CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI

Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni)sara.caldarola@uniroma2.it

ORARIO di RICEVIMENTO:

Mercoledi 11:00-12:00

Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni,

appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

ANIMALI TRANSGENICI : definizione

ANIMALI TRANSGENICI : come si producono???

Vettori retroviraliMicroiniezione del DNA

Cellule staminali embrionaliGene targeting/ gene trap

KO condizionaliTrasferimento del nucleo

GFP

1) VETTORI RETROVIRALI

Permettono il trasferimento e l’integrazione di materiale genetico nella cellula ospite

Vantaggi dei vettori non virali• Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni• Riduzione del rischio di reazione immunitaria• Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di

trasdurre molecole di DNA anche molto grandi• Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo

Svantaggi dei vettori non virali• Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione • Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Vantaggi dei vettori virali

Svantaggi dei vettori virali• Alta efficienza di trasduzione

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite

• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)

• Molecole di DNA di dimensioni limitate• Reazioni immunitarie• Costi elevati

VETTORI VIRALI

Ciclo vitale di un retrovirus• genoma a RNA, 2 copie

• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nelcitoplasma della cellula infetta.

• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus.

• L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.

• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

Lunga sequenza terminale ripetuta

Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside

Proteina strutturale capside

Trascrittasi inversa e integrasi

Proteina per involucro

Genoma retrovirale

Vettore retrovirale

Lunghezza massima: 8Kb

Inserito nelle cellule eucariotiche

con bassissima efficienzatramite

trasfezione/elettroporazioneCon alta efficienza

Mediante INFEZIONE

•Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione•Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR)•Infettano facilmente cellule in attiva replicazione•Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX

INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURAE PRODUZIONE GENE X

Packaging cell lines

Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.

La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione.

Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

Utilizzo vettori retrovirali:

TERAPIA GENICATecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente

Scopo:• Correggere un difetto genetico• Fornire una nuova funzione alla cellula

Applicabilità:1. Malattie genetiche classiche(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)2. Malattie multigeniche (cancro)3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)4. Malattie non genetiche80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA

• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteinaterapeutica (a livelli adeguati).• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale opost-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico• Non dovrebbe essere patogeno.• Amministrabile direttamente nel paziente.• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Ben tollerato.• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.• Facile da produrre in maniera riproducibile.

IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

ANIMALI TRANSGENICI : come si producono???

Vettori retroviraliMicroiniezione del DNA

Cellule staminali embrionaliGene targeting/ gene trap

KO condizionaliTrasferimento del nucleo

YAC

GFP

2) MICROINIEZIONE del DNA

Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali

totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35)

Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sonomicroiniettati con DNA lineare contenente

il transgene (circa 200 copie) all’interno del pronucleo maschile

Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantatiin una madre adotttiva resa pseudogravida da maschiovasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi.

Accoppiamento e analisi progenie per capire se integrazione

è nella linea somatica o germinale

Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA

Al max 5% degli ovuli inoculatigenera prole transgenica!!!

ANIMALI TRANSGENICI : come si producono???

Vettori retroviraliMicroiniezione del DNA

Cellule staminali embrionaliGene targeting/ gene trap

KO condizionaliTrasferimento del nucleo

GFP

2) Cellule staminali embrionali (ES cells)

Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

• CALCIO FOSFATOCALCIO FOSFATO

• Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule

•LIPOSOMILIPOSOMI

• Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana

•ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONE

IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENEintegrato nel sito corretto

SELEZIONE POSITIVA/NEGATIVA

PCR

• Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando “buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno

IntegrazioneSito specifica

RICOMBINAZIONEOMOLOGA

SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES

Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio

TRANSGENE di interesse

Gene che conferisce resistenza alla G418

Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA

ASPECIFICA

SPECIFICA

1) Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA2) Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVAnon è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells

in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

PCR

ASPECIFICASPECIFICA

Il GENE TRAPPING

1) Consente l’isolamento di nuovi geni

2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato

3) È mutagenico: produce knockout

X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap

insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

STRATEGIA DEL STRATEGIA DEL GENE TRAPGENE TRAP

Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento

Selezione dei cloni tramite “marker”

Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato

ANALISI DEL FENOTIPO

ELEMENTI necessari per ELEMENTI necessari per gene trapgene trap::

• Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo

• “Entrapment vector” contenente : - gene reporter - marker di selezione

• Cellule staminali embrionali di Topo

SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENEintegrato nel sito corretto

IntegrazioneSito specifica

• Geni reporter

• The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal)

• The firefly luciferase gene• The jelly fish green flourescence protein

(GFP) gene

“Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza

della beta-galattosidasi sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.

Elementi importantiElementi importantiper espressione di un gene e per espressione di un gene e

utilizzati per il utilizzati per il GENE TRAPPINGGENE TRAPPING

Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene

Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionaledi un promotoredi un promotore

• Enhancer trap Vector• Promoter trap V.• Gene trap V.

Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING

Enhancer

DNA

RNA

protein PROTEIN XPROTEIN X β-gal NeoR

PromotoreMINIMO lac Z

P'

pApA

Endogenous gene X

Vector Integration

Vector

neo

EnhancerEnhancer Trap Trap

Exon 1 Exon 2 Exon 3

PromotoreMINIMO lac Z neo

lac Z neo

Promotore e pAINDIPENDENTI

Endogenous gene X

lac ZpA

P'

neopA

Vector Integration

DNA

RNA

protein β-gal NeoR

PromoterPromoter Trap Trap

PROTEIN XPROTEIN X

lac Z

lac Z

neo

neo

Vector

PROMOTOREPromotoreASSENTE

Promotore e pAINDIPENDENTI

SA

Endogenous gene X

SA pA

P'

pA

Vector Integration

DNA

RNA

protein

Spliced transcript

β-gal NeoR

GeneGene Trap Trap

SA

PROTEIN XPROTEIN X

Vector

lac Z neo

lac Z neo

lac Z neo

PromotoreASSENTE

Introne gene X

Promotore e pAINDIPENDENTI

Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

RICAPITOLANDO…………..

Il GENE TRAPPPING consente

1)Identificazione NUOVI GENI2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)3)ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI