RUOLI BIOLOGICI DELLE PROTEINE

PROTEINE DI DIFESA – Ig ed MHC

ANTICORPI

(Immunoglobuline)

B-CELLS, T-CELLS

(LINFOCITI con recettori MHC)

PEPTIDI ANTIMICROBICI

PROTEINE DEL COMPLEMENTO

NATURAL KILLER (CELLULE NK)

SISTEMA IMMUNITARIO

MONOCITI (MACROFAGI)

(NEUTROFILI, EOSINOFILI & BASOFILI) GRANULOCITI

IMMUNITA’ ACQUISITA O ADATTATIVA

IMMUNITA’ INNATA

RISPOSTA UMORALE

RISPOSTA MEDIATA DA CELLULE

• Proteine prodotte dalle plasmacellule (LINFOCITI B attivati)

• Produzione stimolata da molecole estranee all’organismo (NON-SELF) che possono

essere polipeptidi/proteine, polisaccaridi, acidi nucleici o altre molecole (ANTIGENE)

• Le Ig riconoscono parti di queste molecole noti come DETERMINANTI ANTIGENICI

• Ogni cellula B produce un solo tipo di Ig con una particolare specificità per un dato

determinante antigenico – il repertorio di diversi Ig disponibili nell’uomo è > 1011.

Questa specificità deriva da una parte della sequenza primaria della molecola Ig (sito

recettoriale).

• Gli anticorpi (Ig) si formano per SELEZIONE (dei prodotti di singoli geni) piuttosto che

per ISTRUZIONE (adattamento di Ig all’antigene). Ma abbiamo un numero limitato di

geni (<30000). Non ereditiamo quindi geni per ogni Ig (Teoria germinale), ma piuttosto

essi sono generati per ricombinazione somatica di un N° limitato di componenti (Teoria

della diversificazione somatica)

• Le cellule B esprimono 105 molecole analoghe alle Ig che producono sulla loro

superficie, come recettori cellulari per antigeni. Quelle che esprimono Ig per le

molecole del SELF sono soppresse nelle fasi precoci dello sviluppo.

• Quando una cellula B incontra un determinante antigenico complementare al sito di

legame della sua Ig recettoriale scattano una serie di eventi che portano alla

riproduzione rapida della cellula (selezione clonale)

IMMUNOGLOBULINE (Ig) / ANTICORPI

• Il clone di cellule B attivate produce e rilascia Ig solubili in quantità, che possono

riconoscere e legare lo stesso determinante antigenico riconosciuto dalla Ig

recettoriale, nei microbi o tessuti non-self che lo esprimono.

• Le plasma cellule producono inizialmente un tipo di immunoglobulina noto come

IgM, poi avviene la commutazione di classe, e sono espresse IgG, IgA, IgD o IgE,

con specificità per lo stesso determinante antigenico ma diversi ruoli nell’immunità.

• Dopo l’eliminazione dell’infezione, le plasmacellule muoiono, ma un certo numero di

cellule B corrispondente a quel clone persiste in circolazione (MEMORIA). Questo

fornisce una risposta più rapida in futuro verso lo stesso agente infettante)

• I LINFOCITI T sono attivati in maniera analoga ai linfociti B, ma forniscono una

RISPOSTA CELLULARE

• Linfociti B Ig : risposta umorale efficace contro batteri, tossine batteriche e

virus in circolo

• Linfociti T : efficaci contro cellule infette

Caratteristiche comuni dei linfociti B e T : SELETTIVITA’ e MEMORIA

Immunoglobuline e linfociti

IMMUNOGLOBULINE -

H HEAVY CHAIN = CATENA PESANTE

L LIGHT CHAIN = CATENA LEGGERA

C dominio CONSERVATO

V dominio VARIABILE

Strutture 1a e 4a

s s ponti disolfuro

L L

H H

C-term C-term

N

N

N

N-term

C C

V H V H

V L V L

C L C L

s

s

s

s

s

s

s

s

s

s

s s

s s

s s

s s

s s

s

s s

s

s s

s s s s

C 2 H

C 3 H

C 1 H C 1 H

C 2 H

C 3 H

A

L

H N

N

C

V H

V L

C L

C 1 H CDR

CDR

C

CDR = COMPLEMENTARITY

DETERMINING REGION

(Regione ipervariabile)

