Misurazione e uso di anticorpi

Misurazione delle funzioni dei linfociti T

Misurazione e uso di Abs

• Saggio ELISA• ELISPOT• Cromatografia d’affinità• Western Blotting• Microscopia ad immunofluorescenza• Citometria a flusso

Citometria a flusso

• Cellule in sospensione

• passano in singola fila attraverso

• un volume illuminato dove esse

• riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza

• che viene raccolta, filtrata e

• convertita ad un valore digitale

• che viene inviato al computer

Fluidica

Ottica

Elettronica

Basi della Citometria a Flusso

Etidio Bromuro

PE (ficoeritrina)

Acido cis-Parinarico

Texas Red

Coniugato PE-TR

Ioduro di Propidio

FITC (fluoresceina)

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Linee

Laser Comuni

Fluorocromi utilizzati più comunemente

Cella di Flusso

Iniettore

Segnale di Fluorescenza

Raggio laser focalizzato

Fluido dirivestimento

Linfocito

Monocito

Granulocito

Schema generale della camera di flussodi un citofluorimetro

Rilevamento dei parametri fisici

Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi

Luce Riflessa

Luce trasmessaSorgente luminosa

(Forward Angle Light Scatter, FALS)

Sensore per ilFALS

Laser

Linfocito

Monocito

Granulocito

Scatter frontale

• Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” nella direzione frontale (ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del forward scatter

• L’ intensità del forward scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

(90 Degree Light Scatter)

Sensore FALS

Sensore per il 90°LS

LaserLinfocito

Monocito

Granulocito

Scatter laterale

• Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del side oppure 90°scatter

• Anche l’ intensità del side scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

• Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare delle particelle del Side Scatter – può essere usato per distinguere cellule

vive da cellule morte

• Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all’interno della cellula del forward scatter– può essere usato per distinguere cellule

granulate da cellule non-granulate

Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico

LINFOCITI

MONOCITI

GRANULOCITI

Nuclei di linfociti normali o apoptotici

Complex or Boolean Gating

With two overlapping regions, several options are available:

R1 R2

Region 1 and Region 2:

Boolean Gating

M1

M1

R2

93%

LPS 10 µg/ml

Un-treated

3%

Espressione di molecole CD86 (B7.2)

Bordetella Pertussis Bordetella Para-pertussis

B7.2

MHC II

CD 40

Cecilia 2 (exp. M) - 13 febbraio 2004 D1 : batteri = 1:75 spin 90 min. incubazione

FL1-H : CD11b

FL2-H : CD11c

DCCD11c+CD11b+pDC

CD11c+CD11b-

MacrophagesCD11c-CD11b+

T cellsCD11c-CD11b-

B cells

FL1-H

Analisi citofluorimetrica

FL

2-H

Analisi del ciclo cellulare

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apoptosi

analisi al citofluorimetro

singole

Il “sorting” cellulare

488 nm laser

+-

FACS:Fluorescence Activated Cell Sorting

Piastre caricheelettricamente

Cellule singole separate dentrodiverse provette

FALS Sensor

Fluorescence detector

ElectrodeCrystal

Laser

Amp. (v)

Freq. (Hz)

Jet-in-Air

Nozzle

OpticsElectronic

Amp. (v)

Freq. (Hz) Laser

Nozzle

Jet-in-Air

Electrode

Crystal

OpticsElectronic

Amp. (v)

Freq. (Hz) Laser

+/- 190 V

Fluorescence+++++++++

Nozzle

Delay Time

Break-off Point

Jet-in-Air

Electrode

Crystal

OpticsElectronic

- 3000 V + 3000 V

+

+

__

Jet-in-Air

Analisi pre-sorter

Macrofagi peritoneali CD11b positivi

Gating

Macrofagi peritoneali CD11b positivi

Sorted

CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted

Misurazione e uso di Abs

• Saggio ELISA• ELISPOT• Cromatografia d’affinità• Western Blotting• Microscopia ad immunofluorescenza• Citometria a flusso

• Legame diretto con l’Ag

• Sandwich

ELISA

ELISAsandwich

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ELISPOT

Western blotting

Cromatografia d’affinità

Magnetic sorting

miniMACS

Microscopia ad immunofluorescenza

.

.

.

.

.

.

Immuno Staining (anti-occludina)

polilisina/vetrinoconc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H2O20 min. RT2 lavaggi con H2Oasciugare bene

PREPARZIONE DEI CAMPIONISeminare 1,5 x 105 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO sieroIncubazione, 15 min 37 ｰ C (incubatore)Controllare al microscopio

FISSARE LE CELLSAspirare il surnatanteAggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4 ｰ CLavare tre volte con PBS 1X (RT)A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4 ｰ C)

1

COLORAZIONE

Aspirare il PBSPermeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice.Washing 3X con PBSBlocking con 3%BSA in PBS, 15 min RTWashing 3x con PBS

Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N. 71.1500), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino1 h on iceWashing 3x con PBS

Secondary Ab, a-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n. 711.166.152). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino.30 min on ice, al buio.Washing 3x con PBSMontare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol30 min RT, buioVetrino a – 20 ｰ C.

2

Misurazione delle funzioni dei linfociti T

A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, l’immunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare.

Le cells T non secernono prodotti in grado di legare l’antigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame

Studio di funzioni linfocitarie

Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi:

1. Uccisione del bersaglio cellulare

2. Attivazione delle cellule APC

3. Produzione di citochine

Metodiche

1. saggio di citotossicità

2. saggio di proliferazione

3. misurazione di citochine

Attività citotossica:Rilascio di cromo da cellule bersaglio

Proliferazione antigene-specifica dellecellule T

Misura citochine prodotte:intracellular staining

Intracellular staining

1- cellule in piastra a concentrazione molto alta (5x105cells/ml)

2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml

3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x106cells/ml/sample)

4- blocking: incubare 100 l di PBS-FCS 5% 10 min RT

5- aggiungere anticorpo di superficie

6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5%

7- fissare con 500 l/tubo di paraformaldeide 2% e incubare 10 minuti RT

8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5%

9- permeare: risospendere le cells in 500 l PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT

10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200 rpm x 5 min

11- risospendere in 100 l di PB+siero per blocking (1:25)

12- aggiungere anticorpo intracellulare

13- incubare 30 min RT al buio

14- lavare 2 volte con PB

15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5%

Misura citochine prodotte:cytokine capture

CFSE is cell membrane permeable and readily accumulates inside of viable cells where it covalently attaches to intracellular proteins. Hydrolyzed CFSE emits fluorescence and covalently-attached fluorescein molecules seldom leak from cells. CFSE-labeled cells can be monitored over several weeks in vivo. Therefore, CFSE is utilized for viable cell detection as well as for the long-term observation of cell activities by fluorescent microscopy. The excitation and emission wavelengths of CFSE-labeled cells are 500 nm and 520 nm, respectively.

5- or 6-(N-Succiimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacethylfluorescein

CFSE

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T cell proliferationCFSE staining

WT IL-2-/-No DCs

CD8C

FS

E

48 h

72 h

FSC

Allogeneic CD8 T cell proliferation