Terapia genica

-malattie infettive-tumori-malattie ereditarie-malattie del sistema immunitario

Terapia genica classica:A)Produrre la sostanza che manca al pazienteB)Eliminare direttamente le cellule malateC)Attivare le cellule del sistema immunitario favorendo così l’uccisione dellecellule malate

Terapia genica non convenzionale: inibire l’espressione dei geni coinvoltinella patogenesi, o di correggere un difetto genetico e quindi restaurarela normale espressione genica.

Non e` utilizzabile nellaSperimentazione Clinica

TERAPIA GENICATecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente

Scopo:• Correggere un difetto genetico• Fornire una nuova funzione alla cellula

Applicabilità:1. Malattie genetiche classiche(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)2. Malattie multigeniche (cancro)3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)4. Malattie non genetiche80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

Terapia genica in vivo ed ex vivo

Trapianto di cellule geneticamente modificate:• Estrazione/preparazione delle cellule primarie o di linea• Trasferimento del gene in vitro• Reimpianto delle cellule

Problemi:• Cellule autologhe ingegnerizzate: laboriosa, vita limitata• Cellule eterologhe ingegnerizzate: reperibilità, compatibilità

Terapia genica EX VIVO

Somministrazione diretta del gene terapeuticoin vivo alle cellule:• iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico)• somministrazione in prossimità del tessuto (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica)Problemi:• Trasferimento quantitativamente limitato• Rischio di inserimento in cellule sane• Reazione immunitaria

TERAPIA GENICA IN VIVO

Geni integrati nei cromosomi (retrovirus)Geni non integrati (necessità di trattamenti ripetuti) (adenovirus)

VETTORI VIRALI

Vantaggi dei vettori non virali

• Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni• Riduzione del rischio di reazione immunitaria• Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono

di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi• Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo

Svantaggi dei vettori non virali

• Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione • Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Vantaggi dei vettori virali

Svantaggi dei vettori virali• Alta efficienza di trasduzione

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite

• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)

• Molecole di DNA di dimensioni limitate• Reazioni immunitarie• Costi elevati

Gli adenovirus penetrano nelle cellule con un meccanismo di endocitosi mediatadai recettori

Recapito di geni mediato dai liposomi in vivo

Il trasferimento genico che utilizzal’endocitosi mediata da recettori

Inibizione mirata dell’espressione genica in vivo

PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA

1.Stabilità d’espressione del transgene nel tempo

2. Mutagenesi inserzionale

3. Regolazione dell’espressione del transgene (promotori inducibili)

4. Cell targeting

5. Pericolosità, Etica

TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE CLASSICHE

E’ importante stabilire se il processo citopatico risulta da:

Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel gene provoca perdita della funzione genicaintroduzione del gene normale OK

Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una proteina con funzioni diverse da quelle della proteina normale introduzione del gene normale INEFFICACE

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA

• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteinaterapeutica (a livelli adeguati).• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale opost-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico• Non dovrebbe essere patogeno.• Amministrabile direttamente nel paziente.• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Ben tollerato.• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.• Facile da produrre in maniera riproducibile.

IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

Vettori Retrovirali:

• Pro situazione attuale e prospettive future– efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione (linee tumorali)• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche– notevole esperienza clinica ex vivo

• Contro– integrazione random• attivazione di oncogeni• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)- Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)

ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari. La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA IMMUNODEFICIENZA

ADA e TERAPIA GENICA:

1)Il gene ADA è piccolo e clonato nel 19902)Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO3)Livello di espressione puo’ variare senza conseguenze (range 10-5000&)

TERAPIA GENICA per deficit dell’ADA

Struttura genomica ed espressione genica dei

retrovirus

• Il genoma tipico contiene 3 “geni”

– Gag (componenti del core nucleoproteico)

– Pol (replicazione e ricombinazione)

– Env (componente della membrana esterna)

Lunga sequenza terminale ripetuta

Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside

Proteina strutturale capside

Trascrittasi inversa e integrasi

Proteina per involucro

Genoma retrovirale

Vettore retrovirale

Lunghezza massima: 8Kb

Inserito nelle cellule eucariotiche

con bassissima efficienzatramite

trasfezione/elettroporazioneCon alta efficienza

Mediante INFEZIONE

Packaging cell lines

Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.

La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione.

Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

Dr. Sara Caldarola

Dr. Sara Caldarola

Dr. Sara Caldarola

Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA) 1990

La modificazione genetica dei linfociti che infiltrano il tumore coltivati in vitroPuò essere utilizzata per far esprimere geni “terapeutici” in un tumore solido

Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali