Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie

AM-tbmadc 2

Definizione della patologia

• Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane

• Classificazione clinica – gravità

• Classificazione genetica – tipo di catena

• Classificazione molecolare – tipo di mutazione

AM-tbmadc 3

AM-tbmadc 4

Classificazione clinica

• Major (idrope fetale, -tal major)

• Intermedia (-tal interm., HbH)

• Portatore ( e )

• Portatore silente ( e )

AM-tbmadc 5

STRISCIO DI SANGUE PERIFERICO(colorazione May-Grunwald-Giemsa)

Soggetto normale Portatore di -talassemia

Nel portatore di -talassemia è rilevabile: aspetto ipocromico, aniso-micro-poichilocitosidelle emazie, presenza di schistociti, emazie a bersaglio, ed emazie a lacrima.

I.Bianco Silvestroni, 1998

AM-tbmadc 6

-TALASSEMIA: alterazioni ematologicheETEROZ. OMOZ.

Anemia ipocromica microcitica lieve grave

- Hb, g/dL (11-14) (< 7)

- MCH, pg (< 25)

- MCV, fL (< 78)

- RBC x1012/L (> 5.5)

- Hb A2, % (4-7) =/

- Hb F, % /= (1-3) (60-96)

- reticolociti, /1000 (3-10)

Anisopoichilocitosi + ++

Rapporto / 2 >>2

Resistenza globulare osmot.

RBC t1/2, d /= (7-22)

Bilirubina, mg/dL = (4-5)

AM-tbmadc 7

talassemia Lepore HPFH

eteroz. omoz. eteroz. omoz. eteroz. omoz.

Hb, g/dL (9-12) (< 7) = (15-17)

MCV, fL /= /=

Hb A2, % (1-2) assente

Hb F, % (5-20) (100) (1-5) (80-90) (15-35) (100)

altro Hb Lepore Hb Lepore

AM-tbmadc 8

-talassemia: alterazioni ematologiche

-/ -/- --/ --/- Hb H --/--

Hb, g/dL =

MCV, fL = =

Hb A2 = = = assente

Hb F = = assente

Reticol. /1000 = 0.8-1.4 0.8-1.4

Rapporto / 0.8 0.6 0.6 0.3 0

Hb Bart nasc. % 1-2 5-10 5-10 10-20 80

Altro Hb H rar. Hb H (5-30 %) Hb Port. 20%

AM-tbmadc 9

-thal alleles (47)-thal alleles (47)-(3.7) initiation cd ACCATG - - CATG2 ATGACG1 ATGGTG2 cd 29 TC (Agrinio)2 IVS1 (-5nt)2/1 cd 110 CA (Petah Tikva)2 cd 142 TA (Icaria)2 polyA ATAAATGA

-thal alleles (18)-thal alleles (18) -thal alleles-thal alleles

-65 AG-55 TCcd 4 CTcd 27 GTCorfù –7.2 Kb

Hb LeporeHb Lepore

-thal alleles-thal allelesSicilianSpanishTurkishMacedonian

HPFHHPFH

Structural variantsStructural variants

HbSHbCHbD PunjabHbO-Arab

Heterogeneity of hemoglobinopathies in Mediterranean

-3.7

-4.2

-3.7 Hb Hasharon -()20.5

--MED-I--MED-II-()5.2

--(MA)--(CL)--(CAL)

HPFH –4HPFH –5

-196 A C T-117 A G A

Sardinian

5 - CT8/9 + G30 C1-1 A1-2 A1-2 G1-5 C1-5 T1-110 A1-116 G1-130 C39 T37 A44-C54-T59-A7-C2-705 C2-745 G2-843 G2-844 A2-850-G2-850 C

-90 T-88 A-88 T-87 G-87 T-87 A-86 A-31 C-30 A-30 C6 - A8 - AA27 T1-5 A1-6 C2-1 AAACAAAAATGAAA

-101 T-92 TUTR +10-T+ 33 G2-844 GAATAAG

AM-tbmadc 10

Cap Poly-A

AM-tbmadc 11

TATAbox

• 2 enhancers a 600 – 900 bp a valle del gene+

AM-tbmadc 12

AM-tbmadc 13

Fattori di trascrizione del gene -globinico

• GATA-1 + FOG (GATA: 2 domini Zinc-finger)

• NF-E2 (PLTs)• EKLF (3 Zinc-finger; switch)• Fattore stadio-specifico (SSP; stimola )

AM-tbmadc 14

AM-tbmadc 15

AM-tbmadc 16

RELATIVE FREQUENCIES OF RELATIVE FREQUENCIES OF -THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE-THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE

Galanello et al, TIF 2003Galanello et al, TIF 2003

AM-tbmadc 17

RELATIVE FREQUENCIES OF RELATIVE FREQUENCIES OF -THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE -THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE

Galanello et al, TIF 2003Galanello et al, TIF 2003

AM-tbmadc 18

n° (in ordine di frequenza)

MUTAZIONI FENOT.

