Post on 14-Feb-2019
Proteoma
Proteome = Proteins encoded by the genome
Il proteoma comprende tu9e le proteine espresse in una data cellula in un certo momento, incluse tu9e le isoforme della stessa proteina (splicing alterna=vo) e le loro modificazioni post-‐traduzionali.
Mentre il genoma è costante per una data cellula ed iden=co per tu9e le cellule di un organismo (~ 25.000 geni nell’uomo), il numero di proteine prodo9e è molto piu’ elevato (un fa9ore 10-‐100) in virtù del meccanismo , di splicing alterna=vo e delle modificazioni post-‐traduzionali. Inoltre, il proteoma è dinamico nel tempo e in risposta a fa9ori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi =pi cellulari.
Elettroforesi su gel
Metodo per separare macro-‐molecole (Proteine, DNA, RNA, etc.) sulla base delle loro proprieta’ chimico-‐fisiche quali:
(1) dimensioni (2) forma
(3) carica ele9rica
Elettroforesi di Proteine
• Piu’ complessa dell’ele9roforesi di DNA – Proteine diverse hanno cariche diverse – Le proteine variano molto per forma (stru9ura)
• Generalmente il gel e’ fa9o di poliacrilammide
Perche’ usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine?
• I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compa9a • I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio • Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA
– Amminoacido medio = 110 Da – Paio di nucleo=di medio = 649 Da
– 1 kilobase di DNA = 650 kDa – 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa
Ele9roforesi di proteine Condizioni Non Denaturan=
• Non-‐denaturante (na=vo): nessun pre-‐tra9amento delle proteine prima dell’ele9roforesi – Le proteine conservano la loro stru9ura 2° e 3°; pon= disolfuro etc. – Le proteine conservano la loro carica normale
– Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma
Nome Carica Massa Forma
Proteina Q
Proteina R
+3 30kD
-4 42kD
Ele9roforesi di proteine in condizioni denaturan=
• Le proteine sono tra9ate con SDS (detergente anionico) prima dell’ ele9roforesi (SDS-‐PAGE) – Le molecole di SDS si legano alle proteine – Le proteine perdono la loro normale forma – Le proteine hanno tu9e lo stesso rapporto carica/massa – Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro
dimensioni
SDS
Carica Massa
+3 30kD
-4 42kD
Carica Massa
-300 30kD
-420 42kD
SDS-‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-‐PAGE)
" SDS (Sodio Dodecil Solfato) Solubilizza e denatura le
proteine Aggiunge cariche
negative alle proteine
O S O
O
O
-
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
SDS
Come funziona un Gel SDS-‐PAGE ? • Le proteine cariche
nega=vamente si muovono verso l’ele9rodo posi=vo
• Proteine piu’ piccole si muovono piu’ velocemente
• Le proteine si separano per dimensione
s-s SDS, calore
Proteine con SDS
+
–
Proteasi
Estrazione delle proteine
Proteasi
Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF
Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) pH Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio)
Cosa c’e’ nel tampone di caricamento?
• Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8)
• SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica nega=va complessiva
• Glicerolo per rendere pesan= i campioni e farli scendere nei pozzee
• Un agente riducente (DTT o β-‐Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro
• Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni
SDS-‐PAGE: separazione di proteine in base al loro peso molecolare
In presenza di SDS e di un riducente dei legami disolfuro, le diverse proteine vengono separate in elettroforesi su gel esclusivamente sulla base di differenze di peso molecolare delle loro catene polipeptidiche.
Il Gel • Come funziona:
– Stacking gel: 4-‐5% gel superiore, pH 6.8 8-‐14% gel separatore, pH 8.8 – Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-‐acrilammide, formando una stru9ura a laece
– Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS
Il Gel Componen= del gel SDS-‐PAGE • Soluzione di Acrilammide/Bis-‐Acrilammide • Tris-‐HCl pH 6.8 oppure Tris-‐HCl pH 8.8 • SDS • ddH2O • TEMED • APS (ammonio persolfato) • Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)
Il Gel • Come funziona: – Proteine vengono caricate, viene
applicata una corrente ele9rica • Includere un marker di peso molecolare colorato
• 10-‐50ug di estra9o proteico totale • 0.1-‐1ug di proteina purificata
– Ioni Cloruro (-‐) / Proteina / Glicina (+)
– Si muovono verso il gel separartore (“resolving)
• Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, perme9endo alle proteine di migrare nel gel separatore
+
– Stacking pH 6,8
Resolving pH 8,8
Il Gel
• % di acrilammide consigliata
8% 10% 12%
• Dimensioni delle proteine
40-‐200 kDa 21-‐100 kDa 10-‐40 kDa
Visualizzazione delle proteine nel gel
I due metodi piu’ usati sono:
Colorazione con il Coomassie Brilliant
Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda)
Coomassie staining Silver staining
Southern Blot: Per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA).
Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. (sonda = DNA o RNA).
Western Blot: Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).