A = ANTIGENE

s s

Papaina

Porzione

Fab

Porzione

Fc

oligosaccaride

Strutture 2a e 3° (esempio di domini strutturali)

Dominio conservato

1 2 5 7 4 6

3

3b 3c

CDR1 CDR3

CDR2

1

2 6 5 3 4 7

Dominio variabile

La diversità nel repertorio di Ig (> 1010 diverse molecole) è dovuta a:

i) ricombinazione somatica di diversi frammenti genici che codificano per VCL e VCH

con numerose varianti per ciascun frammento genico ( 3x106 combinazioni)

ii) ‘alternative splicing’ nelle catene VCL e VCH ( >108)

iii) diverse combinazioni di VCL con le VCH

iv) ipermutazione somatica delle regioni V (affinità per antigene aumenta di 1000 volte)

L = leader seq.; V = variable (~100 res.); D = diversity; J = joining (~13 res.) ; C = constant; MC = membrane coding; SC = Secretion coding

VL CL

VH CH1 CH

2 CH3

(k o l)

Il numero di segmenti è pertinente ad un individuo, e varia in diversi individui (polimorfismo genetico)

1 1

Struttura molecolare

Fab

Fab legame

antigene

Fab

Fc funzioni

effettrici

oligosaccaride

Sito di legame per l’antigene

Sito di legame per l’antigene

• I diversi tipi di immunoglubuline che differiscono nella composizione delle CH

(5 diversi isotipi, G,M,A,D e E e 4 subclassi per le IgG)

• Gli isotipi variano per tipo di CH e numero di catene, ponti disolfuro e glicosidazione

• I linfociti B esprimono inizialmente le IgM e successivamente, per un processo noto come

‘isotype switching’ (commutazione di classe) esprimono uno degli altri isotipi

• La composizione dei domini CH conferisce specializzazione funzionale alle Ig

Diversi tipi di Ig

g

IgG (monomeriche)

Siero

~ 80%

m

IgM (pentameriche)

precoci

~ 10%

IgA (mono/di/

trimeriche)

secrezioni

esterne

~ 10%

(lacrime, saliva,

mucose)

a

e

IgE (monomeriche)

antiparassitarie

< 0.02%

(reaz. allergiche)

= oligosaccaride

d

IgD (monomeriche)

(?) recettore

< 0.2%

poiché le molecole di IgG hanno 2 siti

di legame per l’antigene, possono

formare legami crociati unendo

assieme antigeni polivalenti

Gli Ig formano legami multipli con antigeni polivalenti

attivazione linfocita B

I recettori sui linfociti B sono molecole tipo IgM modificate

con un dominio di ancoraggio per la membrana. Un

antigene polivalente causa l’oligomerizzazione di recettori

sulla superficie che innesca il segnale di attivazione

produzione IgM

Isotype swithcing

MHC (complesso maggiore d’istocompatibilità)

Le MHC di classe I presentano frammenti di proteine citoplasmatiche sulla superficie

delle cellule (meccanismo “taglia ed esponi”), incluso frammenti di eventuali patogeni

intracellulari

CELLULA T

KILLER

(recettore

cellula T) TCR

CD8

1) perforine

2) granzimi

3) apoptosi

Struttura Delle MHC

• Le MHC sono formate da quattro domini extracellulari, uno

transmembrana ed uno intracellulare

• Il sito di legame per l’antigene è una piattaforma recintata, formata

da un -foglietto e 2 a-eliche

• Peptidi di 8-10 residui si legano in forma estesa, ancorati da due

residui alle estremità (possono presentare milioni di frammenti

diversi)

MHC-I e la presentazione dell’antigene in cellule infette

MHC-I e linfociti-T killer

MHC di classe II e le cellule presentanti l’antigene (antigen presenting, APC)

• Le MHC di classe 2 presentano

antigene sulla superficie di cellule

fagocitanti (APC)

CELLULA T

HELPER

CD4

citochine

altri linfociti

13-18 residui

endocitosi

fagocitosi

Una particella estranea è fagocitata da macrofagi e cellule dendritiche

Una proteina estranea legata al recettore sulla superficie di linfociti-B

Cellule presentanti l’antigene (APC)