1 CD39 (C-T) non-sense 0

2 IVS1:110 (G-A) RNA processing mutant +

3 IVS1:6 (T-C) RNA processing mutant +

4 IVS1:1 (G-A) RNA processing mutant +

5 IVS2:745 (C-G) RNA processing mutant +

6 IVS2:1 (G-A) RNA processing mutant +

7 -87 (C-G) transcriptional mutant +

8 CD6-A frameshift 0

AM-tbmadc 19

AM-tbmadc 20

AM-tbmadc 21

Epidemiology of thalassemia: Epidemiology of thalassemia: global estimateglobal estimate

• Carrier rate 4.9% of world populat.

• Total carriers 300,000,000

• Newborn carriers with Hb disorders 6.1%

• Newborns with a major Hb disorders 2.1/1000

• Affected births/year 307,000

(WHO 1998)

AM-tbmadc 22

AM-tbmadc 23

MCH, MCV

HbA2, HbF

Assetto emoglobinico

Metabolismo del Ferro

Sintesi delle catene globiniche

Analisi dei geni globinici

Studi famigliari

MCH, MCV

HbA2, HbF

Assetto emoglobinico

Metabolismo del Ferro

Sintesi delle catene globiniche

Analisi dei geni globinici

Studi famigliari

Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per l’identificazione del portatore

talassemico

Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per l’identificazione del portatore

talassemico

AM-tbmadc 24

Fenotipo “classico” del portatore di talassemia

Fenotipo “classico” del portatore di talassemia

MCV, fL 67 ± 6

MCH, pg 22 ± 2

HbA2, % 5 ± 1

Hb elettroforesi A + (F) + A2

Rapporto > 1,20

MCV, fL 67 ± 6

MCH, pg 22 ± 2

HbA2, % 5 ± 1

Hb elettroforesi A + (F) + A2

Rapporto > 1,20

AM-tbmadc 25

Falsi positivi: - talassemia

- a. sideropenica

Falsi negativi: - interazione talassemia

- deficit folati e B12

Falsi positivi: - talassemia

- a. sideropenica

Falsi negativi: - interazione talassemia

- deficit folati e B12

Limiti nell’utilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di

talassemia

Limiti nell’utilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di

talassemia

AM-tbmadc 26

MCV, fl 76.0MCH, pg 26.0HbA2, % 2.5

MCV, fl 76.0MCH, pg 26.0HbA2, % 2.5

MCV, fl 72.2MCH, pg 23.3HbA2, % 5.6

MCV, fl 72.2MCH, pg 23.3HbA2, % 5.6

MCV, fl 83.2MCH, pg 28.1HbA2, % 6.0

MCV, fl 83.2MCH, pg 28.1HbA2, % 6.0

Doppia eterozigosi pere talassemia

AM-tbmadc 27

Correlazione genotipo-fenotipo

• Fenotipo eterogeneo per:– Gravità della mutazione– Interazioni (, , )

talassemia e varianti emoglobiniche– Altre modificazioni genetiche ed ambientali

AM-tbmadc 28

50

55

60

65

70

75

80

85

90

1

2

3

4

5

6

7

Hb

A2,

%

ND ND

Effetti della co-ereditarietà di diversi alleli -talassemici sullo MCV in soggetti portatori di -talassemia

MCV, fL HbA2, %

(R. Galanello, 2002)

AM-tbmadc 29

Varianti emoglobiniche e sindromi talassemiche

• Varianti emoglobiniche (2002) 845(erano 202 nel 1976)

• Mutazioni talassemiche 336(4,5 % eterozigoti = 250.000.000 world-wide)

• Emoglobinopatie con fenotipo talassemico 43

AM-tbmadc 30

• Microcitosi con HbA2 normale

• HbF elevate

• HbA2 “borderline”

• Microcitosi con HbA2 normale

• HbF elevate

• HbA2 “borderline”

Problemi nello screening delle talassemieProblemi nello screening delle talassemie

AM-tbmadc 31

- condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus)- condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus)

