PRODUZIONE DI PROTEINE DA GENI CLONATI IN PROCARIOTI

fermentatore

Vettori a cassetta

PRODUZIONE DI PROTEINE DA GENI CLONATI IN PROCARIOTI

Espressione di geni esogeni in procarioti

PRODUZIONE DI PROTEINE A PARTIRE DA GENI CLONATI

Riconosciuto dalla subunità sigma RNA pol E. coli

Sequenze promotore in procarioti e eucariotiriconosciute da RNA polimerasi specifiche

Monitoraggio della proteina esogena con possibili effetti dannosi sul procariote

Ceppo speciale di E. coli lisogeno per T7 (fago T7 integrato e alterato: gene per RNA pol T7 a valle del promotore lac, indotto dall’IPTG )

promotore tac: ibrido tra trp e lac

SVANTAGGI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI

- Non vengono rimossi eventuali introni

- Possibile formazione di strutture secondarie della porzione iniziale trascritto (fig)

- Possibile presenza di segnali di terminazione per il batterio (fig)

- Propensione per alcuni codoni (fig)

- Mancanza di modificazioni post-traduzionali (glicosilazioni, fosforilazioni, etc.)

- Limite della lunghezza amminoacidica

- Mancato ripiegamento della struttura terziaria e sovraespressione determinano i corpi di inclusione

Formazione di strutture secondarie all’inizio del trascritto quali possibili conseguenze per inserimento sequenza esogena

Vettori a cassetta per la fusione di geni in E. coli

Vantaggi di una proteina di fusione in frame:- presenza seq. nucleotidica di E. coli per legame ribosoma- peptide batterico iniziale stabilizzante- peptide batterico iniziale da utilizzare come segnale localizzazione cellulare (esportata nel mezzo di coltura o tra membrana esterna ed interna

Fusione con parte iniziale di gene batterico

Aumento resa e solubilità proteina eterologa

Fusione con la proteina di E. coli Glutatione-S-transferasi (GST) e purificazione con cromatografia per affinità al substrato (glutatione)

Vettore:componente N-terminale della GST,componente C-terminale proteinada purificare.Promotore Lac inducibile

Glutatione: tripeptide (cisteina, glicina, ac. glutammico)

libero

Rimozione della proteina di fusione

es: con bromuro di cianogeno (se alla giunzione c’è metionina), con trombina (taglia adiacente a residui di arginina). Non deve essere tagliata all’interno la proteina di interesse!

Proteina priva di struttura terziaria precipita e forma corpi di inclusione.Aggregati recuperati in forti condizioni denaturanti che non permettonocorretto ripiegamento in vitro della proteina che quindi sarà inattiva!

Screening cloni batterici trasformati con vettori di espressione

Screening cloni batterici trasformati con vettori di espressione

Produzione di proteina

- studi biochimici e funzionali, cristallografici

- produzione anticorpi specifici

SVANTAGGI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI

- Non vengono rimossi eventuali introni

- Possibile formazione di strutture secondarie della porzione iniziale del trascritto

- Possibile presenza di segnali di terminazione per il batterio

- Propensione per alcuni codoni

Mancanza di modificazioni post-traduzionali (ponti disolfuro, glicosilazioni, fosforilazioni, acetilazione, carbossilazione, etc.)

- Limite della lunghezza amminoacidica

- Mancato ripiegamento della struttura terziaria e sovraespressione determinano i corpi di inclusione

PRODUZIONE INDUSTRIALE DI PROTEINE DA COLTURE DI CELLULE EUCARIOTICHE (LIEVITI E FUNGHI)

COMPOSTO MICRORGANISMO

AntibioticiPenicilline Penicillium spp. Cefalosporine Cephalosporium sppCloramfenicolo, streptomicina Streptomyces spp.

EnzimiProteasi, amilasi Bacillus ssp. (batterio), Aspergillus

spp.

Alcool S. cerevisiaeAceto S. cerevisiae ac. AceticoAcetone Clostridium ssp.

BIOTECNOLOGIE: USO DEI PROCESSI BIOLOGICI NELL’INDUSTRIA E NELLA TECNOLOGIA

VETTORI DI CLONAGGIO PER GLI EUCARIOTI

Lieviti e funghi filamentosi: produzione di proteine eterologhe anche a scopi biotecnologici con sintesi di prodotti medicinali o alimentari

Saccharomyces cerevisiae

Fungo unicellulare

Ruolo fondamentale per produzione di birra e pane

Vantaggi: conoscenza genetica e biochimica, facilità di coltura, alta resa

Possibile utilizzo per clonaggio del plasmide naturale 2 µm

Svantaggi: iperglicosilazione, difficoltà di secrezione delle proteine prodotte nel terreno di coltura, propensione per un codone

Galattosio epimerasi

PROMOTORI UTILIZZATI IN VETTORI DI ESPRESSIONE PER EUCARIOTI MICROBICI

Esempio di glicosilazione dell’asparagina.L’iperglicosilazione di alcuni funghi può provocare reazione antigenica se la proteinaè iniettata

Saccharomyces cerevisiae

2 µm:plasmide naturale 6,3 kb,tra 70-200 copierisiede nel nucleo,si replica autonomamente,segrega sia in meiosiche in mitosi

REP1 e REP2 (per replicazione)FLP (proteina che riconosce siti specifici nel DNA del lievito: integrazione per ricombinazione )OriD = funzione ignota

Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp

Procedura- clonaggio in seq. di pBR322-selezione dei ricombinanti in E. coli (resistenze antibiotici)- inserimento in lievito e selezione (LEU2)

Saccharomyces cerevisiae

Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp

Saccharomyces cerevisiae

Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp

Solo una copia di LEU2funziona

Solo occasionalmente si integraRicombinazione omologa tra geni LEU 2

Saccharomyces cerevisiae

Plasmide integrativo di lievito: YIp = plasmidi batterici (pBR322) con resistenza antibiotici per selezione in batteri + URA3 (gene di lievito per la selezione)

Saccharomyces cerevisiae

Non contiene i geni di 2 µm (REP e ori) e non si può replicare se non si integra nel DNA dei cromosomi di lievito, stesso meccanismo di YEp

Saccharomyces cerevisiae

Criteri di scelta: efficienza di trasformazione, numero di copie, stabilità

YIp: ideale per stabilità in coltura a lungo termine

Saccharomyces cerevisiae

Caratteristiche del clonaggio in YEp:- Frequenza di trasformazione molto alta: da 10000 a 100000 cellule trasformate per microgrammo di DNA plasmidico- Alto numero di copie: tra 20 e 50 per cellula- Svantaggi: nel processo di gemmazione spesso copie YEp non segregano nella cellula figlia

QUINDI ALTA PRODUZIONE PROTEINA DEL GENE CLONATO MA INSTABILITA’ DELLA TRASFORMAZIONE

Caratteristiche del clonaggio in YIp:-Frequenza di trasformazione bassa: 1000 cellule trasformate per microgrammo di DNA plasmidico per bassa efficienza di integrazione cromosomica- E’ presente in una sola copia per cellula

QUINDI BASSA PRODUZIONE PROTEINA DEL GENE CLONATO MA GRANDE STABILITA’ DELLA TRASFORMAZIONE PER LUNGHI PERIODI

DI COLTURA