Post on 22-Jan-2016
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Sintesi di nuovi liquidi ionici e Sintesi di nuovi liquidi ionici e studio degli effetti su alcune studio degli effetti su alcune attività enzimatiche di cellule attività enzimatiche di cellule
in colturain coltura
Presentato da:
Danilo Malferrari
Relatore:
Dott.ssa Paola Galletti
Correlatore:
Prof. Giorgio Sartor
Anno Accademico 2006/2007
•Direttiva VOC 1999/13/EC - Regolamento REACH
Anastas, P.; Warner, C.; Green Chem.; 1998Anastas, P.; Warner, C.; Green Chem.; 1998
I solventi nell’industria chimicaI solventi nell’industria chimica
Necessità dell’abbandono o diminuzione nell’uso di solventiNecessità dell’abbandono o diminuzione nell’uso di solventi
Refinery
bulk chemicals
fine chemicals
pharmaceuticals
Production tons / yearProduction tons / year
101077
101055
101033
101022
Roger A. Sheldon, 2007Roger A. Sheldon, 2007
E-FactorE-Factor0.10.155
5050100100
Prevenzione
Solventi e prodotti ausiliari più sicuri
Reazioni chimiche meno pericolose
È meglio prevenire l’inquinamento piuttosto che intervenire per ridurlo dopo che lo si è prodotto
Quando possibile, la sintesi dei prodotti chimici deve essere progettata in modo da utilizzare e generare sostanze non
tossiche o poco tossiche per l’uomo e per l’ambiente
L’uso di sostanze ausiliarie (solventi, agenti di separazione) dovrebbe diventare non necessario o almeno innocuo
Principi della green chemistry
I liquidi ionici – Solventi alternativiI liquidi ionici – Solventi alternativi
• Non infiammabili, non esplosivi
• Non volatili
• Alta miscibilità con i gas: CO2, H2
• Riciclabili, reazioni selettive
N+
R
N+
NR CH3
N+
CH3
CH3
CH3
CH3
P+
CH3CH3
CH3
CH3
Cationi comuni
N-alchil-piridinio 1-alchil-3-metil-imidazolio tetra-alchil-ammonio tetra-alchil-fosfonio
Anioni comuni
immiscibili in acqua miscibili in acqua
PF6- BF4
- Cl-
NO3-N(SO2CF3)2
-
CF3SO3- CF3SO2
-
CH3CO2-
Paul Walden - 1913
Etilammonio nitrato
N+
CH3
HHHNO3
-
• [MOEMIM][BF4] meno tossico rispetto al [BMIM][BF4] di 2 ordini di grandezza
• La presenza di ossigeni nella catena laterale ne diminuisce l’idrofobicità
• L’inserzione di funzioni ossigenate nelle catene laterali diminuisce la tossicità del liquido ionico?
Samorì C., Pasteris A., Galletti P., Tagliavini E., Environ. Toxicol. Chem., 2007
Scopo tesiScopo tesi
N+
NCH3
CH3
B-
F
F F
F
[BMIM][BF4]
N+
NCH3
O
CH3
B-
F
F F
F
[MOEMIM][BF4]
N+
N
CH3
CH3
N+
N
O
CH3
CH3N
+N
CH3
O
CH3
N+
NCH3
O
CH3
2 3
[BMIM][BF4] [MOEMIM][BF4] [MOE2MIM][BF4] [MOE3MIM][BF4]
ANALISI STRUTTURA ANALISI STRUTTURA CHIMICACHIMICA
SAR / QSARSAR / QSAR
SINTESI SINTESI
STRUTTURA CHIMICASTRUTTURA CHIMICA
APPLICAZIONE SALUTE UMANA AMBIENTE
ASPETTI ECONOMICI
VALENZA SOCIALE IMPATTO ECOLOGICO
DATI TOSSICOLOGICI -
ECOTOSSICOLOGICI
VALUTAZIONE
La sintesiLa sintesi
N NCH3
+R1
X
N
CH3
+R1
X
N
+R1
X
N N+CH3 R1
+ M+ Y-
N+
CH3R1
+ M+ Y-
+ M+ Y-
N+
R1
-M+
