STRUTTURE O PROCESSI CARATTERISTICI DEI PROCARIOTI, RAPPRESENTANO BUONI BERSAGLI PER GLI ANTIBIOTICI

Sintesi proteica (Ribosomi differenti)

Membrane

Replicazione e ”repair” del DNA

(enzimi diversi)

parete batterica (solo procarioti)

Processo di trascrizione (RNA polimerasi diversa)

Sintesi dei folati (assente nei mammiferi)

Antibiotici beta-lattamici e antibiotici glicopeptidici bloccano la sintesi del peptidoglicano

NAG

NAM

D-A

DAP

NAG

NAM

D-A

DAP

NAG

NAM

D-A

DAP

D-A D-A

PBP

ANTIBIOTICI BETA-LATTAMICI prodotti da funghi (penicilline e cefalosporine) e da batteri

(carbapenemi) o di sintesi (monobattami)

IL LORO BERSAGLIO E’ L’ENZIMA (PBP che operano transpeptidazione e transglicosilazione per la sintesi del peptidoglicano)

Agiscono come pseudosubstrato per le PBP legandosi covalentemente al sito attivo e acilandolo

Le PBPs si deacilano con estrema lentezza e risultano quindi inattivate

Il substrato non è più disponibile per l’azione delle PBP

ANTIBIOTICI GLICOPEPTIDICI (gruppo della vancomicina): IL BERSAGLIO E’ IL SUBSTRATO

Gli antibiotici glicopeptidici sono un gruppo vasto (es.Vancomicina prodotta da una specie di Amycolatopsis-batterio Gram +)

si legano al dipeptide D-Ala - D-Ala e lo mascherano

Si legano alla topoisomerasi-II

E impediscono che il DNA venga rilegato

I CHINOLONI (di sintesi) BLOCCANO LA DUPLICAZIONE DEL CROMOSOMA BATTERICO:

Nella cellula si accumulano frammenti di DNA

σ

“Core enzima”

Le RIFAMICINE prodotte da una specie di Amycolatopsis

si legano alla subunità beta delle RNA-polimerasi batteriche

E impediscono la trascrizione genica, perché la RNA polimerasi non può più legarsi al DNA da copiare

I RIBOSOMI (LA SINTESI PROTEICA) SONO BERSAGLIO DI MOLTI ANTIBIOTICI

le tetracicline si legano alla subunita’ 30s deformando il sito “A” e impediscono l’alloggiamento degli

AA-tRNA

P A E

30S TETRACICLINE

Le tetracicline naturali sono prodotte da Streptomiceti, ne sono state anche create

molte semisintetiche

QUANDO LA SINTESI E’ GIA’ INIZIATA

vengono quindi sintetizzate proteine con mutazioni che possono renderle non funzionali

Gli aminoglicosidi, legandosi al 30S, Rendono permissivo il sito “A” che accoglie AA-tRNA non corrispondenti ai codoni del mRNA

GLI AMINOGLICOSIDI (prodotti da batteri Gram+ di diversi generi del gruppo degli attinomiceti)

SI LEGANO ALLA SUBUNITA’ 30S “BLOCCANDO” IL COMPLESSO DI INIZIO

e impediscono il legame con la subunità 50S e la lettura del messaggero

CLORAMFENICOLO, MACROLIDI E LINCOSAMIDI (da streptomiceti)

Competono per il medesimo sito di legame sulla subunità 50S

30S

50S

Macrolidi e lincosamidi possono anche fermare lo scorrimento del ribosoma sul messaggero

F-Met

A1

30S Cl

oram

fenico

lo

Mac

rolid

i Linc

osam

idi

Interferiscono con l’azione della peptidil-transferasi bloccando l’allungamento della catena

Gli involucri esterni sono critici nei batteri

La membrana esterna, tipica dei batteri Gram-negativi, delimita la cellula batterica impedendo l’accesso a molti composti

La membrana interna è vitale per la produzione di energia e il trasporto dei nutrienti

A basse dosi la POLIMIXINA (prodotta da una specie di Bacillus)

Disorganizza la membrana esterna

sensibilizzando la cellula batterica a componenti del siero o altri antibiotici

Mentre a dosi elevate

Provoca il collasso della membrana interna e la morte della cellula batterica

A differenza di noi, i batteri sintetizzano acido folico

acido folico

Sintesi DNA-RNA

Sintesi proteine PABA

acido folico Sintesi DNA-RNA

Sintesi proteine Sulfamidico

I sulfamidici (di sintesi) interferiscono con la biosintesi di acido folico dal PABA

Trimethoprim

Sintesi DNA-RNA

Sintesi proteine PABA

Il Trimethoprim (di sintesi) sostituisce l’acido folico e blocca le vie biosintetiche a valle

