Boccherini - Op6 n30 - La Musica Notturna Delle Strade Di Madri
MYCOBACTERIA
-
Upload
lisandra-bishop -
Category
Documents
-
view
56 -
download
4
description
Transcript of MYCOBACTERIA
MYCOBACTERIAMYCOBACTERIA
MycobacteriaMycobacteria• Bacilli (2-4 Bacilli (2-4 µm), forme filamentose µm), forme filamentose
(molto sottili fino a 10-15 µm) (molto sottili fino a 10-15 µm) • ImmobiliImmobili• AsporigeniAsporigeni• Sprovvisti di capsulaSprovvisti di capsula• Aerobi obbligatiAerobi obbligati• Alcool-acido resistentiAlcool-acido resistenti
Classificazione
Struttura cellulare• Parete cellulare molto spessa
• Componenti della parete: peptidoglicano, diaminopimelato, polisaccaridi (glucano, mannano,
arabino-galattano, arabino-mannano)
• Inclusi citoplasmatici (lipidi, glicogeno, polimetafosfati)
Parete cellulare
• Composizione:– Grosse quantità di
glicolipidi:• acido micolico (60%)• complessi lipidi-
arabinogalattani• lipoarabinomannani
– Scarso petidoglicano
Gran parte delle proprietà esclusive che caratterizzano il genere
Mycobacterium sono, direttamente o indirettamente, legate alla
struttura della parete cellulare
• Funzioni:– Forma e prevenzione lisi
osmotica (peptidoglicano)– Inibizione ingresso
composti chimici• Crescita lenta• Maggiore resistenza agli
agenti chimici• Maggiore resistenza alla
fagocitosi– Induzione sintesi citochine
(TNF-) da parte dell’acido micolico
Mycobacterium spp.Parete cellulare
I LIPIDI DELLA PARETE BATTERICA
- GRASSI SOLUBILI IN ACETONE
- CERE
- FOSFATIDI
CERE• Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i
quali gli acidi micolici) ed alcoli.
La cera D, che in realtà è un glicopeptidolipide, è soprattutto nota per le sue proprietà adiuvanti; essa
infatti, se inoculata in emulsione idro-oleosa associata ad un antigene
proteico, potenzia enormemente la risposta immune umorale e cellulare
del soggetto ricevente verso l’antigene suddetto.
• Gli ACIDI MICOLICI sono quelli che più di frequente si trovano esterificati nelle molecole lipidiche, si tratta di acidi grassi β-idrossilati caratterizzati da una lunga catena satura di atomi di C (da 83 a 93)
A livello della superficie esterna del cell wall gli acidi micolici svolgono
la funzione di recettori fagici.
ACIDI MICOLICI
FATTORE CORDALEFATTORE CORDALE
Un micoside oggetto di studi approfonditi è il
DIMICOLIL-TREALOSO meglio noto col nome di
FATTORE CORDALE, così
chiamato perché i micobatteri
tubercolari, privati di tale sostanza,
perdono la caratteristica di svilupparsi, su certi terreni di coltura, in fasci serpentiformi.
