MYCOBACTERIAMYCOBACTERIA

MycobacteriaMycobacteria• Bacilli (2-4 Bacilli (2-4 µm), forme filamentose µm), forme filamentose

(molto sottili fino a 10-15 µm) (molto sottili fino a 10-15 µm) • ImmobiliImmobili• AsporigeniAsporigeni• Sprovvisti di capsulaSprovvisti di capsula• Aerobi obbligatiAerobi obbligati• Alcool-acido resistentiAlcool-acido resistenti

Classificazione

Struttura cellulare• Parete cellulare molto spessa

• Componenti della parete: peptidoglicano, diaminopimelato, polisaccaridi (glucano, mannano,

arabino-galattano, arabino-mannano)

• Inclusi citoplasmatici (lipidi, glicogeno, polimetafosfati)

Parete cellulare

• Composizione:– Grosse quantità di

glicolipidi:• acido micolico (60%)• complessi lipidi-

arabinogalattani• lipoarabinomannani

– Scarso petidoglicano

Gran parte delle proprietà esclusive che caratterizzano il genere

Mycobacterium sono, direttamente o indirettamente, legate alla

struttura della parete cellulare

• Funzioni:– Forma e prevenzione lisi

osmotica (peptidoglicano)– Inibizione ingresso

composti chimici• Crescita lenta• Maggiore resistenza agli

agenti chimici• Maggiore resistenza alla

fagocitosi– Induzione sintesi citochine

(TNF-) da parte dell’acido micolico

Mycobacterium spp.Parete cellulare

I LIPIDI DELLA PARETE BATTERICA

- GRASSI SOLUBILI IN ACETONE

- CERE

- FOSFATIDI

CERE• Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i

quali gli acidi micolici) ed alcoli.

La cera D, che in realtà è un glicopeptidolipide, è soprattutto nota per le sue proprietà adiuvanti; essa

infatti, se inoculata in emulsione idro-oleosa associata ad un antigene

proteico, potenzia enormemente la risposta immune umorale e cellulare

del soggetto ricevente verso l’antigene suddetto.

• Gli ACIDI MICOLICI sono quelli che più di frequente si trovano esterificati nelle molecole lipidiche, si tratta di acidi grassi β-idrossilati caratterizzati da una lunga catena satura di atomi di C (da 83 a 93)

A livello della superficie esterna del cell wall gli acidi micolici svolgono

la funzione di recettori fagici.

ACIDI MICOLICI

FATTORE CORDALEFATTORE CORDALE

Un micoside oggetto di studi approfonditi è il

DIMICOLIL-TREALOSO meglio noto col nome di

FATTORE CORDALE, così

chiamato perché i micobatteri

tubercolari, privati di tale sostanza,

perdono la caratteristica di svilupparsi, su certi terreni di coltura, in fasci serpentiformi.

FOSFATIDI

• Consistono di glicerolo esterificato con acidi grassi (palmitico, oleico) e con acido fosforico

Sono capaci di evocare da soli una reazione cellulare granulomatosa caratteristica e sovrapponibile a

quella che si osserva nell’infezione tubercolare

CARATTERISTICHE ANTIGENICHE

ANTIGENIANTIGENI

NaturaNatura

PolisaccaridicaPolisaccaridica(parete cellulare)(parete cellulare)

Natura proteicaNatura proteica(citoplasmatici)(citoplasmatici)

ArabinogalattaniArabinogalattaniImmunogeni solo Immunogeni solo

se inoculati se inoculati insieme alle celluleinsieme alle cellule

Responsabili Responsabili della della

sensibilizzaziosensibilizzazione di tipo ne di tipo allergicoallergico

Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA

La tubercolosi è un’affezione polmonare e pertanto diffonde per via aerea da uomo a uomo attraverso i nuclei essiccati delle goccioline di saliva emessi con la tosse dei malati di tubercolosi

La prima infezione si traduce in un’infiammazione localizzata a carattere essudativo di un limitato distretto del parenchima polmonare con compromissione dei linfonodi mediastinici (COMPLESSO PRIMARIO)

Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosisin lungin lung

Al complesso primario segue uno STATO ALLERGICO evidenziabile mediante iniezione di TUBERCOLINA che generalmente dura tutta la vita

In seguito ad una reinfezione o riattivazione del complesso primario, l’infezione può compromettere il parenchima polmonare e diffondere a qualsiasi organo

MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA

DIAGNOSI DI LABORATORIO

• ESAME MICROSCOPICO

• ESAME COLTURALE

• IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

• TIPIZZAZIONE FAGICA

• ANTIBIOGRAMMA

ESAME MICROSCOPICO

FLUORESCENZA

COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen

FLUORESCENZAFLUORESCENZA

400x

ESAME MICROSCOPICO

COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen

L’esame microscopio assume, per la ricerca dei micobatteri, una rilevanza

diagnosticache non trova riscontro in altri settori della batteriologia, e ciò grazie alla

peculiareproprietà di tali microorganismi di essere

alcool-acido resistenti.

La natura della alcool-acidoresistenza non è ancora del tutto chiarita,

essa sembra comunque correlata allacomponente lipidica della parete cellulare:

gli acidi micolici si complesserebbero infatti

con la fucsina impedendone il rilascio nonostante il trattamento con alcool ed

acido

Step 1:Step 1:• Versare la fucsina basica

Step 2:Step 2:• Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min• Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Tecnica (1 di 2)

Step 3:Step 3:• Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min)• Lavare con acqua

Step 4:Step 4:• Contrastare con blu di metilene per 1-2 min• Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Tecnica (2 di 2)

• Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso

• Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Osservazione microscopica

Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen

1000x

ESAME COLTURALE• L’esame colturale per micobatteri presenta delle

peculiarità, estranee alla batteriologia comune, legate alla lentezza con cui tali germi crescono sui terreni di coltura.

• Il divario di ritmo moltiplicativo esistente fra i micobatteri e l’eventuale flora associata è infatti tale che la presenza di quest’ultima, sia pur costituita da specie non particolarmente invasive ed a carica microbica ridotta, finisce regolarmente con lo sfruttare completamente tutta la superficie di terreno a disposizione ben prima che le colonie dei micobatteri, ivi comprese anche le specie a crescita più rapida, possano raggiungere dimensioni tali da poter essere apprezzate.

• La coltivazione dei micobatteri è possibile solo a condizione che questi si trovino in coltura pura (eventualità limitata in pratica solo a materiali particolari quali liquor, liquidi cavitari, sangue) o che a tale condizione possano essere ricondotti artificialmente (decontaminazione).

LA DECONTAMINAZIONEIl decontaminante ideale è una sostanza dotata di attività antibatterica su tutta la flora associata e

del tutto priva di attività nei confronti dei micobatteri.

a) NaOH al 4%. Può essere considerato il capostipite dei procedimenti di decontaminazione (svolge anche azione fluidificante); ormai non più usato a causa dell’elevata lesività sui micobatteri.

b) H2SO4 al 4%. E’ eccessivamente lesivo per i micobatteri.

c) Acido ossalico al 5%. Il suo impiego è giustificato solo per materiali fortemente contaminati da

Pseudomonas aeruginosa essendo assai lesivo per i micobatteri.

d) Fosfato trisodico al 25% + cloruro di benzalconio allo 0,3%. Decontamina e fluidifica al tempo stesso,

la lesività sui micobatteri è ridotta e le contaminazioni risultano contenute.

f) Fosfato trisodico allo 0,03% + NaOH allo 0,05% + di isobutil-naftalina-sulfonato allo 0,03%. L’attività decontaminante è molto buona, media la lesività

sui micobatteri.