I BATTERI POSSONO DIVENTARE RESISTENTI

MECCANISMI BIOCHIMICI

FENOMENI BIOLOGICI

Enzimi Farmaci inattivati

β-lattamasi β-lattamici

Acetil-transferasi

Fosfo-transferasi Aminoglicosidi

Adenil-transferasi

Acetil-transferasi Cloramfenicolo

ENZIMI INATTIVANTI

Le β-lattamasi secrete nello spazio periplasmico, inattivano le penicilline e le cefalosporine prima che si leghino alle PBP

R H CH3

N

S

CH3 COO- O

β-lattamico

β-lattamasi Acido penicilloico (inattivo)

HN

R H CH3 S CH3 COO-

O O

TPasi TGasi TPasi TGasi

GLI ENZIMI DI MODIFICAZIONE NON DISTRUGGONO LA MOLECOLA

MA LA RENDONO INSERVIBILE

ENZIMI INATTIVANTI GLI AMINOGLICOSIDI

PREVENGONO IL LEGAME DELL’ANTIBIOTICO AL RIBOSOMA

Enzimi batterici in grado di:

HO

O

HO

N-acetilare

O

HN

2-O3P O-fosforilare

AMP-O

O-adenilare

per questo motivo molti enzimi sono inducibili

prodotti solo quando la loro attivita’ si rende davvero necessaria

molti degli enzimi che modificano gli antibiotici sono codificati da geni la cui espressione è regolata

i microrganismi non sprecano mai energia

Perché la resistenza si manifesti è necessario che un antibiotico β-lattamico induca la trascrizione del gene e

sia allo stesso tempo un substrato per il prodotto

La produzione di AmpC è inducibile

Tutti i ceppi di P. aeruginosa hanno nel cromosoma un gene (ampC ) che codifica una β-lattamasi (AmpC)

Pseudomonas aeruginosa

Spazio periplasmico

cromosoma

Ampicillina Cefalosporine

Carbapenemi

Carbenicillina Piperacillina Ceftazidime

In un sistema “in vitro” AmpC

DA QUESTI DATI, CI SI ASPETTEREBBE SENSIBILITA’ SOLO NEI CONFRONTI DEI

CARBAPENEMI

Ampicillina Cefalosporine Carbapenemi

Carbenicillina Piperacillina Ceftazidime

ma “in vivo”...

Sono riconosciuti come induttori e degradati da

AmpC

Sarebbero degradati da AmpC che però non viene

prodotta perché queste molecole NON sono

riconosciute come induttori

Sono riconosciuti come induttori, AmpC

È prodotta ma è inefficace su queste molecole

MODIFICAZIONI DEL BERSAGLIO

IL BERSAGLIO PUO’ ESSERE ASSENTE

I MICOPLASMI, CHE NON HANNO PARETE, SONO INTRINSECAMENTE RESISTENTI AI β-LATTAMICI

σ “Core enzima”

RESISTENZA INTRINSECA ALLE RIFAMICINE NEI MICOPLASMI

IL BERSAGLIO PUO’ ESSERE NATURALMENTE INSENSIBILE

RESISTENZA INTRINSECA ALLE CEFALOSPORINE NEGLI ENTEROCOCCHI

Le PBP degli enterococchi sono strutturate in modo da non essere legate dalle CEFALOSPORINE

IL BERSAGLIO PUO’ MODIFICARSI PER MUTAZIONE *

Gene Bersaglio modificato Resistenza acquisita a:

gyrA DNA girasi (sub.A) Chinoloni

parC Topoisomerasi IV

Chinoloni

rpoB RNA polimerasi (sub β) Rifampicina

IL BERSAGLIO PUO’ VENIRE MODIFICATO BIOCHIMICAMENTE

Alcuni microrganismi metilano il proprio rRNA , rendendolo così meno affine nei confronti di Macrolidi e Lincosamidi

CH3

Sintetizzano un dipeptide D-alanil-D-lattato

I ceppi VRE (Vancomycin-Resistant-Enterococci)

Eliminando le normali terminazioni D-ala-D-ala

I nuovi dipeptidi non sono riconosciuti dalla vancomicina

UN’ALTRA PROTEZIONE DEL RIBOSOMA PUO’ ESSERE OTTENUTA GRAZIE A UN INGOMBRO STERICO

In un altro caso il ribosoma viene protetto da una proteina, Che lo rende inaccessibile alle tetracicline

UN’ALTRA POSSIBILITÀ È QUELLA DI ALLONTANARE L’ANTIBIOTICO PRIMA CHE FACCIA DANNI

E’ quello che i microrganismi ottengono con le pompe di efflusso

I batteri sintetizzano proteine che hanno la funzione di espellere attivamente la

molecola di antibiotico..