-M+
-M+
X-
X-
X-
X-
X-
X-
N N+
CH3 R1
N+
CH3R1
N+
R1
Y-
Y-
Y-
I Liquidi ionici I Liquidi ionici sintetizzatisintetizzati
N+
CH3
CH3
N+
CH3
O
CH3
N+
CH3
O
CH3
OTs-
Cl-
Cl- , Br-
n
2
N+
CH3
N+
OCH3
N+
OCH3
OTs-
Cl-
Br-Cl- ,
n
2
N+
NCH3
CH3
N+
NCH3
O
CH3
N+
NCH3
O
CH3
n
n= 2,3
B-
F
F F
F
B-
F
F F
F
B-
F
F F
F
N(CN)2
N(CN)2
n
N(CN)2
Test biologiciTest biologici
Qualità dell’analisi QSAR
Livello di organizzazione biologico
Membrane modelloMembrane modello
N
N
N
N+
N
S
CH3
CH3Br
-
MTT-testMTT-test
Lattato deidrogenasiLattato deidrogenasi
Inibizione acetilcolinesterasiInibizione acetilcolinesterasi
Saggio di vitalità cellulare MTT-testSaggio di vitalità cellulare MTT-test
PC12Vitalità cellulare (16h)
[BMIM][BF4] (mM)
0 10 20 30
AB
S (
% c
on
tro
llo)
0
20
40
60
80
100
120
NN
N NH
N
S
CH3
CH3
N
N
N
N+
N
S
CH3
CH3
N+
NCH3
CH3
B-
F
F F
F
BMIM BF4
EC50 [mM]
Errore standard
MTT-test (16 h)
1,20 0,05
I dati sono il risultato di 3 esperimenti distinti in cui ogni concentrazione è stata replicata 4 volte.
Saggio di vitalità cellulare MTT-testSaggio di vitalità cellulare MTT-test
Vitalità cellulare (16 h)
Ctr
l
[BM
IM][
BF4
]
[BM
IM][
NC
N2]
[MO
EM
IM][
NC
N2]
[MO
E2M
IM][
NC
N2]
[MO
E3M
IM][
NC
N2]
Ab
s (
% c
trl)
0
20
40
60
80
100
120
NN
N NH
N
S
CH3
CH3
N
N
N
N+
N
S
CH3
CH3
In entrambe le serie si identificano delle differenze significative tra [BMIM][BF4]
e liquidi ionici con 1 e 2 funzionalità etossi.
Vitalità cellulare(16 h)
Ctr
l
[BM
IM][
BF4
]
[MO
EM
IM][
BF4
]
[MO
E2M
IM][
BF4
]
[MO
E3M
IM][
BF4
]
AB
S (
% C
trl )
0
20
40
60
80
100
120
PC12Attività AChE (16h)
[BMIM][BF4] (mM)
0 2 4 6 8 10 12
Attiv
ità
(n
mo
l/m
g*m
in)
2
3
4
5
6
7
8
9
Inibizione dell’acetilcolinesterasiInibizione dell’acetilcolinesterasi
EC50 [mM]
Errore standard
Acetilcolinesterasi
(16 h)4,80 0,32
N+
NCH3
CH3
B-
F
F F
F
BMIM BF4
I dati sono il risultato di 3 esperimenti distinti in cui ogni concentrazione è stata replicata 4 volte.
Inibizione dell’acetilcolinesterasiInibizione dell’acetilcolinesterasi
Si osserva un andamento differente nell’attività dell’enzima per le due famiglie di anioni.
Non vi sono differenze significative tra i liquidi ionici con catene etossilate e polietossilate.
Attività AChE (16 h)
[BM
IM][
BF4
]
[MO
EM
IM][
BF4
]
[MO
E2
MIM
][B
F4
]
[MO
E3
MIM
][B
F4
]
Att
ivit
à (
% c
trl)
0
20
40
60
80
100
Attività AChE (16 h)
[BM
IM][
BF4]
[BM
IM][
N(C
N)2
]
[MO
EM
IM[N
(CN
)2]
[MO
E2
MIM
][N
(CN
)2]
[MO
E3
MIM
][N
(CN
)2]
Att
ivit
à (
% c
trl)
0
20
40
60
80
100
Stabilità membrane cellulari –Stabilità membrane cellulari –
lattato deidrogenasilattato deidrogenasi
PC12Stabilità membrane cellulari (16h)
[BMIM][BF4] (mM)
0 2 4 6
% L
DH
rila
scia
to
0
10
20
30
40
50
60
EC50 [mM]
Errore standard
LattatoDeidrogenasi
(16 h)1,66 0,22
N+
NCH3
CH3
B-
F
F F
F
BMIM BF4
I dati sono il risultato di 3 esperimenti distinti in cui ogni concentrazione è stata replicata 4 volte.
