Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie. AM-tbmadc 2 Definizione della patologia Assenza o ridotta...
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Sindromi talassemiche ed emoglobinopatie
AM-tbmadc 2
Definizione della patologia
• Assenza o ridotta sintesi di una o più catene globiniche umane
• Classificazione clinica – gravità
• Classificazione genetica – tipo di catena
• Classificazione molecolare – tipo di mutazione
AM-tbmadc 3
AM-tbmadc 4
Classificazione clinica
• Major (idrope fetale, -tal major)
• Intermedia (-tal interm., HbH)
• Portatore ( e )
• Portatore silente ( e )
AM-tbmadc 5
STRISCIO DI SANGUE PERIFERICO(colorazione May-Grunwald-Giemsa)
Soggetto normale Portatore di -talassemia
Nel portatore di -talassemia è rilevabile: aspetto ipocromico, aniso-micro-poichilocitosidelle emazie, presenza di schistociti, emazie a bersaglio, ed emazie a lacrima.
I.Bianco Silvestroni, 1998
AM-tbmadc 6
-TALASSEMIA: alterazioni ematologicheETEROZ. OMOZ.
Anemia ipocromica microcitica lieve grave
- Hb, g/dL (11-14) (< 7)
- MCH, pg (< 25)
- MCV, fL (< 78)
- RBC x1012/L (> 5.5)
- Hb A2, % (4-7) =/
- Hb F, % /= (1-3) (60-96)
- reticolociti, /1000 (3-10)
Anisopoichilocitosi + ++
Rapporto / 2 >>2
Resistenza globulare osmot.
RBC t1/2, d /= (7-22)
Bilirubina, mg/dL = (4-5)
AM-tbmadc 7
talassemia Lepore HPFH
eteroz. omoz. eteroz. omoz. eteroz. omoz.
Hb, g/dL (9-12) (< 7) = (15-17)
MCV, fL /= /=
Hb A2, % (1-2) assente
Hb F, % (5-20) (100) (1-5) (80-90) (15-35) (100)
altro Hb Lepore Hb Lepore
AM-tbmadc 8
-talassemia: alterazioni ematologiche
-/ -/- --/ --/- Hb H --/--
Hb, g/dL =
MCV, fL = =
Hb A2 = = = assente
Hb F = = assente
Reticol. /1000 = 0.8-1.4 0.8-1.4
Rapporto / 0.8 0.6 0.6 0.3 0
Hb Bart nasc. % 1-2 5-10 5-10 10-20 80
Altro Hb H rar. Hb H (5-30 %) Hb Port. 20%
AM-tbmadc 9
-thal alleles (47)-thal alleles (47)-(3.7) initiation cd ACCATG - - CATG2 ATGACG1 ATGGTG2 cd 29 TC (Agrinio)2 IVS1 (-5nt)2/1 cd 110 CA (Petah Tikva)2 cd 142 TA (Icaria)2 polyA ATAAATGA
-thal alleles (18)-thal alleles (18) -thal alleles-thal alleles
-65 AG-55 TCcd 4 CTcd 27 GTCorfù –7.2 Kb
Hb LeporeHb Lepore
-thal alleles-thal allelesSicilianSpanishTurkishMacedonian
HPFHHPFH
Structural variantsStructural variants
HbSHbCHbD PunjabHbO-Arab
Heterogeneity of hemoglobinopathies in Mediterranean
-3.7
-4.2
-3.7 Hb Hasharon -()20.5
--MED-I--MED-II-()5.2
--(MA)--(CL)--(CAL)
HPFH –4HPFH –5
-196 A C T-117 A G A
Sardinian
5 - CT8/9 + G30 C1-1 A1-2 A1-2 G1-5 C1-5 T1-110 A1-116 G1-130 C39 T37 A44-C54-T59-A7-C2-705 C2-745 G2-843 G2-844 A2-850-G2-850 C
-90 T-88 A-88 T-87 G-87 T-87 A-86 A-31 C-30 A-30 C6 - A8 - AA27 T1-5 A1-6 C2-1 AAACAAAAATGAAA
-101 T-92 TUTR +10-T+ 33 G2-844 GAATAAG
AM-tbmadc 10
Cap Poly-A
AM-tbmadc 11
TATAbox
• 2 enhancers a 600 – 900 bp a valle del gene+
AM-tbmadc 12
AM-tbmadc 13
Fattori di trascrizione del gene -globinico
• GATA-1 + FOG (GATA: 2 domini Zinc-finger)
• NF-E2 (PLTs)• EKLF (3 Zinc-finger; switch)• Fattore stadio-specifico (SSP; stimola )
AM-tbmadc 14
AM-tbmadc 15
AM-tbmadc 16
RELATIVE FREQUENCIES OF RELATIVE FREQUENCIES OF -THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE-THALASSEMIA MUTATIONS IN WEST EUROPE
Galanello et al, TIF 2003Galanello et al, TIF 2003
AM-tbmadc 17
RELATIVE FREQUENCIES OF RELATIVE FREQUENCIES OF -THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE -THALASSEMIA MUTATIONS IN MEDITERRANEAN EUROPE
Galanello et al, TIF 2003Galanello et al, TIF 2003
AM-tbmadc 18
n° (in ordine di frequenza)
MUTAZIONI FENOT.
