H.P.L.C.

Cromatografia liquida ad alta pressione TECNICHE SPETTROSCOPICHE

Si basano sullo studio dell’interazione

radiazione-materia

chimclinica2012@gmail.com

Psw: clin2012

Natura della radiazione elettromagnetica

Ondulatoria: onda elettromagnetica

Corpuscolare: treno di particelle dette quanti o fotoni

Lunghezza d’onda (l): distanza tra i massimi di due onde consecutive

Frequenza (n): n. di oscillazioni complete in un sec

C = l n

380 nm 780 nm

SPETTRO VISIBILE

SPETTRO delle radiazioni elettromagnetiche

Natura della radiazione elettromagnetica

Ondulatoria: onda elettromagnetica

Corpuscolare: treno di particelle dette quanti o fotoni

Energia dei fotoni E = h n

h è la costante di Plank

Ad una determinata n l’energia di ciascun fotone è sempre la stessa

L’assorbimento delle radiazioni nella materia è un processo

molto vario e complesso. I parametri importanti sono:

tipo e energia della radiazione incidente, natura del materiale.

Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare

Spettroscopia di assorbimento

Il protone si comporta come una calamita

Ciascun nucleo possiede una carica e alcuni nuclei (1H, 31P) hanno la

proprietà di ruotare su se stessi (spin).

La rotazione di una carica genera un campo magnetico.

Quando si applica una radiazione di opportuna n (risonante, 200 MHz), i nuclei

passando allo stato ad alta energia assorbono una frazione dell’energia applicata.

In assenza di campo magnetico In presenza di campo magnetico

Ai 2 orientamenti corrispondono

2 livelli energetici

Risonanza Magnetica in clinica

Analizza il comportamento dei protoni nelle molecole di acqua

(80% della massa del corpo umano) quando sottoposte a campi magnetici

ad elevata intensità.

Si applicano onde radio e i nuclei passano allo stato ad alta energia.

Il segnale radio è quindi interrotto e i protoni tornano nella posizione

precedente.

Ritornando al livello energetico più basso emettono radiazioni che

vengono trasmesse a un computer e trasformati in immagini 3D.

I tessuti ricchi di H2O, le cui molecole sono più mobili danno segnale

più forte, mentre quelli delle strutture rigide, come l’osso non ne

danno affatto.

380 nm 780 nm

SPETTRO VISIBILE

In chimica clinica si utilizzano principalmente tecniche

spettrofotometriche che utilizzano la luce UV-visibile (180-800nm)

La Spettrofotometria si basa su due principi:

• alcune molecole hanno la capacità di assorbire la luce

ad una determinata l;

• La quantità di luce assorbita è proporzionale alla

quantità di sostanza presente.

I/Io = Trasmittanza (T)

L’assorbanza è la grandezza di più immediata utilità essendo

direttamente proporzionale alla conc. molare della sostanza.

log 1/T = Assorbanza (A)

Legge di Lambert Beer

A = e c l

c = concentrazione

e = coefficiente di estinzione molare

l = cammino ottico

Elettrone allo stato

fondamentale

Elettrone allo

stato eccitato

fotone

E = hn

DE Solo se E fotone = DE = E2-E1

Perché alcune sostanze assorbono la luce

(solo a determinate l)?

Luce è policromatica (miscuglio di radiazioni a diversa l)

Luce monocromatica

(caratterizzata da una sola l)

Disperde le radiazioni grazie alla rifrazione

Come si seleziano determinate l?

Spettro a righe

Spettro a bande

Analisi quali-

quantitative

1s

2s

2p

3s

3p

3d

Livelli energetici e transizioni elettroniche nell’atomo di sodio

(N=11)

3s 3p 590 nm

4s

4s

3s 4p 330 nm

4p

Livelli energetici e transizioni elettroniche in una molecola

Sottolivelli vibrazionali

Sottolivelli rotazionali

Livelli elettronici

Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento?

Fotometro o Spettrofotometro?

Un fotometro consiste di una sorgente, di un sistema di

fenditure, di filtri, di un rivelatore fotoelettrico.

Uno spettrofotometro differisce dal fotometro per il fatto che

esso contiene un più sofisticato sistema per selezionare una

ristretta e precisa gamma di radiazioni.

Applicazioni della spettrofotometria UV-VIS

in chimica clinica

1) Proteine

2) Emoglobina e metaboliti (bilirubina)

3) Zuccheri e metaboliti (glucosio)

4) Lipidi (colesterolo, trigliceridi)

5) Ormoni

6) Enzimi (AST, ALT, CK, LDH)

Analisi delle proteine plasmatiche totali

Metodo del Biureto (colorimetrico)

Lo ione Cu2+ reagisce con i legami peptidici in soluzione alcalina

con formazione di un complesso che assorbe a 540 nm (blu).

Il reagente contiene Na,K tartrato, che complessa lo ione Cu2+ e

ne previene la precipitazione.

Misura spettrofotometrica in bicromatismo (540 -700 nm)

Interferenze: emolisi

Misure in bicromatismo

Misura a due diverse l sullo stesso campione.

Permette di evitare l’allestimento del Bianco (miscela

contenente il campione e tutti i reagenti eccetto quello

che porta alla formazione del cromoforo)

Le Proteine Plasmatiche

Insieme di macromolecole estremamente eterogeneo per

caratteristiche chimiche e funzione.