LE POMPE DI EFFLUSSO TRANSMEMBRANA

Le pompe di efflusso impediscono alla concentrazione intracellulare

di risultare efficace

Perché un antibiotico sia efficace, la sua concentrazione all’interno della cellula batterica deve essere sufficiente a inattivare il bersaglio

ESISTONO DIVERSI TIPI DI POMPE DI EFFLUSSO

Membrana plasmatica

Citoplasma

Chinoloni (streptococchi)

Alcune sono specifiche..

Tetracicline (Gram+ e Gram-)

..altre non lo sono (Sistemi di efflusso multidrug)

Macrolidi (streptococchi stafilococchi)

Disinfettanti e Intercalanti

(Gram+ e Gram-)

IMPEDIRE ALL’ANTIBIOTICO DI RAGGIUNGERE IL BERSAGLIO E’ UN’ALTRA STRATEGIA POSSIBILE

IMPERMEABILITA’ DELLA PARETE

Resistenza intrinseca ai GLICOPEPTIDI nei batteri Gram-negativi

Resistenza intrinseca ai MACROLIDI in molti batteri Gram-negativi

Resistenza intrinseca a molti farmaci nei micobatteri

L’impermeabilita’ della parete puo’ anche essere dovuta ad una mutazione

carbapenemi

In seguito a mutazione la cellula può perdere la capacità di produrre la porina D2

Resistenza acquisita ai carbapenemi

Pseudomonas aeruginosa

La porina D2 rappresenta il canale di ingresso per i carbapenemi

carbapenemi ? ? ?

I VACCINI

PROCESSO DI IMMUNIZZAZIONE ATTIVA

L’OSPITE PRODUCE ANTICORPI CONTRO L’ANTIGENE SOMMINISTRATO

PREVENZIONE DELL’INFEZIONE A SEGUITO DI SUCCESSIVE ESPOSIZIONI ALL’AGENTE PATOGENO OGGETTO DELLA VACCINAZIONE

I SIERI IMMUNI:

PROCESSO DI IMMUNIZZAZIONE PASSIVA: SOMMINISTRAZIONE DI ANTICORPI PREFORMATI

1) Vaccini interi uccisi: influenza, Salk, epatite A, rabbia, pertosse intero

2) Vaccini vivi attenuati: BCG, MPR, Sabin, febbre gialla, varicella, Ty21a

3) Vaccini con componenti purificati: influenza a sub-unità o split, pertosse acellulare, anatossina difterica e tetanica, vaccini coniugati (Hib, pneumococco e meningococco)

6) Vaccini DNA ricombinanti: es. HBsAg

7) Vaccini a DNA: contro tutti gli agenti infettivi; non ancora in commercio

8) Vaccini da piante, geneticamente modificate

5) Reverse vaccinology: studio del genoma, individuazione dei possibili antigeni meningococco gruppo B

4) Vaccini coniugati (Haemophilus influenzae tipo b, meningococco, pneumococco): polisaccaridi coniugati con proteine carrier che li rendono maggiormente immunogeni e aumentano il coinvolgimento dei linfociti T

TECNICHE TRADIZIONALI

amplificazione su animali

rabbia

vaiolo

amplificazione su uova (es. Virus influenzale) e inattivazione

Colture batteriche inattivate

Non tutti i patogeni possono essere coltivati Problemi di sicurezza per il personale di laboratorio Costi elevati Attenuazione insufficiente Ritorno allo stato infettivo Necessità di conservazione in luoghi refrigerati Non disponibile per tutti i patogeni

LIMITI DEI VACCINI TRADIZIONALI

VACCINI RICOMBINANTI A SUB-UNITA’

Clonazione in batteri o lieviti del gene che codifica l’immunogeno più rappresentato

Antibatterici: proteine di adesione o

tossine modificate

Antivirali: una proteina del capside o dell’envelope

PURIFICAZIONE

es.: HBsAg ANTIGENE DELL’ENVELOPE DI HBV

Ottenuto in lievito

HBsAg ANTIGENE DELL’ENVELOPE DI HBV

L’antigene prodotto dal lievito presenta tutte le caratteristiche della proteina HBsAg nativa

Proteina di superficie HBs

E’ la molecola di scelta per allestire il vaccino clonandola nell’ospite SACCHAROMYCES

NON si usano virus o batteri interi, ma solo componenti

Vantaggi: non si somministrano altre molecole del patogeno

Svantaggi: La proteina manterrà la conformazione naturale? costi

VACCINI ATTIVI RICOMBINANTI OMOLOGHI: mutanti di specie patogene (delezione/mutazione dei geni di virulenza)

