ANIMALI TRANSGENICI

ANIMALI TRANSGENICI

Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso ad altre specie.

MICROINIEZIONE DI DNA

INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato. Più precisamente, si depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA che contengono circa 100-200 copie del gene da inserire. A monte del gene(cDNA) da trasferire nel pronucleo si utilizza una sequenza promotore che conferisce al gene la specificità di espressione in un particolare tessuto

MICROINIEZIONE DI DNAE PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI

Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” ( mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici ; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

MICROINIEZIONE DI DNA E MICROINIEZIONE DI DNA E PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICIPRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI

Dennis Roop and c-Myc

Myc è un oncogene che attiva la trascrizione dei geni di stimolo di sviluppo;quando viene espresso altera la funzione usuale dello sviluppo e della proliferazione di controllo delle cellule

Studio del ruolo di c-Myc nella carcinogenesi

Creazione di topi transgenici Inserimento di c-Myc umano in topo Overexpression di c-Myc nell’epidermide Risultati esperimento:

-aumento di crescita cellulare

-inibizione della differenziazione

TOPI KNOCK–OUT

I topi knock–out sono divenuti molto utili nel contribuire a capire il genoma umano ed il relativo ruolo nelle malattie. Generando un knock-out è stato dimostrato che è possibile mirare l’inserimento del gene in una posizione precisa del genoma del topo; ciò dà la possibilità di eliminare un gene specifico con un allele inattivo o mutato. Di conseguenza gli animali Knock-out sono considerati una tecnica investigativa che tiene conto dell’eliminazione di un gene in particolare, nel tentativo di definire che effetto ha nell’organismo

CLONAGGIO DEL DNA

PLASMIDI

I Plasmidi sono elementi genetici extra-cromosomici che si replicano nelle cellule batteriche autonomamente. Il loro DNA è circolare e a doppia elica.I plasmidi usati negli esperimenti di clonaggio derivano tutti da plasmidi trovati in natura che sono stati “ingegnerizzati” in modo da presentare caratteristiche che facilitino il clonaggio di geni. I più usati sono i plasmidi di E.Coli.

Caratteristiche dei plasmidi

Una sequenza ORI che permette al plasmide di replicarsi nelle cellule di E.Coli in quanto viene riconosciuta dagli enzimi di replicazione della cellula ospite

Deve avere un marcatore selettivo, che renda le cellule di E.Coli contenenti il plasmide, facilmente distinguibili dalle cellule che non lo contengono; uno dei marcatori più usati è il gene amp che conferisce la resistenza all’ampicillina

Deve avere anche un sito di taglio per un enzima di restrizione in modo che lo si possa aprire per inserire il frammento di DNA esogeno

INSERIMENTO DEL DNA DA CLONARE

CELLULE ES

Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

RICOMBINAZIONE OMOLOGA

INIEZIONE DEL DNA RICOMBINATO

Le cellule staminali che hanno integrato nel loro genoma il DNA ricombinato, vengono iniettate in un embrione isolato in stadio precoce di sviluppo.

L’embrione precoce, composto parzialmente da cellule ES, viene introdotto nell’utero di una femmina pseudogravida.

Il topo “chimera” che si sviluppa da questo embrione conterrà alcune cellule somatiche portatrici del gene alterato e conterrà anche cellule della linea germinale che portano il gene modificato.

TOPO CHIMERA INCROCIATO CON TOPO NORMALE

1. Il topo “chimera” verrà incrociato con un topo normale e alcuni discendenti (2 su dieci) avranno un gene modificato in tutte le loro cellule ( eterozigosi).

2. Incrociando tra loro questi topi portatori del gene modificato si ottiene qualcuno dei discendenti contenente 2 geni alterati in tutte le sue cellule (omozigosi ).

3. Se l’alterazione genica originale inattiva completamente la funzione genica si avranno allora dei topi ad “eliminazione” (Knock-out) cioè ceppi di topi che hanno un certo gene inattivato definitivamente.

TECNICA KNOCK - OUT

USO DEL KNOCK-OUT NELLA COLORAZIONE DEL PELO DI TOPO

Le cellule ES utilizzate hanno uno “STRAIN” con pelo di colore bianco Dopo che tali cellule sono state inserite in una blastocisti, esse si divideranno

in molti tessuti differenti. Se il risultato è un topo che il pelo con macchie bianche e macchie nere vuol dire che l’iniezione di cellule ES è riuscita. Dopo l’individuazione dei topi che hanno avuto contributi da entrambi i tipi di cellule, si ha la trasmissione della germ-line per cui dall’incrocio di questi topi eterozigoti con il pelo a chiazze avremo la nascita di topi Knock-out con il pelo nero ( quindi genotipo omozigote)

TECNICA “CONDITIONAL KNOCK-OUT”

Lo scopo dei Knock-out condizionali è eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo.

VANTAGGI:

-topi Knock-out conditional sopravvivono più a lungo

-i metodi sono anche più precisi

Il sistema di Recombinase Cre-Lox

Metodo knock-out conditional piu’ usato. Si basa sull’azione del recombinase che è un enzima che funziona

come le forbici tagliando un frammento di DNA inserito fra due siti LOX recombinase specifici. Poiché questo enzima è espresso soltanto in determinati tipi cellulari, il gene designato sarà eliminato soltanto da tali cellule. Quindi questa metodica è basata su un’inattivazione tessuto-specifica del gene bersaglio. In una prima fase avviene la descrizione del luogo d’interesse :il frammento di DNA compreso tra siti Lox. Successivamente avviene la costruzione del vettore bersaglio, la ricombinazione omologa in cellule ES, l’iniezione nell’embrione ad uno stadio precoce e la generazione del topo chimera. Quest’ultimo, contenete i siti Lox recombinase-specifici, verrà incrociato con un topo CRE positivo, cioè che esprime l’enzima recombinase in un tessuto specifico. L’espressione tessuto-specifica del recombinase permette l’inattivazione del gene d’interesse soltanto nel tessuto in cui la recombinase è espressa.