1 CD39 (C-T) non-sense 0
2 IVS1:110 (G-A) RNA processing mutant +
3 IVS1:6 (T-C) RNA processing mutant +
4 IVS1:1 (G-A) RNA processing mutant +
5 IVS2:745 (C-G) RNA processing mutant +
6 IVS2:1 (G-A) RNA processing mutant +
7 -87 (C-G) transcriptional mutant +
8 CD6-A frameshift 0
AM-tbmadc 19
AM-tbmadc 20
AM-tbmadc 21
Epidemiology of thalassemia: Epidemiology of thalassemia: global estimateglobal estimate
• Carrier rate 4.9% of world populat.
• Total carriers 300,000,000
• Newborn carriers with Hb disorders 6.1%
• Newborns with a major Hb disorders 2.1/1000
• Affected births/year 307,000
(WHO 1998)
AM-tbmadc 22
AM-tbmadc 23
MCH, MCV
HbA2, HbF
Assetto emoglobinico
Metabolismo del Ferro
Sintesi delle catene globiniche
Analisi dei geni globinici
Studi famigliari
MCH, MCV
HbA2, HbF
Assetto emoglobinico
Metabolismo del Ferro
Sintesi delle catene globiniche
Analisi dei geni globinici
Studi famigliari
Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per l’identificazione del portatore
talassemico
Emoglobinopatie: test di laboratorio utili per l’identificazione del portatore
talassemico
AM-tbmadc 24
Fenotipo “classico” del portatore di talassemia
Fenotipo “classico” del portatore di talassemia
MCV, fL 67 ± 6
MCH, pg 22 ± 2
HbA2, % 5 ± 1
Hb elettroforesi A + (F) + A2
Rapporto > 1,20
MCV, fL 67 ± 6
MCH, pg 22 ± 2
HbA2, % 5 ± 1
Hb elettroforesi A + (F) + A2
Rapporto > 1,20
AM-tbmadc 25
Falsi positivi: - talassemia
- a. sideropenica
Falsi negativi: - interazione talassemia
- deficit folati e B12
Falsi positivi: - talassemia
- a. sideropenica
Falsi negativi: - interazione talassemia
- deficit folati e B12
Limiti nell’utilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di
talassemia
Limiti nell’utilizzo dei parametri eritrocitari (MCV, MCH) nella identificazione del portatore di
talassemia
AM-tbmadc 26
MCV, fl 76.0MCH, pg 26.0HbA2, % 2.5
MCV, fl 76.0MCH, pg 26.0HbA2, % 2.5
MCV, fl 72.2MCH, pg 23.3HbA2, % 5.6
MCV, fl 72.2MCH, pg 23.3HbA2, % 5.6
MCV, fl 83.2MCH, pg 28.1HbA2, % 6.0
MCV, fl 83.2MCH, pg 28.1HbA2, % 6.0
Doppia eterozigosi pere talassemia
AM-tbmadc 27
Correlazione genotipo-fenotipo
• Fenotipo eterogeneo per:– Gravità della mutazione– Interazioni (, , )
talassemia e varianti emoglobiniche– Altre modificazioni genetiche ed ambientali
AM-tbmadc 28
50
55
60
65
70
75
80
85
90
1
2
3
4
5
6
7
Hb
A2,
%
ND ND
Effetti della co-ereditarietà di diversi alleli -talassemici sullo MCV in soggetti portatori di -talassemia
MCV, fL HbA2, %
(R. Galanello, 2002)
AM-tbmadc 29
Varianti emoglobiniche e sindromi talassemiche
• Varianti emoglobiniche (2002) 845(erano 202 nel 1976)
• Mutazioni talassemiche 336(4,5 % eterozigoti = 250.000.000 world-wide)
• Emoglobinopatie con fenotipo talassemico 43
AM-tbmadc 30
• Microcitosi con HbA2 normale
• HbF elevate
• HbA2 “borderline”
• Microcitosi con HbA2 normale
• HbF elevate
• HbA2 “borderline”
Problemi nello screening delle talassemieProblemi nello screening delle talassemie
AM-tbmadc 31
- condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus)- condizioni acquisite (ipertiroidismo, anemia megaloblastica, terapia con farmaci anti-retrovirus)
HbA2, senza -talassemiaHbA2, senza -talassemia
HbA2, in presenza di -talassemiaHbA2, in presenza di -talassemia
- alleli talassemici “silenti”
-interazione tra e talassemia
- a. sideropenica grave
