Laboratorio Professionalizzantedi Spettroscopia

Prof. Lorenzo Stella

Settore 5 Livello 1 Stanza 4

Tel.: 06-7259-4463

E-mail: stella@stc.uniroma2.it

La luminescenzaLuminescenza: emissione di luce da atomi, molecole o cristalli

eccitati elettronicamente.

Eccitazione luminosa:

~ns:fluorescenza

~ms:fosforescenza

Eccitazione chimica:Chemiluminescenza

Spettroscopia di fluorescenza:Vantaggi sperimentali

Elevatissima sensibilità (fino alla singola molecola).Flessibilità di campionamento (anche misure “in vivo”).Basso costo e semplicità della strumentazione.

Informazioni ottenibiliConcentrazione della sonda fluorescente (fluoroforo), fino a nM.

Ambiente chimico ed accessibilità al solvente del fluoroforo.

Dinamica dell’ambiente del fluoroforo.

Dinamica conformazionale e diffusionale della (macro)molecola fluorescente (nei ps-ns).

Numero e popolazione di specie presenti in soluzione.

Distanza tra due fluorofori

Alcuni esempi:•Processi di associazione, transizioni conformazionali, transizioni di fase, struttura di peptidi, dinamica di proteine, rilascio di farmaci, sensori e biosensori, pH intracellulare, imaging di cellule, etc. …

Il diagramma di Jablonski

ConseguenzeStokes shift (spostamento ad energie più basse).Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione).Regola dell’immagine speculare.Sensibilità alla dinamica.

Tempo di vita dello stato eccitato

kr= costante di decadimento radiativo

kn.r.= costante di decadimento attraverso i processi non radiativi

N*= numero di molecole nello stato eccitato

dN *

dt (kr knr )N *

dN *

N * (kr knr )dt

dN *

N *N0

*

N*

(kr knr ) dt0

t

lnN *

N 0*

(kr knr )t

N *

N 0*e (kr knr ) t

N * N 0*e (kr knr ) t

t

I

I kr N *

I I0e

t

1

kr knr

tempo di vita

Fluorofori

Tutte le molecole assorbono.

In fase condensata (solidi, soluzione) sono fluorescenti solo molecole con probabilità di transizione radiativa molto elevata: sistemi ad elevata coniugazione.

Vantaggio per la sensibilità e la selettività della tecnica.

Il fluorimetroLampada

Monocromatore di eccitazione

Beam splitter

Lente

Lente

Monocromatore di emissione

ecc.

ecc.

Campione

PMT“segnale”

PMT“riferimento”

Computer

Osservabili: intensitàDipende da:

Concentrazione di fluoroforoEfficienza dell’assorbimento di radiazione ()Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)

resa quanticafotoni emessi

fotoni assorbiti

decadimenti radiativi

totale decadimenti

kr

kr knr

F fotoni emessi = (fotoni assorbiti)

(I0 ' I ') (I0 ' I0 '10 A ' ) (1 10 A ' )

per A '1

(1 10 A ' )A ' ln10

F A C l

F A C l

Ecc.

Em.

10 A 10 A A0

ddA

(10 A )

A0

A 1 A ddA

e ln(10 A )

A0

1 Ad

dAe A ln10

A0

1 A ln10e A ln10 A0

1 Aln10

1 10 A A ln10

Osservabili: intensità e resa quantica

F

A0

F0

A0

F

A

A0

F0

0

F

A0

F0

A0

F

A

A0

F0

0

•L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da:

•Intensità della lampada•Efficienza dei monocromatori•Banda passante utilizzata•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore

•Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata

•Al contrario,•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]•la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]

Filtro interno

Ecc.

Em.

Ecc.

Em.

Campione diluito Campione concentrato

F I(centro cella )I010 A (ecc . )

2

A(ecc. )0.03 10 0.03

2 0.97

Assorbanza contro fluorescenza

Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)•Sensibilità alla dinamica.

Osservabili: spettro di emissioneecc. fissa.

em. variabile.

F in funzione di em..

Rilassamento del solvente

H2OEtOHDMFc-Hex

Eh h

S0

S1 S1’

S0’

Ass.Em.

Esempi

Osservabili: spettro di eccitazioneem. fissa.

ecc. variabile.

F in funzione di ecc..

Se:unico fluoroforo

indipendente da ecc.

(unico stato eccitato).A<<1

Allora F(ecc.) A(ecc.)

•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

Smorzamento della fluorescenza (quenching)

Alcune molecole (quenchers), se si trovano in prossimità del fluoroforo eccitato, sono in grado di causare il suo decadimento non radiativo.

Misurando l’efficienza di smorzamento della fluorescenza si può determinare l’accessibilità del fluoroforo al quencher.

][1][1

][1

][][1

][

][

00

0

00

0

0

QKQk

k

Qk

kQ

k

k

k

kk

k

Qkkk

Qkkk

k

Qkkk

r

q

r

q

r

q

r

nrr

r

qnrr

qnrr

r

qnrnr

F0

F1K[Q ]

1a Esperienza

Spettri di assorbimento, emissione ed eccitazione.

Intervallo di dipendenza lineare di F da C.

Solvatocromismo

Processi di associazione

Il fluoroforo: PRODAN

d = 2.8 Debye

d = 10 Debye

6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene(PRODAN)

H2OEtOHDMFc-Hex

Le ciclodestrine

•Molecole cicliche formate da unità glucopiranosio (6, 7, 8).

•Si ottengono per conversione enzimatica dell’amido.

Complessi di inclusione• La struttura 3-D delle ciclodestrine è a

tronco di cono, con una cavità apolare.• In soluzione acquosa formano complessi di

inclusione con molecole idrofobe.• Questa proprietà viene utilizzata per

modificare le proprietà della molecola ospite:

– solubilità– volatilità– tossicità– resistenza alla biodegradazione.

• I complessi di inclusione hanno inoltre molteplici applicazioni in campo catalitico e separativo.

• Poiché la ciclodestrina è chirale, i complessi di inclusione sono enantioselettivi.

Complessazioneciclodestrina-PRODAN

0

5

10

15

0 20 40 60 80 100 120

F-F

0

[-CD] (mM)

Applicazione: sensori a fluorescenza.