FOSFATIDI
• Consistono di glicerolo esterificato con acidi grassi (palmitico, oleico) e con acido fosforico
Sono capaci di evocare da soli una reazione cellulare granulomatosa caratteristica e sovrapponibile a
quella che si osserva nell’infezione tubercolare
CARATTERISTICHE ANTIGENICHE
ANTIGENIANTIGENI
NaturaNatura
PolisaccaridicaPolisaccaridica(parete cellulare)(parete cellulare)
Natura proteicaNatura proteica(citoplasmatici)(citoplasmatici)
ArabinogalattaniArabinogalattaniImmunogeni solo Immunogeni solo
se inoculati se inoculati insieme alle celluleinsieme alle cellule
Responsabili Responsabili della della
sensibilizzaziosensibilizzazione di tipo ne di tipo allergicoallergico
Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis
MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA
La tubercolosi è un’affezione polmonare e pertanto diffonde per via aerea da uomo a uomo attraverso i nuclei essiccati delle goccioline di saliva emessi con la tosse dei malati di tubercolosi
La prima infezione si traduce in un’infiammazione localizzata a carattere essudativo di un limitato distretto del parenchima polmonare con compromissione dei linfonodi mediastinici (COMPLESSO PRIMARIO)
Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosisin lungin lung
Al complesso primario segue uno STATO ALLERGICO evidenziabile mediante iniezione di TUBERCOLINA che generalmente dura tutta la vita
In seguito ad una reinfezione o riattivazione del complesso primario, l’infezione può compromettere il parenchima polmonare e diffondere a qualsiasi organo
MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA
DIAGNOSI DI LABORATORIO
• ESAME MICROSCOPICO
• ESAME COLTURALE
• IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
• TIPIZZAZIONE FAGICA
• ANTIBIOGRAMMA
ESAME MICROSCOPICO
FLUORESCENZA
COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen
FLUORESCENZAFLUORESCENZA
400x
ESAME MICROSCOPICO
COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen
L’esame microscopio assume, per la ricerca dei micobatteri, una rilevanza
diagnosticache non trova riscontro in altri settori della batteriologia, e ciò grazie alla
peculiareproprietà di tali microorganismi di essere
alcool-acido resistenti.
La natura della alcool-acidoresistenza non è ancora del tutto chiarita,
essa sembra comunque correlata allacomponente lipidica della parete cellulare:
gli acidi micolici si complesserebbero infatti
con la fucsina impedendone il rilascio nonostante il trattamento con alcool ed
acido
Step 1:Step 1:• Versare la fucsina basica
Step 2:Step 2:• Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min• Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica (1 di 2)
Step 3:Step 3:• Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min)• Lavare con acqua
Step 4:Step 4:• Contrastare con blu di metilene per 1-2 min• Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica (2 di 2)
• Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso
• Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Osservazione microscopica
Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen
1000x
ESAME COLTURALE• L’esame colturale per micobatteri presenta delle
peculiarità, estranee alla batteriologia comune, legate alla lentezza con cui tali germi crescono sui terreni di coltura.
• Il divario di ritmo moltiplicativo esistente fra i micobatteri e l’eventuale flora associata è infatti tale che la presenza di quest’ultima, sia pur costituita da specie non particolarmente invasive ed a carica microbica ridotta, finisce regolarmente con lo sfruttare completamente tutta la superficie di terreno a disposizione ben prima che le colonie dei micobatteri, ivi comprese anche le specie a crescita più rapida, possano raggiungere dimensioni tali da poter essere apprezzate.
• La coltivazione dei micobatteri è possibile solo a condizione che questi si trovino in coltura pura (eventualità limitata in pratica solo a materiali particolari quali liquor, liquidi cavitari, sangue) o che a tale condizione possano essere ricondotti artificialmente (decontaminazione).
LA DECONTAMINAZIONEIl decontaminante ideale è una sostanza dotata di attività antibatterica su tutta la flora associata e
del tutto priva di attività nei confronti dei micobatteri.
a) NaOH al 4%. Può essere considerato il capostipite dei procedimenti di decontaminazione (svolge anche azione fluidificante); ormai non più usato a causa dell’elevata lesività sui micobatteri.
b) H2SO4 al 4%. E’ eccessivamente lesivo per i micobatteri.
c) Acido ossalico al 5%. Il suo impiego è giustificato solo per materiali fortemente contaminati da
Pseudomonas aeruginosa essendo assai lesivo per i micobatteri.
d) Fosfato trisodico al 25% + cloruro di benzalconio allo 0,3%. Decontamina e fluidifica al tempo stesso,
la lesività sui micobatteri è ridotta e le contaminazioni risultano contenute.
f) Fosfato trisodico allo 0,03% + NaOH allo 0,05% + di isobutil-naftalina-sulfonato allo 0,03%. L’attività decontaminante è molto buona, media la lesività
sui micobatteri.