Allo studio:

Vibrio Cholerae : Il vaccino disponibile è a base di batteri uccisi col fenolo e l’immunità non dura più di 3-6- mesi

Virus Erpetico dopo delezione del gene TK che ne causa la virulenza

Es: Produzione di PTX inattiva da parte di B.pertussis

Vantaggio: la delezione dei geni di virulenza non permette la reversione allo stato virulento

Più efficaci dei vaccini uccisi e di quelli a subunità (proteine)

VACCINI ATTIVI RICOMBINANTI ETEROLOGHI: clonazione in virus o batteri, geneticamente modificati usati come vettori

VIRUS

Es virus del vaiolo bovino: vettore per vaccini ricombinanti, tra cui alcuni sperimentali anti-HIV

Diversi antigeni sono stati inseriti nel genoma del virus del vaccino:

Un vaccino ricombinante per la rabbia nel virus vaccinale, è in grado di immunizzare le volpi che sono i principali portatori della malattia

Proteina G (virus della rabbia) Antigene superficiale di HBV proteine NP e HA del virus influenzale

Il vaccinia virus si replica direttamente nel citoplasma, non è patogeno e il suo genoma è stato sequenziato

Queste caratteristiche ne fanno un buon candidato per portare determinanti antigenici di patogeni

MUTANTI DI BATTERI INVASIVI

Mutanti di Salmonella enterica sono stati usati per lo sviluppo di un nuovo vaccino anti-HBV

Anche batteri non invasivi ma del tutto sicuri (LAB) sono stati studiati come vettori

VACCINI A DNA

Lo scopo di un vaccino a DNA è promuovere la sintesi dell’antigene direttamente all’interno di una cellula

Mimando quello che succede nelle infezioni virali

Le cellule Dendritiche sono critiche in questo processo

vaccini uccisi o attenuati: gli antigeni penetrano dall’esterno

E i loro frammenti sono presentati su MHC-II

Seguono la via endolisosomiale; sono degradati

II

l’informazione inserita direttamente nella cellula, invece

L’antigene è prodotto nel citoplasma e segue due vie:

E’ tagliato e presentato su MHC-I

Attiva i CD8

CD8

Raggiunge il nucleo

È trascritta

Esce dalla cellula I

S.I. come i vaccini tradizionali

La forma di rilascio nella cellula è su di un plasmide

Il gene deve essere sotto un promotore eucariotico

La somministrazione può avvenire per via

INTRAMUSCOLARE INTRADERMICA

Queste vie di somministrazione hanno l’effetto di incrementare l’intercettazione dell’antigene da parte delle cellule dendritiche

Gene gun

INTRADERMICA

Inoculazione seguita da un trattamento con il laser

Il trattamento con il Laser aumenta il tasso di ingresso nelle cellule dendritiche

Particelle d’oro ricoperte di DNA

Cartuccia per le

particelle

Canale di accelerazion

e

ELIO

Porta-cartucce

Il “Gene gun” è un dispostivo che spara particelle d’oro ricoperte con l’antigene

Le particelle entrano così in contatto direttamente con DC immature situate subito sotto la pelle (cellule di Langerhans)

All’interno di microparticelle

INOCULAZIONE INTRAMUSCOLARE

seguita da un trattamento di elettroporazione

Le particelle favoriscono l’uptake

Il trattamento di elettroporazione aumenta la permeabilità delle DC al vaccino

come DNA nudo

E’ STATO ANCHE PROPOSTO UN RILASCIO ALTERNATIVO AI PLASMIDI

CLONARE IL GENE NEL GENOMA DI UN BATTERIOFAGO

INOCULARE IL FAGO PURIFICATO

LE CELLULE APC CATTURANO IL BATTERIOFAGO

IL CAPSIDE E’ DEGRADATO

L’INFORMAZIONE E’ RILASCIATA NEL CITOPLASMA..

AMPLIFICARE IL FAGO

I VANTAGGI DEI VACCINI A DNA SONO MOLTI

STABILITA’

PRODUZIONE SEMPLICE ED ECONOMICA

FACILITA’ DI MANIPOLAZIONE

DELL’ANTIGENE (SEGUIRE LE MUTAZIONI DEL PATOGENO)

SINTESI PROTEICA DIRETTA DA PARTE DELL’OSPITE

STIMOLAZIONE PROLUNGATA DEL S.I.

LE PREVISIONI SUL FUTURO DEI VACCINI:

Uccisi

A subunità

Immunoterapia

a DNA

Per mezzo di vettori che non si replicano

Attenuati

Attraverso “reverse vaccinology”

prime boost (vaccino a DNA +

richiamo successivo con antigene proteico o

microrganismo inattivato)

Mucosale

2000 2020