Stabilità membrane cellulari –Stabilità membrane cellulari –
lattato deidrogenasilattato deidrogenasi
PC12Stabilità membrane cellulari (16 h)
Ctr
l
[BM
IM][
BF4]
[BM
IM][
N(C
N)2
]
[MO
EM
IM][
N(C
N)2
]
[MO
E2M
IM][
N(C
N)2
]
[MO
E3M
IM][
N(C
N)2
]
% L
DH
rilascia
to
0
2
4
6
8
Diminuzione dell’LDH rilasciato per liquidi ionici contenenti fino a due atomi di ossigeno nella catena laterale.
Si osservano differenze significative tra [BMIM][BF4] e [BMIM][N(CN)2].
PC12Stabilità membrane cellulari (16h)
Ctr
l
[BM
IM][
BF4
]
[MO
EM
IM][
BF4
]
[MO
E2
MIM
][B
F4]
[MO
E3
MIM
][B
F4]
% L
DH
rilascia
to
0
2
4
6
8
Tendenza generaleTendenza generale
N+
NCH3
CH3
N+
NCH3
O
CH3 N+
NCH3
O
CH3
3
A-
A-
A-
N+
NCH3
O
CH3
2
A-
Nel test di inibizione dell’acetilcolinesterasi si osservano delle differenze tra anioni ed un allontanamento dalla tendenza generale
Non si osservano differenze significative nei liquidi ionici dipendentemente dall’allungamento della catena
Anisotropia di fluorescenza tramite DPHAnisotropia di fluorescenza tramite DPH
NNH
NNH
NNH
Qual è l’effetto dei liquidi ionici sull’anisotropia di fluorescenza?
Si possono identificare delle variazioni nella fluidità di membrana nella serie di liquidi ionici con catene polietossilate?
DPH
1,6-DIFENILESATRIENE
Anisotropia di fluorescenza di DPH in presenza di Anisotropia di fluorescenza di DPH in presenza di [BMIM][BF[BMIM][BF44]]
Temperature [° C]
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
DP
H F
luor
esce
nce
anis
otro
py
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
none4mM 50mM 500mM 2000mM
Temperature [°C]
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
DP
H F
luor
esce
nce
anis
otro
py
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
none4 mM 50 mM 500 mM 2000 mM
N+
NCH3
CH3
B-
F
F F
F
BMIM BF4
Anisotropia di fluorescenza con [MOEAnisotropia di fluorescenza con [MOE22MIM][N(CN)MIM][N(CN)22]]
Temperature [° C]
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
DP
H F
luor
esce
nce
anis
otro
py
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
none4mM 50mM 500mM 2000mM
N+
NCH3
O
O CH3
MOE2MIM N(CN)2
N(CN)2
Variazione dell’andamento dell’anisotropia per molarità superiori a 500 mM
Fluorescenza - Proprietà spettrali del [BMIM][BFFluorescenza - Proprietà spettrali del [BMIM][BF44]]
4
6
8
10
12
14
16
260265
270275
280285
290295
300380
400420
440460
480500
Fluore
scence
inte
nsi
ty (
a.
u.)
Excitation Wavelength (nm)
Emission Wavelength (nm)
[BMIM][BF4] 0.10 M in H2O
100
200
300
400
260265
270275
280285
290295
300360
380400
420440
460480
500
Fluore
scence
inte
nsi
ty (
a.
u.)
Excitation Wavelength (nm)
Emission Wavelength (nm)
[BMIM][BF4] 0.10 M in CH3CN
Massimi di emissione a 415 e 427 nm con eccitazione a 260 nm
•Si osserva un andamento generale per il test di vitalità MTT-test e il test di integrità di membrana
•Vi è una diminuzione della tossicità introducendo delle funzioni etossi nella struttura, ma la tendenza si inverte in presenza di tre atomi di ossigeno
•Non si evidenziano differenze sistematiche tra i tipi di anioni impiegati
ConclusioniConclusioni
•La purezza dei liquidi ionici è fondamentale per un utilizzo nei test biologici
•Sono necessari passaggi sintetici che migliorino la sostenibilità del processo, diminuendo l’uso di solventi nelle fasi di purificazione
•I liquidi ionici a catena alchilica variano la fluidità di membrana anche a basse molarità, con formazione di strutture miste