Cosa e’ un Western Blot? • Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante ele9roforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene iden=ficata mediante la sua reazione specifica con un an=corpo.
Qual e’ la proteina che mi interessa?
– SDS-‐PAGE (non certo) • Si basa sul confronto di peso molecolare
– Western blot (certo) • Si basa su una reazione specifica an=gene-‐an=corpo
A cosa serve il Western Blot?
+
–
?
Fasi di un Western Blot • Prima fase: ele,roforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel
in base alle loro dimensioni)
• Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una
membrana di nitrocellulosa mediante un campo ele9rico)
• Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non
specifiche tra l’an=corpo e la membrana)
Fasi di un Western Blot • Quarta fase: legame dell’an>corpo primario. (L’an=corpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla
membrana)
• Quinta fase: legame dell’an>corpo secondario. (L’an=corpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP),
riconosce specificamente l’an=corpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana)
• Sesta fase: rivelazione o “detec>on”. (L’enzima coniugato all’an=corpo secondario scinde un substrato
che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)
Le proteine nel gel sono ancora in soluzione – Le bande diffondono e si confondono col tempo
E’ necessaria l’immobilizzazione per: – Preservare in maniera permanente l’esperimento di ele9roforesi – Perme9ere il riconoscimento di proteine specifiche
La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana – Fa9a di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon – Si usa l’ele9roforesi, in un processo de9o ‘bloeng’
Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
• Ele9robloeng – Apparato di trasferimento – Il gel e’ messo tra stra= di carta da filtro con la membrana a dire9o conta9o col gel sul lato verso l’ele9rodo posi=vo
– Viene applicato un campo ele9rico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’ele9rodo posi=vo e si legano alla membrana
– Fa9o a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine
Western Blotting + -
-
+
SDS-PAGE
Assemble ‘sandwich’
Buffer-soaked filter papers
Gel
Nitrocellulose membrane
Wet blotting
Electrode
Buffer
Direction of transfer
Semi-dry blotting
Graphite Electrode Plates
Nitrocellulose with bound proteins
Stained (Red Ponceau)
Western blot: terza fase saturazione o “blocking”
• Per saturare i si= idrofobici liberi sulla membrana
• Per prevenire il legame dell’an=corpo primario alla membrana stessa
• La9e scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)
• L’an=corpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana
• An=corpi come sonde: – Molto sensibili
– Possono essere “prodoe” • Immunizzando una specie diversa (an=corpi policlonali)
• Generando an=corpi monoclonali (mAb)
– Economici
An=corpi
An=corpi (immunoglobuline, Ig)
Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico an=gene, come un ba9erio o un virus, che neutralizza l’an=gene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria.
An=corpi policlonali Produzione • Immunizzazione ripetuta dell’animale con l’an=gene (pep=de, proteina purificata o ricombinante)
• Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’an=corpo ed e’ purificato il siero
• Il “pool” degli an=corpi riconosce mol= epitopi dell’an=gene usato per l’immunizzazione
An=corpi monoclonali
Riconoscono solo un epitopo
Fusioni tra linfoci= B (milza/linfonodi) e cellule di mieloma di topo
An=corpi
• An=corpo primario – Riconosce la proteina
• An=corpo secondario – Lega l’an=corpo primario
– Generalmente prodo9o in una specie diversa
– Coniugato con un enzima
– Il substrato dell’enzima sara’ conver=to in un prodo9o colorato
– Puo’ anche essere radioaevo o fluorescente
• Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) – Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato
• Substra= Chemioluminescen= – Eme9ono luce se conver== dall’enzima – Possono essere visualizza= su lastre radiografiche
• Marcatura radioaeva • An=corpi secondarii bio=nila=
Western blot: sesta fase rivelazione o “detection”
HRP
Western blot HRP
substrato
luce
Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione
Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce
pg proteina
Le proteine possono essere modificate dopo la loro sintesi: modificazioni post-traduzionali
Fosforilazione Glicosilazione Ubiquitinazione etc…….
Tali modificazioni fanno variare il PM della proteina e, quindi, possono essere evidenziabili dopo elettroforesi e western blot
Danni al DNA
Checkpoints di risposta a danni
Trascrizione
Riparazione e ricombinazione del DNA Replicazione DNA
Ciclo cellulare
Apoptosi
•Molto conservati negli eucarioti: dal lievito all’uomo
•Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica e tumori
La risposta cellulare a danni al DNA
Proteine sensori Mec1, Tel1, Ddc2, Rad17, Mec3, Ddc1 Rad24,RFC
ATR, ATM, ATRIP, hRAD1, hHUS1, hRad9, hRAD17, RFC
Trasduttori Rad9, Rad53, Chk1 BRCA1?, CHK2, CHK1
Effettori RPA, Polα-primase, Cdc28, Swi6, Pds1, Cdc14, ...
RPA, p53, CDC25, CDK, ...
Lievito Uomo
Il checkpoint innescato da danni al DNA è una via di trasduzione dei segnali