Lezione XIV. Analisi molecolare dei geni...PRODUTTORE DI PROTEINE UMANE DA POTER PURIFICARE E USARE...
Transcript of Lezione XIV. Analisi molecolare dei geni...PRODUTTORE DI PROTEINE UMANE DA POTER PURIFICARE E USARE...
Analisi molecolare
dei geni
Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA
100°C
Si rompono i legami idrogeno
Denaturazione del DNA
Rinaturazione per riassociazione delle
sequenze complementari
Ogni frammento di DNA ha una caratteristica temperatura di fusione (Tm-> melting temperature)
Tm-> temperatura alla quale meta’ delle molecole di DNA sono denaturate in singoli filamenti
Maggiore e’ il contenuto delle G C, maggiore e’ la Tm
…
Effetto ipercromico delle basi nucleotidiche, all’aumentare della separazione dei due
filamenti aumenta la OD a 260nm
Applicazioni sperimentali della complementarietà delle basi
Le cinetiche di riassociazione suggeriscono che il DNA umano e’formato da:
fast
intermediate
slow
Cinetica di rinaturazionedel genomaumano
Fast: DNA altamente ripetuto, presente in numerose copie (trasposoni inattivi, copie geniche inattive, ripetizione di sequenze semplici, sequenze ripetute in tandem, duplicazioni segmentali)
Intermediate: DNA mediamente ripetuto
Slow: DNA presente in sequenze uniche
Composizione del genoma umano
PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione a
catena della polimerasi)
Gene a sequenza nota
La PCR permette l’amplificazione di un milione di volte o piu’ di una sequenza specifica di DNA che e’ gia’ nota o di cui sono note delle piccole sequenze all’estremita’ del gene
1 2
La possibilita’ di conoscere i geni deriva dalla capacita’di manipolarli:
-isolare un gene (enzimi di restrizione)-clonaggio (amplificazione) vettori-sequenziamento-funzione
VETTORE PLASMIDICO-si replica autonomamente rispetto al cromosoma batterico
-possiede un polylinker
-possiede un marcatore di selezione
Vettore di espressione
Oligonucleotidi o primers
Oligonucleotidi o primers
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reazione 2n dove n=numero di cicliSi possono ottenere informazioni sulla sequenza a partire da ridottissime quantita’ di DNA come sangue, capelli, etc
DNA polimerasidNTPMg2+
Southern/Northern Blot
Ibridazione con sonda di DNA
- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA
CERCANDO
- PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO
NEI CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)
- PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE
- PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON
OSSERVABILI CON ALTRE TECNICHE)
- PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O
NEL TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET
RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) polimorfismo dovuto a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati dalla presenza o assenza di un sito di restrizione
DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENIAnemia falciforme
Applicazione del DNA ricombinante: Diagnosi dell’anemia falciforme tramite Southern Blot
La mutazioneabolisce il sito MstII
Ibridazioni in situ
Il sequenziamento del DNA (Sanger)
Determinazione della sequenza nucleotidicadel DNA
il metodo di il metodo di SangerSanger 22’’--33’’DIDEOSSINUCLEOTIDIDIDEOSSINUCLEOTIDI
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide
* Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)
** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta
DNA stampoDNA polimerasidNTPprimer marcato
SequenziamentoSequenziamento del DNA: del DNA: il metodo di il metodo di SangerSangerpozzetti
autoradiogramma
Si legge la sequenza mano mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) all’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento stampo.
ddNTP marcati con fluorofori
cromatogramma
Mappe fisiche di molecole di DNA basate su taglio di enzimi di restrizione (Mappe di Restrizione)
Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNAriconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici e con una sequenza ben precisa.
Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che i batteri utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo
Frammenti di restrizione
La mobilita’ di ciascun fammento e’ inversamente proporzionale al logaritmo della sua lunghezza
Mappe di restrizione
Rappresentano delle mappe fisiche del DNA in cui i siti di restrizione fungono da marcatori. Forniscono le reali distanze in coppie di basi tra 2 geni
elettroforesi
A COSA SERVE L’ANIMALE TRANSGENICO?
• RIPRODUZIONE DI MODELLI DI MALATTIE UMANE IN TOPI
• ANALISI IN VIVO DELLA FUNZIONE O MANCANZA DI UN GENE
(analisi di ridondanza, fenotipica, sviluppo etc.)
• DETERMINAZIONE DI APPROCCI FARMACOLOGICI IDONEI
SPERIMENTABILI SU ANIAMALI CHE RIPRODUCONO LA
PATOLOGIA UMANA
• ANIMALE TRANSGENICO COME “BIOREATTORE” O
PRODUTTORE DI PROTEINE UMANE DA POTER PURIFICARE E
USARE COME FARMACO
fondatori
fondatori
progenie
Animali transgenici
MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI
ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI
blastocisti
Cellule embrionali
PROPRIETA’ DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI (ES)
• Possono dividersi illimitatamente in modo simmetrico senza differenziare
• Mantengono un normale corredo cromosomale
• Producono cellule di tipo ecto-meso ed endodermico
• Si integrano in tutti i tessuti fetali durante lo sviluppo
• Colonizzano la linea germinale per originale le cellule delle gonadi
• Sono clonogeniche, ovvero da una singola cellula si origina una colonia di cellule geneticamente identiche
• Esprimono il fattore di trascrizione Oct-4, che attiva una serie di geni che mantengono la cellula in uno stato proliferativo e indifferenziato
• Posono essere indotte a proliferare o differenziare
• Spendono la maggior parte del loro ciclo cellulare nella fase S e non necessitano di stimoli esterni per proliferare
• Non mostrano inattivazione dell’X
Vantaggio nell’uso delle ES
- Possono essere sottoposte a diverse manipolazioni genetiche prima di reiniettarle nella blastocistiricevente
- Il transgene puo’ essere coespresso insieme ad un gene marcatore (neo) che consente di selezionare solo le cellule contenenti il transgene(importante soprattutto nei casi di mutagenesimirata in cui deve avvenire ricombinazioneomologa)
a
b
Progenie con cellule germinali portatrici del transgene
Eredita’ mendelianadel transgene
Cellule germinali aploidi
50% + 50% -
Come introdurre il transgenenella cellula zigote o nelle
cellule staminali embrionali?•INIEZIONE NEL PRONUCLEO DI PLASMIDI
INEFFICIENTE E COSTOSO
• ONCORETROVETTORI MoMLV
SILENZIAMENTO DEL VETTORE DURANTE LO SVILUPPO
• LENTIVETTORINON SOGGETTI A SILENZIAMENTO