HbA2, senza -talassemiaHbA2, senza -talassemia

HbA2, in presenza di -talassemiaHbA2, in presenza di -talassemia

- alleli talassemici “silenti”

-interazione tra e talassemia

- a. sideropenica grave

- associazione tra -tal. ed una variante con mutazione sulle catene

Limiti nell’utilizzo della sola HbA2 nella identificazione del portatore di talassemia

Limiti nell’utilizzo della sola HbA2 nella identificazione del portatore di talassemia

AM-tbmadc 32

Hemoglobin and HbA2 in non- and -thalassemia trait with iron deficiency

Hemoglobin and HbA2 in non- and -thalassemia trait with iron deficiency

non

-thal trait

Galanello et al., 1981

AM-tbmadc 33

0

1

2

3

4

5

6

7

non

silent

IVS2- 844 CG

mild

severesevere

Hb

A2

(%)

- 101 CT

Livelli di HbA2 in diversi tipi di mutazioni -talassemiche

Livelli di HbA2 in diversi tipi di mutazioni -talassemiche

IVS1-6 TC

° 39 CT

(R. Galanello, 2002)

AM-tbmadc 34

Interazione e talassemia

MCV, fl 77MCH, pg 25HbA2, % 1.6

Family F.F.

65 20 4.9

ratio 1.92

MCV, fl 67MCH, pg 21HbA2, % 3.3

+ cd 27 G T

° cd 6(-A)

AM-tbmadc 35

- Hb F 9 – 20 %, sintesi catene 1,6 – 2,4- Hb F 9 – 20 %, sintesi catene 1,6 – 2,4

delezione delezione

HPFHHPFH

-HbF 3-4 % (scarso significato)

-HbF 16-20 % sintesi catene normale

HbF elevateHbF elevate

AM-tbmadc 36

Cause di aumento dell’HbF Cause di aumento dell’HbF

GeneticheGenetiche AcquisiteAcquisite

-talassemia

-talassemia

HPFH

anemia congenita ipoplastica

-talassemia

-talassemia

HPFH

anemia congenita ipoplastica

Espansione eritropoieticatrapianto di midolloemolisi acutagravidanza

Associata con tumori ematopoieticileucemia juvenile cronica mielogenaaltri disordini mieloproliferativisindromi preleucemiche

Farmacologica5-AzaHUEpoButirratiAltri grassi a catena corta

Espansione eritropoieticatrapianto di midolloemolisi acutagravidanza

Associata con tumori ematopoieticileucemia juvenile cronica mielogenaaltri disordini mieloproliferativisindromi preleucemiche

Farmacologica5-AzaHUEpoButirratiAltri grassi a catena corta

AM-tbmadc 37

serra

Time (Minutes)87654321

Abso

rban

ce (m

V)

2

1

0

2.7

9 2

.91

3.1

5 3

.32

3.3

5 3

.52

3.8

8

4.9

1

7.7

8

beta 0 39

Time (Minutes)87654321

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

0

2.0

0 2.7

0 2

.90

3.0

5 3.3

4 3

.56

3.9

4

4.6

3 4

.86

7.7

3

WTWT 39 39

ivs1 nt 6

Time (Minutes)87654321

Abso

rban

ce (m

V)

14

12

10

8

6

4

2

0

2.6

9 2

.74

3.3

0 3

.32

4.4

5

4.7

7

7.5

6 7

.67

IVSI nt 6 IVSI nt 6

beta 6

Time (Minutes)87654321

Abso

rban

ce (m

V)

2

1

0

2.6

4 2

.83 3

.26

3.3

1

3.8

6 3

.95

4.6

0 4

.87

7.6

8 7

.72

7.7

8

6 6

ivs1 nt 1

Time (Minutes)87654321

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

0

2.6

6 2

.85

3.3

1 3

.36

3.8

9

4.5

9

4.9

0

7.7

9

IVSI nt 1 IVSI nt 1

ivs1 nt 110

Time (Minutes)87654321

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

0

2.7

5 2

.83 3.2

7 3

.33 3

.49

3.7

6 3

.92

4.5

1

4.8

5

7.7

6 7

.80

7.8

3

IVSI nt 110 IVSI nt 110

ivs 2 nt 1

Time (Minutes)87654321

Absorb

ance (

mV

)