- associazione tra -tal. ed una variante con mutazione sulle catene
Limiti nell’utilizzo della sola HbA2 nella identificazione del portatore di talassemia
Limiti nell’utilizzo della sola HbA2 nella identificazione del portatore di talassemia
AM-tbmadc 32
Hemoglobin and HbA2 in non- and -thalassemia trait with iron deficiency
Hemoglobin and HbA2 in non- and -thalassemia trait with iron deficiency
non
-thal trait
Galanello et al., 1981
AM-tbmadc 33
0
1
2
3
4
5
6
7
non
silent
IVS2- 844 CG
mild
severesevere
Hb
A2
(%)
- 101 CT
Livelli di HbA2 in diversi tipi di mutazioni -talassemiche
Livelli di HbA2 in diversi tipi di mutazioni -talassemiche
IVS1-6 TC
° 39 CT
(R. Galanello, 2002)
AM-tbmadc 34
Interazione e talassemia
MCV, fl 77MCH, pg 25HbA2, % 1.6
Family F.F.
65 20 4.9
ratio 1.92
MCV, fl 67MCH, pg 21HbA2, % 3.3
+ cd 27 G T
° cd 6(-A)
AM-tbmadc 35
- Hb F 9 – 20 %, sintesi catene 1,6 – 2,4- Hb F 9 – 20 %, sintesi catene 1,6 – 2,4
delezione delezione
HPFHHPFH
-HbF 3-4 % (scarso significato)
-HbF 16-20 % sintesi catene normale
HbF elevateHbF elevate
AM-tbmadc 36
Cause di aumento dell’HbF Cause di aumento dell’HbF
GeneticheGenetiche AcquisiteAcquisite
-talassemia
-talassemia
HPFH
anemia congenita ipoplastica
-talassemia
-talassemia
HPFH
anemia congenita ipoplastica
Espansione eritropoieticatrapianto di midolloemolisi acutagravidanza
Associata con tumori ematopoieticileucemia juvenile cronica mielogenaaltri disordini mieloproliferativisindromi preleucemiche
Farmacologica5-AzaHUEpoButirratiAltri grassi a catena corta
Espansione eritropoieticatrapianto di midolloemolisi acutagravidanza
Associata con tumori ematopoieticileucemia juvenile cronica mielogenaaltri disordini mieloproliferativisindromi preleucemiche
Farmacologica5-AzaHUEpoButirratiAltri grassi a catena corta
AM-tbmadc 37
serra
Time (Minutes)87654321
Abso
rban
ce (m
V)
2
1
0
2.7
9 2
.91
3.1
5 3
.32
3.3
5 3
.52
3.8
8
4.9
1
7.7
8
beta 0 39
Time (Minutes)87654321
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
0
2.0
0 2.7
0 2
.90
3.0
5 3.3
4 3
.56
3.9
4
4.6
3 4
.86
7.7
3
WTWT 39 39
ivs1 nt 6
Time (Minutes)87654321
Abso
rban
ce (m
V)
14
12
10
8
6
4
2
0
2.6
9 2
.74
3.3
0 3
.32
4.4
5
4.7
7
7.5
6 7
.67
IVSI nt 6 IVSI nt 6
beta 6
Time (Minutes)87654321
Abso
rban
ce (m
V)
2
1
0
2.6
4 2
.83 3
.26
3.3
1
3.8
6 3
.95
4.6
0 4
.87
7.6
8 7
.72
7.7
8
6 6
ivs1 nt 1
Time (Minutes)87654321
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
0
2.6
6 2
.85
3.3
1 3
.36
3.8
9
4.5
9
4.9
0
7.7
9
IVSI nt 1 IVSI nt 1
ivs1 nt 110
Time (Minutes)87654321
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
0
2.7
5 2
.83 3.2
7 3
.33 3
.49
3.7
6 3
.92
4.5
1
4.8
5
7.7
6 7
.80
7.8
3
IVSI nt 110 IVSI nt 110
ivs 2 nt 1
Time (Minutes)87654321
Absorb
ance (
mV
)
5
4
3
2
1
0
2.7
2
3.0
2
3.2
6 3
.35
3.6
2 4.0
2
4.6
8 4
.83
7.7
8
IVSII nt 1 IVSII nt 1
-101
Time (Minutes)87654321
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
0
2.6
6
3.6
2 3
.76 3
.93
5.8
8
6.4
9
6.7
7
-101 -101
-92
Time (Minutes)87654321
Abso
rban
ce (m
V)
3
2
1
0
2.6
8
3.3
9
3.7
8 3
.94
5.9
5
6.3
9
6.7
8
-92 -92
-87
Time (Minutes)87654321
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
0
2.6
8
3.4
6
3.8
1 3
.99
5.7
7 5
.89
6.7
7
-87 -87 IVSII 844 IVSII 844 +27 +27
DELTA 27BRCA-2 EXO-10 B @ 56 pcr 209-210=211=212=213
Time (Minutes)76543210
Abs
orba
nce
(mV
)
