IL CALCIO COME MESSAGGERO

INTRACELLULARE

• Ca2+ è un messaggero intracellulare universale

• Ca2+ è coinvolto nella regolazione specifica e selettiva di processi cellulari (contrazione muscolare, fecondazione, trasmissione sinaptica, sopravvivenza, divisione, differenziamento e movimento cellulare, coagulazione, etc.)

• Ca2+ non può essere visualizzato direttamente

• per misurare variazioni di Ca2+ si usano specifiche molecole con proprietà ottiche particolari che si modificano a seguito del legame con Ca2+

mitER

N

canali

PMCAe

Na/Ca

Ca2+ 100 nM

CaBPr

Ca2+ 2 mM

IP3RRyR

SERCA

CaBPr

CaBPr

5.10

Il calcio intracellulare è altamente compartimentalizzato:la sua concentrazione nel citosol è mantenuta molto bassa a spese di energia

permeazione passiva: canali del calcio

permeazione attiva: antiporto Na/Ca e pompe (PMCA e SERCA)

TECNICHE DI FLUORESCENZA

La fluorescenza è il risultato di un processo a tre stadi che si verifica in molecole chiamate fluorofori o coloranti fluorescenti o sonde

stadio 1 – eccitazione

stadio 2 – stato eccitato

stadio 3 – emissione di fluorescenza

DIAGRAMMA DI JABLONSKI

stato di riposo

stato elettronico eccitato

eccitazione

emivita della stato eccitato(10-9-10-8 s)

emissione di fluorescenza

efficienza quanticaefficienza quantica

fotoni emessi (stadio 3)

fotoni assorbiti (stadio 1)

stato elettronico eccitato

SPETTRO DI FLUORESCENZA

STRUMENTAZIONE

Sistemi di rivelazione della fluorescenzasorgente di eccitazionefluoroforofiltri

rivelatore

Tipi di strumentispettrofluorimetromicroscopio in fluorescenzacitometro a flusso

CRITERI DI SELEZIONE degli indicatori di calcio

• intervallo di interesse della concentrazione di Ca2+ (costante di dissociazione Kd; risposta misurabile 0.1Kd to 10Kd)

• modalità di misura (dati qualitativi vs. quantitativi, tipo di strumento, sorgente di rumore etc.)

• intensità della fluorescenza emessa dall’indicatore• registrazione simultanea di altri parametri biologici

DIAGRAMMA SCHEMATICO DEL METODO DI CARICAMENTO DEL FLUOROFORO: UTILIZZO

DELL’ACETOSSIMETIL (AM) ESTERE

PROBLEMI:compartimentazioneidrolisi incompleta dell’AM estereperdita di fluoroforo

INDICATORI FLUORESCENTI ECCITATI DA LUCE UV

• Fura-2, Indo-1 and derivati• Quin-2 and derivati• indicatori con affinità intermedia (Fura-

4F, Fura-5F & Fura-6F; Benzothiaza-1 & Benzothiaza-2)

• indicatori a bassa affinità (Fura-FF, BTC, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, Mag-Indo-1)

Fura-2 • eccitazione a 340 e 380 nm.• emissione at 510 nm • [Ca2+] dipende dal rapporto

Ex340/Ex380, independentemente dalla concentrazione di fura-2 e da altri parametri esterniEx at 380 nm

Ex at 340 nm

Indo-1 • eccitazione a 380 nm• doppia emissione (400

e 475 nm)• [Ca2+ ] = rapporto tra

Em400 / Em475

indipendente dalla concentrazione di indo

CALIBRAZIONE RAZIOMETRICA

• utilizzabile solo con indicatori che presentano shift dello spettro di eccitazione o emissione

• intensità di fluorescenza misurata a due lunghezze d’onda (con variazioni opposte del segnale a seguito del legame con il Ca2+)