• velocità di crescita• aspetto delle colonie

– rugose lisce– fotocromogene– scotocromogene– non pigmentate

• crescita a varie temperature• test di inibizione selettiva

CARATTERISTICHE COLTURALI

TERRENI SELETTIVI Terreni Componenti Sostanze inibitrici

Lowenstein-Jensen

Uova coagulate, Sali, glicerolo,

fecola di patate

Verde malachite, cicloesimide,

lincomicina, acido nalidixico

Middlebrook 7H10

Sali, vitamine, cofattori, acido

oleico, albumina, catalasi, glicerolo

Verde malachite, cicloesimide,

lincomicina, acido nalidixico

Terreno 7H11

Sali, vitamine, cofattori, acido

oleico, albumina, catalasi, glicerolo,

idrolizzato di caseina

Carbenicillina, amfotericina B,

polimixina B

Caratteristiche colturali

Caratteristiche delle colonie osservate con un microscopio da

dissezione

METODI COLTURALI “ALTERNATIVI”

METODI COLTURALI “ALTERNATIVI”

• metodo radiometrico• terreno bifasico• terreno con indicatore

fluorescente• terreno Redox

METODO RADIOMETRICOMETODO RADIOMETRICO

• flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14C

• miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni

• liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico

• rilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi

notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

METODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERIMETODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERI

TERRENO BIFASICOTERRENO BIFASICO

• flacone di terreno liquido per micobatteri

• miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni

• slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato)

• arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido

moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE

TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE

• provetta di terreno liquido per micobatteri

• miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni

• fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno

• comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico

• rilevamento della fluorescenza – visivo, sotto una lampada UV– automatizzato

accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

TERRENO REDOXTERRENO REDOX

• i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme

• i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazano dai micobatteri in crescita

• il formazano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento

• accumulo di niacina• riduzione dei nitrati• catalasi

– quantitativa– termoresistente

• idrolisi del Tween 80• ureasi• arilsolfatasi• riduzione del tellurito

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

• i farmaci antitubercolari maggiori

• il principio del metodo delle proporzioni

• l’antibiogramma manuale• l’antibiogramma automatizzato• l’antibiogramma sui

micobatteri non tubercolari

ANTIBIOGRAMMAANTIBIOGRAMMA

ANTIBIOGRAMMAL’Antibiogramma dei Micobatteri viene eseguito in

capsule di Petri a quadranti contenenti agar 7H11

Un quadrante è usato come controllo, mentre ciascuno degli altri quadranti contiene un farmaco antimicrobico diverso

Tutti i quadranti vengono inoculati con una concentrazione standardizzata del microrganismo in esame

La sensibilità a ciascun farmaco è determinata paragonando il numero delle colonie cresciute nei quadranti contenenti i farmaci con il controllo (se la percentuale di resistenza è superiore all’1% il ceppo viene considerato resistente al farmaco)

ANTIBIOGRAMMAAntibiotico incorporatoAntibiotico incorporato

nell’agarnell’agarAntibiotico incorporatoAntibiotico incorporato

in dischetti di cartain dischetti di carta

La diagnostica tradizionale

• Esame microscopico– test rapido ma scarsamente sensibile

• Esame colturale– sensibile ma richiede da una a otto

settimane; problema delle contaminazioni• Identificazione

– test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi

• Antibiogramma– diretto: relativamente rapido ma con alta

incidenza di contaminazioni– da ceppo isolato: tempi lunghi

Metodi di identificazione “alternativi”

Metodi di identificazione “alternativi”

•DNA probe•HPLC degli acidi micolici•sequenziamento genico

– 16S rDNA– SOD– HSP65

• Vantaggi– enorme risparmio di tempo – specificità pressoché assoluta

• Svantaggi– disponibili per un numero limitato di

specie– costo– complessità di esecuzione?

DNA-probe, alternativa all’identificazione?

IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE DNA-DNA-probes marcate con probes marcate con 125125II

• acidi grassi, ramificati in posizione • presenti nella parete batterica dei

generi:– Corynebacterium: 22-38 atomi di C– Rhodococcus: 34-52 atomi di C– Nocardia: 44-60 atomi di C– Gordona: 48-66 atomi di C– Tsukamurella: 64-78 atomi di C– Mycobacterium: 60-90 atomi di C

• presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici– alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega'

metossi-

HPLC degli acidi micoliciHPLC degli acidi micolici

HPLC degli acidi micoliciHPLC degli acidi micolici

• saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri

• frazionamento mediante HPLC• individuazione dei picchi presenti nel

tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento

profilo HPLC del M. tuberculosis complexprofilo HPLC del M.

