Post on 02-May-2015
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati e quantitativi
Real time PCR
impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo
segue la stessa cinetica della reazione
PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo
reale la quantità dello specifico prodotto di PCR
impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo
segue la stessa cinetica della reazione
PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo
reale la quantità dello specifico prodotto di PCR Termociclator
e con detector per fluorocromi e software per analisi dati
Linea di base (baseline): valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificatoLinea soglia (Threshold): scelta dall’operatore in modo da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenzialeCiclo soglia: E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold
Real time PCR
Linea soglia scelta dall’operatoreIn maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale
Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato
E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold
Real time PCR
Sistemi di rilevamento1. Coloranti che si
intercalano nella doppia elica
SYBR Green 1
Tm
La molecola fluorescente si lega randomrandom a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primersÈ necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
Durante l’allungamento si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di
copie dell’amplicone
SYBR Green 1
metodica semplice, non costosa
MA aspecifica
Analisi della curva di melting
Tm
82.688.1
melting peak
2. Sonde specifiche marcate con molecole fluorescenti
Primer
Primer3’3’
3’3’
3’3’3’3’
5’5’
5’5’5’5’
5’5’R QQ
5’5’ 3’3’
Sonde TaqMan
RREPORTER: fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza
fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter
Q
3’ 3’ 5’5’
3’ 5’5’
Si libera 1 molecola di reporter per ogni copia di DNA duplicata
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare: è è disegnata in modo da ibridarsi all’interno disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCRdel frammento amplificato nella reazione di PCR
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
R Q3’
3’ 5’5’
3’ 5’5’
Forward primer
Probe
Reverse primer
Quantificazione
ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di
campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard
curve)Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro CT con
quello del controllo endogeno
VOGLIO QUANTIFICARE IN TEMPO REALE LA PRESENZA DI UN MICRORGANISMO ALL’INTERNO
DI UNA MATRICE
1. Devo avere a disposizione una sonda specie-specifica in grado di amplificare una regione specifica del genoma del microrganismo in esame, di dimensioni comprese tra 100-700 bp verifica in PCR (specificità e curva di melting)
2. Devo preparare concentrazioni cellulari a titolo noto da cui estrarre e dosare il DNA totale 108 cellule 125 ng 106 cellule 10 ng 104 cellule 0.9 pg
3. Devo sottoporre ciascun campione ottenuto a q-PCR per ottenere delle curve di calibrazione, per trovare il range di linearità e la corrispondenza tra:
CT : quantità di DNA : quantità di cellule
A QUESTO PUNTO POSSO ANALIZZARE LA MATRICE IN ESAME
Estraggo il DNA totale dalla matrice ed eseguo una real-time PCR utilizzando tutti i dati ottenuti in fase di messa a punto del metodo:
primers specifici curva di calibrazione
Quantitativa relativaQuantitativa relativa
Plot di amplificazione
Numero di cicli
CT
SampleControl
Studio dell’espressione genicaStudio dell’espressione genica
1. Primers specifici per amplificare il gene di interesse
2. Estrazione dell’RNA e Real-time PCR per valutare se il gene viene trascritto
L’ RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA
L’ RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA
Quantitativa relativa: analisi dei dati
Normalizzare il gene target con un controllo endogeno (ref) espresso costitutivamente (CT) in una condizione di controllo
Variare le condizioni di crescita del ceppo in esame ed eseguire l’analisi. Il controllo endogeno non dovrebbe variare. La variazione di espressione del gene in studio va valutata in riferimento all’espressione dello stesso gene nelle condizioni di controllo
Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT del controllo
ratio = ( Etarget)ΔCt target (control-treated)
(Eref)ΔCt ref (control-treated)
E = efficienza della reazione: in teoria ad ogni ciclo di amplificazione si ha raddoppio delle copie di DNA
Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target