• velocità di crescita• aspetto delle colonie
– rugose lisce– fotocromogene– scotocromogene– non pigmentate
• crescita a varie temperature• test di inibizione selettiva
CARATTERISTICHE COLTURALI
TERRENI SELETTIVI Terreni Componenti Sostanze inibitrici
Lowenstein-Jensen
Uova coagulate, Sali, glicerolo,
fecola di patate
Verde malachite, cicloesimide,
lincomicina, acido nalidixico
Middlebrook 7H10
Sali, vitamine, cofattori, acido
oleico, albumina, catalasi, glicerolo
Verde malachite, cicloesimide,
lincomicina, acido nalidixico
Terreno 7H11
Sali, vitamine, cofattori, acido
oleico, albumina, catalasi, glicerolo,
idrolizzato di caseina
Carbenicillina, amfotericina B,
polimixina B
Caratteristiche colturali
Caratteristiche delle colonie osservate con un microscopio da
dissezione
METODI COLTURALI “ALTERNATIVI”
METODI COLTURALI “ALTERNATIVI”
• metodo radiometrico• terreno bifasico• terreno con indicatore
fluorescente• terreno Redox
METODO RADIOMETRICOMETODO RADIOMETRICO
• flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14C
• miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni
• liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico
• rilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi
notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità
METODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERIMETODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERI
TERRENO BIFASICOTERRENO BIFASICO
• flacone di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni
• slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato)
• arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido
moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità
TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE
TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE
• provetta di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni
• fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno
• comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico
• rilevamento della fluorescenza – visivo, sotto una lampada UV– automatizzato
accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità
TERRENO REDOXTERRENO REDOX
• i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme
• i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazano dai micobatteri in crescita
• il formazano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento
• accumulo di niacina• riduzione dei nitrati• catalasi
– quantitativa– termoresistente
• idrolisi del Tween 80• ureasi• arilsolfatasi• riduzione del tellurito
IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
• i farmaci antitubercolari maggiori
• il principio del metodo delle proporzioni
• l’antibiogramma manuale• l’antibiogramma automatizzato• l’antibiogramma sui
micobatteri non tubercolari
ANTIBIOGRAMMAANTIBIOGRAMMA
ANTIBIOGRAMMAL’Antibiogramma dei Micobatteri viene eseguito in
capsule di Petri a quadranti contenenti agar 7H11
Un quadrante è usato come controllo, mentre ciascuno degli altri quadranti contiene un farmaco antimicrobico diverso
Tutti i quadranti vengono inoculati con una concentrazione standardizzata del microrganismo in esame
La sensibilità a ciascun farmaco è determinata paragonando il numero delle colonie cresciute nei quadranti contenenti i farmaci con il controllo (se la percentuale di resistenza è superiore all’1% il ceppo viene considerato resistente al farmaco)
ANTIBIOGRAMMAAntibiotico incorporatoAntibiotico incorporato
nell’agarnell’agarAntibiotico incorporatoAntibiotico incorporato
in dischetti di cartain dischetti di carta
La diagnostica tradizionale
• Esame microscopico– test rapido ma scarsamente sensibile
• Esame colturale– sensibile ma richiede da una a otto
settimane; problema delle contaminazioni• Identificazione
– test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi
• Antibiogramma– diretto: relativamente rapido ma con alta
incidenza di contaminazioni– da ceppo isolato: tempi lunghi
Metodi di identificazione “alternativi”
Metodi di identificazione “alternativi”
•DNA probe•HPLC degli acidi micolici•sequenziamento genico
– 16S rDNA– SOD– HSP65
• Vantaggi– enorme risparmio di tempo – specificità pressoché assoluta
• Svantaggi– disponibili per un numero limitato di
specie– costo– complessità di esecuzione?
DNA-probe, alternativa all’identificazione?
IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE DNA-DNA-probes marcate con probes marcate con 125125II
• acidi grassi, ramificati in posizione • presenti nella parete batterica dei
generi:– Corynebacterium: 22-38 atomi di C– Rhodococcus: 34-52 atomi di C– Nocardia: 44-60 atomi di C– Gordona: 48-66 atomi di C– Tsukamurella: 64-78 atomi di C– Mycobacterium: 60-90 atomi di C
• presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici– alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega'
metossi-
HPLC degli acidi micoliciHPLC degli acidi micolici
HPLC degli acidi micoliciHPLC degli acidi micolici
• saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri
• frazionamento mediante HPLC• individuazione dei picchi presenti nel
tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento
profilo HPLC del M. tuberculosis complexprofilo HPLC del M.
tuberculosis complexad eccezione del ad eccezione del M. bovisM. bovis BCG BCG
SI
esempi di profili HPLCesempi di profili HPLC
SI
SI
Il sequenziamento genico
• E’ la tecnica di riferimento per l’identificazione
• Possibili bersagli– rRNA o rRNA 16S– gene codificante per le heat shock proteins– gene codificante per la superossido dismutasi– spacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e
23S
Amplificazione genica alternativa all’esame
microscopico?• Vantaggi
– sensibilità superiore (ma non di molto)
– specificità di specie (ed eventualmente anche di genere)
• Svantaggi– esecuzione complessa– costo elevato
• Vantaggi– molto più rapida– se positiva rende superflua l’identificazione– eseguibile anche su campioni pesantemente
contaminati
• Svantaggi– non altrettanto sensibile– non rileva i micobatteri appartenenti ad altre
specie– false negatività dovute agli inibitori– false positività dovute a contaminazioni– costo elevato– esecuzione complessa– impossibilità di eseguire l’antibiogramma
Amplificazione genica alternativa all’esame
colturale?
Target dell’amplificazionedel M. tuberculosis
complex• Geni presenti in copia singola
– gene codificante per l’antigene di 65-kD (HSP)• Brisson-Noel et al. Lancet 1989
– gene codificante per l’antigene di 126-kD (fusion protein)
• Hermans et al. J.C.M. 1990
– gene codificante per lo rRNA 16S• Boddinghaus et al. J.C.M. 1990
– gene codificante per l’antigene di 38-kD (proteina b)
• Miyazaki et al. J.C.M. 1993
• Sequenze ripetute– IS6110
• Eisenach et al. J.I.D. 1990
Raccomandazioni sull’impiego del test di amplificazione
• Non sostituisce esame microscopico e colturale
• Da eseguirsi solo su campioni selezionati• L’attendibilità del test sui materiali non
respiratori non è dimostrata• Non utilizzabile per il monitoraggio della
terapia• INTERPRETAZIONE:
– Amplificazione + / Microscopico + = probabile TBC– Amplificazione - / Microscopico + :
ripetizione su altri 2 campioni, se il risultato viene confermato = infezione da MOTT o presenza di inibitori
– Amplificazione + / Microscopico - : ripetizione su uno o 2 campioni, se il risultato viene confermato = probabile TBC
Conclusioni
• AMPLIFICAZIONE? SI, ma ….– solo in centri qualificati– solo su campioni selezionati– non per il monitoraggio della terapia
• La sensibilità dei sistemi commerciali deve essere aumentata (ovviamente non a scapito della specificità)
• Le tecniche in house non sono adatte all’impiego in routine
Epidemiologia molecolare
• Sorveglianza della tubercolosi e tracciamento di ceppi particolari (Beijing)
• Riconoscimento delle infezioni miste
• Distinzione di recidive e reinfezioni • Individuazione delle contaminazioni
di laboratorio
Principali tecniche per l’epidemiologia molecolare
• PFGE– frammentazione del genoma mediante enzimi
di restrizione specifici per siti poco frequenti
• PCR random– usa primer scelti in maniera casuale
• RFLP– applicabile a specie di cui si conoscono
insertion sequence
RFLP
• BERSAGLIO: il transposone IS1610, di cui possono essere mediamente presenti nel M. tuberculosis complex da 6 a 17 copie, variamente dislocate nel genoma
• PRINCIPIO: un enzima di restrizione, specifico per un sito presente all’interno del IS1610, spezzetta il genoma in un numero di frammenti non inferiore al numero di IS presenti. I frammenti presentano dimensioni diverse a seconda della posizione dei singoli IS nel genoma
• RIVELAZIONE: mediante elettroforesi si ottengono pattern che differiscono per il numero e la posizione delle bande
• La possibilità che ceppi diversi abbiano pattern uguali sono trascurabili, la stabilità dei pattern è elevata
RFLP fingerprinting