3
2
1
IVS 844BRCA-2 EXO-10 B @ 56 pcr 209-210=211=212=213
Time (Minutes)76543210
Abs
orba
nce
(mV
)
1
0
Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta
Analisi con DHPLC di soggetti eterozigoti per mutazioni del gene beta e delta
AM-tbmadc 38
Terapia molecolare
• Terapia genica farmacologica (gene – idrossiurea– acido butirrico
• Trapianto genico (terapia genica somatica)– trasfezione gene -globinico normale
• vettore retrovirale– murine leukemia
– Lentivirus
• Manipolazione dello “switch”
AM-tbmadc 39
Danno ossidativo
• HbO2 MetHb
• Globine o Emicromi corpi di inclusione legame alle membrane degradazione eme ROS perossidazione lipida + GSH + MDA + esposizione PS emolisi
• Antiossidanti: vit E, flavonoidi, polifenoli
AM-tbmadc 40
Pathways coinvolte nel danno alle membrane degli eritrociti in α e β
talassemia
Weatherall DJ, 1998
AM-tbmadc 41
Prodotti di degradazione delle catene globiniche:
• Globina• Eme
• Emina (forma ossidata dell’eme)• Fe libero
FORMAZIONE DI ROS (reactive oxygen species)
AM-tbmadc 42
ROS (reactive oxygen species)
Danni a organelli intracellulari, proteine (banda 4.1)
e lipidi di membrana
Gutteridge JMC, 1995
AM-tbmadc 43
Meccanismi di perossidazione lipidica
Gutteridge JMC, 1995
AM-tbmadc 44
In pazienti affetti da talassemia si riscontra un aumento significativo di TBARS e CD, markers di perossidazione
lipidica…
Meral A et al. 2000
AM-tbmadc 45
AM-tbmadc 46
CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLEEMOGLOBINOPATIE (1/2)
------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione-------------------------------------------------------------------------------------------------1) Nessuna Sup. esterna Nessuna Hb G Philadelphia 68 Asn ->Lys
2) Aggregazione Sup. esterna Anemia emol. Hb S ridotta solub. (omozigote) 6 Glu ->Val
3) Instabilità Eme/ Anemia emol. Hb Bristol ridotta solub. contatti subun. 67 Val ->Asp
4) Met Hb His prox./dis. Cianosi Hb M Hyde Park 92 His -> Tyr
AM-tbmadc 47
CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE EMOGLOBINOPATIE (2/2)
------------------------------------------------------------------------------------------------- Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio funzionale sostituzione-------------------------------------------------------------------------------------------------5) Aumentata Contatto 12 Eritrocitosi Hb Chesapeake affinità O2 C-terminale 92 Arg -> Leu 6) Diminuita Eme/12 Cianosi Hb Kansas affinità O2 102 Asn ->Thr
7) Ridotta produz. Mutazione Fenotipo Hb Constant catene C-terminale talassemico Spring (+31)
8) Ridotta prod. Ibrido di fusione Fenotipo Hb Lepore catene talassemico
AM-tbmadc 48
Drepanocitosi(anemia falciforme)
AM-tbmadc 49
Fenotipo anemia falciforme(anemia emolitica cronica + crisi vaso-occlusive)
• Periostite metacarpale piede-mano• Osteonecrosi della testa del femore• Infarto cerebrale• Sindrome acuta-toracica• Retinopatie• Epatopatie• Ipostenuria da lesione midollare renale• Ulcere malleolari• Sequestrazione splenica• Infezioni gravi da germi capsulati (pneumococco)
AM-tbmadc 50
Correlazione genotipo-fenotiponell’anemia falciforme
Genotipo al locus HbS/HbC HbS/-talassemia
Geni modificatori HbF (cromosoma X e 6) Aplotipi -globinici
Benin, Senegal, Bantù, Centro-Africa, Arabo-IndianoPolimorfismo C->T in -158 gG (HbF più elevata)
-talassemia