Analisi molecolare

dei geni

Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA

100°C

Si rompono i legami idrogeno

Denaturazione del DNA

Rinaturazione per riassociazione delle

sequenze complementari

Ogni frammento di DNA ha una caratteristica temperatura di fusione (Tm-> melting temperature)

Tm-> temperatura alla quale meta’ delle molecole di DNA sono denaturate in singoli filamenti

Maggiore e’ il contenuto delle G C, maggiore e’ la Tm

…

Effetto ipercromico delle basi nucleotidiche, all’aumentare della separazione dei due

filamenti aumenta la OD a 260nm

Applicazioni sperimentali della complementarietà delle basi

Le cinetiche di riassociazione suggeriscono che il DNA umano e’formato da:

fast

intermediate

slow

Cinetica di rinaturazionedel genomaumano

Fast: DNA altamente ripetuto, presente in numerose copie (trasposoni inattivi, copie geniche inattive, ripetizione di sequenze semplici, sequenze ripetute in tandem, duplicazioni segmentali)

Intermediate: DNA mediamente ripetuto

Slow: DNA presente in sequenze uniche

Composizione del genoma umano

PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione a

catena della polimerasi)

Gene a sequenza nota

La PCR permette l’amplificazione di un milione di volte o piu’ di una sequenza specifica di DNA che e’ gia’ nota o di cui sono note delle piccole sequenze all’estremita’ del gene

1 2

La possibilita’ di conoscere i geni deriva dalla capacita’di manipolarli:

-isolare un gene (enzimi di restrizione)-clonaggio (amplificazione) vettori-sequenziamento-funzione

VETTORE PLASMIDICO-si replica autonomamente rispetto al cromosoma batterico

-possiede un polylinker

-possiede un marcatore di selezione

Vettore di espressione

Oligonucleotidi o primers

Oligonucleotidi o primers

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reazione 2n dove n=numero di cicliSi possono ottenere informazioni sulla sequenza a partire da ridottissime quantita’ di DNA come sangue, capelli, etc

DNA polimerasidNTPMg2+

Southern/Northern Blot

Ibridazione con sonda di DNA

- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA

CERCANDO

- PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO

NEI CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)

- PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE

- PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON

OSSERVABILI CON ALTRE TECNICHE)

- PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O

NEL TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET

RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) polimorfismo dovuto a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati dalla presenza o assenza di un sito di restrizione

DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENIAnemia falciforme

Applicazione del DNA ricombinante: Diagnosi dell’anemia falciforme tramite Southern Blot

La mutazioneabolisce il sito MstII

Ibridazioni in situ

Il sequenziamento del DNA (Sanger)

Determinazione della sequenza nucleotidicadel DNA

il metodo di il metodo di SangerSanger 22’’--33’’DIDEOSSINUCLEOTIDIDIDEOSSINUCLEOTIDI

Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide

* Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)

** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta

DNA stampoDNA polimerasidNTPprimer marcato

SequenziamentoSequenziamento del DNA: del DNA: il metodo di il metodo di SangerSangerpozzetti

autoradiogramma

Si legge la sequenza mano mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) all’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento stampo.

ddNTP marcati con fluorofori

cromatogramma

Mappe fisiche di molecole di DNA basate su taglio di enzimi di restrizione (Mappe di Restrizione)

Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNAriconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici e con una sequenza ben precisa.

Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che i batteri utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo

Frammenti di restrizione

La mobilita’ di ciascun fammento e’ inversamente proporzionale al logaritmo della sua lunghezza

Mappe di restrizione

Rappresentano delle mappe fisiche del DNA in cui i siti di restrizione fungono da marcatori. Forniscono le reali distanze in coppie di basi tra 2 geni

elettroforesi

A COSA SERVE L’ANIMALE TRANSGENICO?

• RIPRODUZIONE DI MODELLI DI MALATTIE UMANE IN TOPI

• ANALISI IN VIVO DELLA FUNZIONE O MANCANZA DI UN GENE

(analisi di ridondanza, fenotipica, sviluppo etc.)

• DETERMINAZIONE DI APPROCCI FARMACOLOGICI IDONEI

SPERIMENTABILI SU ANIAMALI CHE RIPRODUCONO LA

PATOLOGIA UMANA

• ANIMALE TRANSGENICO COME “BIOREATTORE” O

PRODUTTORE DI PROTEINE UMANE DA POTER PURIFICARE E

USARE COME FARMACO

fondatori

fondatori

progenie

Animali transgenici

MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI

ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI

blastocisti

Cellule embrionali

PROPRIETA’ DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI (ES)

• Possono dividersi illimitatamente in modo simmetrico senza differenziare

• Mantengono un normale corredo cromosomale

• Producono cellule di tipo ecto-meso ed endodermico

• Si integrano in tutti i tessuti fetali durante lo sviluppo

• Colonizzano la linea germinale per originale le cellule delle gonadi

• Sono clonogeniche, ovvero da una singola cellula si origina una colonia di cellule geneticamente identiche

• Esprimono il fattore di trascrizione Oct-4, che attiva una serie di geni che mantengono la cellula in uno stato proliferativo e indifferenziato

• Posono essere indotte a proliferare o differenziare

• Spendono la maggior parte del loro ciclo cellulare nella fase S e non necessitano di stimoli esterni per proliferare

• Non mostrano inattivazione dell’X

Vantaggio nell’uso delle ES

- Possono essere sottoposte a diverse manipolazioni genetiche prima di reiniettarle nella blastocistiricevente

- Il transgene puo’ essere coespresso insieme ad un gene marcatore (neo) che consente di selezionare solo le cellule contenenti il transgene(importante soprattutto nei casi di mutagenesimirata in cui deve avvenire ricombinazioneomologa)

a

b

Progenie con cellule germinali portatrici del transgene

Eredita’ mendelianadel transgene

Cellule germinali aploidi

50% + 50% -

Come introdurre il transgenenella cellula zigote o nelle

cellule staminali embrionali?•INIEZIONE NEL PRONUCLEO DI PLASMIDI

INEFFICIENTE E COSTOSO

• ONCORETROVETTORI MoMLV

SILENZIAMENTO DEL VETTORE DURANTE LO SVILUPPO

• LENTIVETTORINON SOGGETTI A SILENZIAMENTO