Linfociti B fagociti: macrofagi / cellule dendritiche

MHC-II e linfociti-T helper

KNGDSGGPGTNEDK

SNEDGKKKSGNPGNVD

determinanti

antigenici

epitopo

continuo

epitopo

discontinuo

Anticorpi come strumenti di ricerca

idrofobico polare

Indovina il determinante antigenico

MVRGITVLAAVALMVGANNIPKLVPDDHYVNRVVGGQEAEE

GSAPYQVSLQVALWGHNQGGSILSERWVLTAAHCLVGTDAE

ELEVLVGTNSLKEGGQRYKADKLLYHSRYNSPQFHNDIGLV

RLATPIKFSSTVKSIEYSENVVPVNATVRLTGWGRTSAGGS

VPTKLQTIDLRTLSNEDGKKKSGNPGNVDIGHVVTLTRTGE

GAKNGDSGGPGTNEDKVIGVVNFGVPCALGYPDGFARVSYY

HDWIRTTIRNN

MVRGITVLAAVALMVGANNIPKLVPDDHYVNRVVGGQEAEE GSAPYQVSLQVALWGHNQGGSILSERWVLTAAHCLVGTDAE ELEVLVGTNSLKEGGQRYKADKLLYHSRYNSPQFHNDIGLV RLATPIKFSSTVKSIEYSENVVPVNATVRLTGWGRTSAGGS VPTKLQTIDLRTLSNEDGKKKSGNPGNVDIGHVVTLTRTGE GAKNGDSGGPGTNEDKVIGVVNFGVPCALGYPDGFARVSYY HDWIRTTIRNN

Produzione di anticorpi

Antigen prediction

SPPS

Link to carrier (e.g. albumin) (inject with

adjuvant)

Affinity Cromatography

With Immobilized

antigen

immunoassay

with antigen

Produzione di anticorpi monoclonali

MEDIUM

Elettro blot

Utilizzo di anticorpi come strumenti per la ricerca - WESTERN BLOT

elettrodo

elettrodo

blot a capillarità

anticorpo specifico

di coniglio

anticorpo anti Fc

di coniglio legato a

un enzima

substrato prodotto colorato

Tipi di blotting

Northern

Southern

We

ste

rn

Southern: identifica un filamento di DNA

blot utilizzando DNA complementare

(es. identificare/isolare geni da DNA

genomico)

Northern: identifica un filamento di RNA

blot utilizzando DNA complementare

(es. determinare il livello di trascrizione

di un gene)

Western: identifica una proteina utilizzando un

blot anticorpo specifico

(es. determinare il livello di espressione

di una proteina).

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELISA indiretto e a sandwich

colore colore

Anticorpi come strumenti di ricerca

Western blot

(SDS-PAGE)

saggi ELISA

Epitopo + Ig elevata affinità e selettività

interazione

separazione

identificazione

diagnostica

Identificazione dell’antigene

sperimentale

Dot blot

(cromatografia)

t

I

controllo positivo

colonne di affinità

Glossario

Antigene: macromolecola capace di reagire con i prodotti del sistema

immunitario

Determinante antigenico: Piccola parte di antigene che lega un anticorpo specifico.

(detto anche epitopo). Una singola molecola di antigene può contenere diversi epitopi

riconosciuti da anticorpi differenti.

Antigenicità: Capacità dell'antigene di combinarsi specificamente con un

(specificità antigenica) anticorpo

Immunogenicità Capacità dell'antigene di indurre una risposta immunitaria

(potere "immunogeno“):

Aptene: piccola molecola (<10 kDa) antigenica ma non immunogena.

Diventa immunogena se legata a macromolecola carrier

Adiuvante: sostanza in grado di stimolare e aumentare la risposta ad un

antigene, senza manifestare essa stessa proprietà antigeniche.

Anticorpi policlonali: miscela di anticorpi diversi fra loro ottenuti dall’ immunizzazione

di un animale con un antigene che contiene diversi epitopi. Ogni

anticorpo deriva da un diverso clone di cellule B.

Anticorpi monoclonali: anticorpi identici fra loro prodotti da linee cellulari provenienti da

(mAb) un solo clone di cellule B (isolate specificatamente). I linfociti B

sono immortalizzati fondendoli con cellule trasformate (ibridomi)