5

4

3

2

1

0

2.7

2

3.0

2

3.2

6 3

.35

3.6

2 4.0

2

4.6

8 4

.83

7.7

8

IVSII nt 1 IVSII nt 1

-101

Time (Minutes)87654321

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

0

2.6

6

3.6

2 3

.76 3

.93

5.8

8

6.4

9

6.7

7

-101 -101

-92

Time (Minutes)87654321

Abso

rban

ce (m

V)

3

2

1

0

2.6

8

3.3

9

3.7

8 3

.94

5.9

5

6.3

9

6.7

8

-92 -92

-87

Time (Minutes)87654321

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

0

2.6

8

3.4

6

3.8

1 3

.99

5.7

7 5

.89

6.7

7

-87 -87 IVSII 844 IVSII 844 +27 +27

DELTA 27BRCA-2 EXO-10 B @ 56 pcr 209-210=211=212=213

Time (Minutes)76543210

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

IVS 844BRCA-2 EXO-10 B @ 56 pcr 209-210=211=212=213

Time (Minutes)76543210

Abs

orba

nce

(mV

)

1

0

Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta

Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta

AM-tbmadc 38

Terapia molecolare

• Terapia genica farmacologica (gene – idrossiurea– acido butirrico

• Trapianto genico (terapia genica somatica)– trasfezione gene -globinico normale

• vettore retrovirale– murine leukemia

– Lentivirus

• Manipolazione dello “switch”

AM-tbmadc 39

Danno ossidativo

• HbO2 MetHb

• Globine o Emicromi corpi di inclusione legame alle membrane degradazione eme ROS perossidazione lipida + GSH + MDA + esposizione PS emolisi

• Antiossidanti: vit E, flavonoidi, polifenoli

AM-tbmadc 40

Pathways coinvolte nel danno alle membrane degli eritrociti in α e β

talassemia

Weatherall DJ, 1998

AM-tbmadc 41

Prodotti di degradazione delle catene globiniche:

• Globina• Eme

• Emina (forma ossidata dell’eme)• Fe libero

FORMAZIONE DI ROS (reactive oxygen species)

AM-tbmadc 42

ROS (reactive oxygen species)

Danni a organelli intracellulari, proteine (banda 4.1)

e lipidi di membrana

Gutteridge JMC, 1995

AM-tbmadc 43

Meccanismi di perossidazione lipidica

Gutteridge JMC, 1995

AM-tbmadc 44

In pazienti affetti da talassemia si riscontra un aumento significativo di TBARS e CD, markers di perossidazione

lipidica…

Meral A et al. 2000

AM-tbmadc 45

AM-tbmadc 46

CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLEEMOGLOBINOPATIE (1/2)

------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione-------------------------------------------------------------------------------------------------1) Nessuna Sup. esterna Nessuna Hb G Philadelphia 68 Asn ->Lys

2) Aggregazione Sup. esterna Anemia emol. Hb S ridotta solub. (omozigote) 6 Glu ->Val

3) Instabilità Eme/ Anemia emol. Hb Bristol ridotta solub. contatti subun. 67 Val ->Asp

4) Met Hb His prox./dis. Cianosi Hb M Hyde Park 92 His -> Tyr

AM-tbmadc 47

CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (2/2)

------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione-------------------------------------------------------------------------------------------------5) Aumentata Contatto 12 Eritrocitosi Hb Chesapeake affinità O2 C-terminale 92 Arg -> Leu 6) Diminuita Eme/12 Cianosi Hb Kansas affinità O2 102 Asn ->Thr

7) Ridotta produz. Mutazione Fenotipo Hb Constant catene C-terminale talassemico Spring (+31)

8) Ridotta prod. Ibrido di fusione Fenotipo Hb Lepore catene talassemico

AM-tbmadc 48

Drepanocitosi(anemia falciforme)

AM-tbmadc 49

Fenotipo anemia falciforme(anemia emolitica cronica + crisi vaso-occlusive)

• Periostite metacarpale piede-mano• Osteonecrosi della testa del femore• Infarto cerebrale• Sindrome acuta-toracica• Retinopatie• Epatopatie• Ipostenuria da lesione midollare renale• Ulcere malleolari• Sequestrazione splenica• Infezioni gravi da germi capsulati (pneumococco)

AM-tbmadc 50

Correlazione genotipo-fenotiponell’anemia falciforme

Genotipo al locus HbS/HbC HbS/-talassemia

Geni modificatori HbF (cromosoma X e 6) Aplotipi -globinici

Benin, Senegal, Bantù, Centro-Africa, Arabo-IndianoPolimorfismo C->T in -158 gG (HbF più elevata)

-talassemia