3C 4C

G1 S G2

In una coltura sincronizzata diploide

In una coltura asincrona invece...

Il profilo FACS in un ciclo cellulare

1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C 1C 2C 3C 4C

In una coltura sincronizzata diploide

In una coltura asincrona invece...

G1 S G2

1C 2C 3C 4C

Un esempio di coltura sincrona

1C 2C

Tempo

Un metodo alternativo

G1

S

G2

M

1C

1<C<2

2C

Osservazione morfologica

Protocollo

1) Centrifugare i campioni trattati con RNasi per 3 min

2) Eliminare il surnatantem e aggiungere al pellet 500 μl di Proteinasi K

3) Vortexare per risospendere perfettamente il pellet

4) Incubare 60 minuti a 50°C per digerire le proteine

...60 minuti...

Forward ScatteringIl forward scattering cresce con l'aumentare delle dimensioni della cellula analizzata

G1 G2

For

war

d S

catt

erin

g

Side ScatteringIl side scattering cresce con l'aumentare della complessità della cellula analizzata

G1 G2

Sid

e S

catte

ring

Forward vs Side Scattering

For

war

d S

catt

erin

g

Side Scattering

Protocollo – Giorno 2

1) Aggiungere 100 μl di cellule al colorante del DNA

2) Agitare brevemente

Gruppo 1: 1,2,3,4,5,6,7Gruppo 2: 8,9,10,11,12,13,14Gruppo 3: 15,16,17,18,19,20,21

3) Sonicare

4) Leggere al citofluorimetro

Acquisizione dei dati

Istogrammi FL1/2

Dot Plot FL1/2 vs FSc

Istogrammi FL2/3

Dot Plot SSc vs FSc