tuberculosis complexad eccezione del ad eccezione del M. bovisM. bovis BCG BCG

SI

esempi di profili HPLCesempi di profili HPLC

SI

SI

Il sequenziamento genico

• E’ la tecnica di riferimento per l’identificazione

• Possibili bersagli– rRNA o rRNA 16S– gene codificante per le heat shock proteins– gene codificante per la superossido dismutasi– spacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e

23S

Amplificazione genica alternativa all’esame

microscopico?• Vantaggi

– sensibilità superiore (ma non di molto)

– specificità di specie (ed eventualmente anche di genere)

• Svantaggi– esecuzione complessa– costo elevato

• Vantaggi– molto più rapida– se positiva rende superflua l’identificazione– eseguibile anche su campioni pesantemente

contaminati

• Svantaggi– non altrettanto sensibile– non rileva i micobatteri appartenenti ad altre

specie– false negatività dovute agli inibitori– false positività dovute a contaminazioni– costo elevato– esecuzione complessa– impossibilità di eseguire l’antibiogramma

Amplificazione genica alternativa all’esame

colturale?

Target dell’amplificazionedel M. tuberculosis

complex• Geni presenti in copia singola

– gene codificante per l’antigene di 65-kD (HSP)• Brisson-Noel et al. Lancet 1989

– gene codificante per l’antigene di 126-kD (fusion protein)

• Hermans et al. J.C.M. 1990

– gene codificante per lo rRNA 16S• Boddinghaus et al. J.C.M. 1990

– gene codificante per l’antigene di 38-kD (proteina b)

• Miyazaki et al. J.C.M. 1993

• Sequenze ripetute– IS6110

• Eisenach et al. J.I.D. 1990

Raccomandazioni sull’impiego del test di amplificazione

• Non sostituisce esame microscopico e colturale

• Da eseguirsi solo su campioni selezionati• L’attendibilità del test sui materiali non

respiratori non è dimostrata• Non utilizzabile per il monitoraggio della

terapia• INTERPRETAZIONE:

– Amplificazione + / Microscopico + = probabile TBC– Amplificazione - / Microscopico + :

ripetizione su altri 2 campioni, se il risultato viene confermato = infezione da MOTT o presenza di inibitori

– Amplificazione + / Microscopico - : ripetizione su uno o 2 campioni, se il risultato viene confermato = probabile TBC

Conclusioni

• AMPLIFICAZIONE? SI, ma ….– solo in centri qualificati– solo su campioni selezionati– non per il monitoraggio della terapia

• La sensibilità dei sistemi commerciali deve essere aumentata (ovviamente non a scapito della specificità)

• Le tecniche in house non sono adatte all’impiego in routine

Epidemiologia molecolare

• Sorveglianza della tubercolosi e tracciamento di ceppi particolari (Beijing)

• Riconoscimento delle infezioni miste

• Distinzione di recidive e reinfezioni • Individuazione delle contaminazioni

di laboratorio

Principali tecniche per l’epidemiologia molecolare

• PFGE– frammentazione del genoma mediante enzimi

di restrizione specifici per siti poco frequenti

• PCR random– usa primer scelti in maniera casuale

• RFLP– applicabile a specie di cui si conoscono

insertion sequence

RFLP

• BERSAGLIO: il transposone IS1610, di cui possono essere mediamente presenti nel M. tuberculosis complex da 6 a 17 copie, variamente dislocate nel genoma

• PRINCIPIO: un enzima di restrizione, specifico per un sito presente all’interno del IS1610, spezzetta il genoma in un numero di frammenti non inferiore al numero di IS presenti. I frammenti presentano dimensioni diverse a seconda della posizione dei singoli IS nel genoma

• RIVELAZIONE: mediante elettroforesi si ottengono pattern che differiscono per il numero e la posizione delle bande

• La possibilità che ceppi diversi abbiano pattern uguali sono trascurabili, la stabilità dei pattern è elevata

RFLP fingerprinting