Origine prevalentemente epatica, eccetto immunoglobuline

(plasmacellule), alcune lipoproteine (intestino)

Valori sierici di riferimento: 65-83 g/l

Si dividono in 2 gruppi:

1) Albumine

2) Globuline (4 tipi principali)

Mediante tecniche di laboratorio è possibile

fornire al clinico i valori di:

• proteine totali plasmatiche

• albumina

• rapporto albumina/globuline

L’aumento di proteine totali plasmatiche (meno frequente):

per disidratazione (vomito, diarrea, eccessiva sudorazione)

La diminuzione di proteine totali plasmatiche (piu’ frequente):

Diminuita sintesi per:

- insufficiente assunzione di amminoacidi (malnutrizione, malassorbimento)

- Malattie epatiche

Aumentata perdita per danni renali (escrezione eccessiva per

malfunzionamento glomerulo)

La presenza di proteine nelle urine (proteinuria) puo’

indicare un danno renale che provoca maggior

permeabilità del glomerulo renale alle proteine plasmatiche

Analisi delle proteine nelle urine

Nei soggetti normali: 40-150 mg/24h

Analisi delle proteine nelle urine

Metodo colorimetrico per dosaggio proteine totali

Il legame del colorante alle proteine determina uno spostamento del max di

assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide.

Il colorante Coomassie Brilliant Blue si lega specificatamente a residui di

arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina. Agisce primariamente

con i residui di arginina.

Misura spettrofotometrica in bicromatismo (595 -465 nm)

…Although the method is simple and fast, the unequal

dyebinding responses of individual proteins require

caution when applying this test to the complex mixture of

protein found in serum.

Enzimi come reagenti

Glucosio + O2 + H2O acido gluconico + H2O2

H2O2 + 4-aminoantipirina + fenolo chinoneimina + H2O

Glucosio

ossidasi

perossidasi

Cromoforo

Colorazione rossa

Determinazione del Glucosio con metodo

spettrofotometrico

Enzimi come indici di sofferenza tissutale

(ausilio diagnostico)

Piruvato + NADH + H+ Lattato + NAD+

LDH

Determinazione della Lattico Deidrogenasi (LDH) nel sangue

LDH H4 aumenta nell’infarto del miocardio, LDH M4

aumenta nelle lesioni di tessuto muscolare o epatico

Solo NADH assorbe a 340 nm

Il coenzima NAD è coinvolto nelle

reazioni catalizzate dalle deidrogenasi

E = hn

DE

b) hn

a) Rilassamento termico

ASSORBIMENTO

(ECCITAZIONE)

EMISSIONE

Fluorimetria

Spettrofotometria di fluorescenza

Sensibilità è 100-10000 volte superiore a metodi fotometrici

Maggiore specificità

Fluorimetro

Determinazione quantitativa

L’intensità di fluorescenza è proporzionale alla

concentrazione dell’analita (in soluzione diluite)

VANTAGGI

Sensibilità è 100-10000 volte superiore a metodi fotometrici

Maggiore specificità

SVANTAGGI

Sensibilità a variazione delle condizioni sperimentali (pH, temperatura) quenching

Studio e diagnosi di malattie congenite da alterazione del

metabolismo degli amminoacidi (fenilchetonuria)

La presenza di aspartame nel prodotto fa sì che esso

contenga una fonte di fenilanina. Pertanto, il prodotto

non è adatto a persone affette dalla malattia ereditaria

denominata fenilchetonuria.

Amminoacidopatie

Fenilchetonuria deficienza dell’enzima fenilalanina

idrossilasi (PAH)

X

Barriera

Emato-Encefalica

O=

Phenylpyruvate

Fenilalanina

transaminasi Inibitore competitivo

per piruvato

Inibitore di enzimi

della glicolisi

CICLO

DELL’UREA

Citrullinemia deficienza dell’enzima argininosuccinato sintetasi

AA vengono derivatizzati con sostanza

fluorescente per essere rivelabili

E = hn

DE

b) hn

a) Rilassamento termico

ASSORBIMENTO

(ECCITAZIONE)

EMISSIONE

Processi che danno luogo ad emissione di energia radiante

Eccitazione tipi di luminescenza

Radiazione EB fotoluminescenza (fluorescenza, fosforescenza)

Reazione chimica chemiluminescenza

Reazione in sistemi biologici bioluminescenza

Luminescenza

Emissione di luce da parte di una molecola che

passa dallo eccitato allo stato fondamentale

Quando lo stato eccitato viene prodotto da una

reazione chimica, si parla di chemiluminescenza

Perossidasi

luminolo

Condizione necessaria perchè si verifichi

chemiluminescenza è che la reazione sia esoergonica in

modo che i prodotti della reazione si vengano a trovare in

stati elettronici eccitati. L'emissione si verifica poi per

fluorescenza.

Limite di rivelabilità: 10-15 M

Intervallo di linearità: 10-12 – 10-6 M

Turbidimetria e Nefelometria

Tecniche analitiche impiegate per misurare la luce diffusa.

La diffusione della luce è un fenomeno fisico che dipende dalla

concentrazione e dalla dimensione di particelle in un campione .

Rivelatore: a 180° rispetto a radiazione incidente

a 90° rispetto a raggio incidente