• elimina le variabili legate a concentrazione dell’indicatore, percorso ottico, intensità di eccitazione, efficienza di rilevazione

calibrazione raziometrica

esempio di calibrazione con fura-2 mediante utilizzo di ionoforo (ionomicina o simili)

[Ca]=Kd x (R-Rmin)/(R-Rmax) x Sf2/Sb2

Rmin=A1/A2

Rmax=B1/B2

Sf2/Sb2=A2/B2

INDICATORI ECCITATI DALLA LUCE VISIBILE - VANTAGGI

• possibilità di utilizzo con microscopia confocale laser

• minore autofluorescenza

• minor danno e scattering cellulare

• maggiore assorbanza

• compatibilità con composti caged

INDICATORI ECCITATI NEL VISIBILE

• Fluo-3, Rhod-2 e relativi derivati• indicatori a bassa affinità: Fluo-5N,

Rhod-5N, X-Rhod-5N e relativi derivati• Calcium Green, Calcium Orange e

Calcium Crimson• Oregon Green 488 BAPTA• Fura Red• Calcein

Fluo-3 • indicatore eccitato nel visibile (488 nm, sorgente laser Argon).

• emissione a 525 nm• non è raziometrico

Fluo-3 e Fura Red

• l’uso dei due indicatori risolve il problema della calibrazione Fluo-3 (aumento a 525 a seguito del legame con il Ca2+) e Fura Red (diminuzione a 650).

• entrambi eccitati a 488 nm.

• [Ca2+ ] dipende dal rapporto

Em del Fluo-3 / Em del Fura Red, independentemente dalla [indicatore].

neuroni di bulbo olfattivo di ranafluo3 e fura red

• risposta del Ca2+ a trattamento con KCl e nifedipina. l’immagine è il rapporto di immagini relative a fluo e fura red acquisite al microscopio confocale.

segnale di calcio attivato da recettori metabotropici glutamatergici in neurone

purkinje di cervelletto embrionale di topo

CONIUGATI DEGLI INDICATORI FLUORESCENTI

• coniugati con destrani– destrani con fura e indo– Calcium Green e Oregon Green 488 BAPTA

destrani• derivati lipofilici per il rilevamento del calcio sotto

membranario

– Fura-C18 e Calcium Green-C18

SETUP DI MICROSCOPIA CONFOCALE LASER (CLSM)

la CLSM consente di isolare sezioni ottiche di un preparato e di ricostruire tridimensionalmente le variazioni di calcio

50 s

bFGF

[Ca]i

control 100 ng/ml bFGF

1

32

INDICATORE BIOLUMINESCENTE

• la bioluminescenza è la produzione di luce operata da fotoproteine presenti in alcuni organismi

• la bioluminescenza non richiede illuminazione• l’intensità luminosa è generalmente bassa• L’equorina è una fotoproteina luminescente

isolata da una medusa• l’equorina non è esportata o secreta, ma

deve essere microiniettata nelle cellule

l’equorina ricombinante consente di misurare le variazioni di calcio in distretti intracellulari diversi (mitocondri, nucleo...)

•Photoproteins

•A Ca2+-induced conformational change of the apoprotein (depicted as a rod-shaped structure) leads to peroxidation of the coenzyme (the reduced form of the coenzyme coelenterazine is shown in black and the oxidized form, coelenteramide, is shown in dark blue), which results in the release of blue light (see figure, part A). Red circles represent the peroxide molecules.

GFP-based probes

In the case of cameleon, a Ca2+-induced interaction between calmodulin (CaM) and the CaM-binding peptide M13 increases fluorescence resonance energy transfer (FRET) leading to a decrease in the fluorescence of cyan fluorescent protein (CFP) and an increase in the fluorescence of yellow fluorescent protein (YFP) (see figure, part Ba). A similar FRET-based probe, FIP-CB, was constructed that measured the concentration of free Ca2+ as a decrease of FRET (not shown). For the camgaroo probe, the Ca2+-induced conformational change in CaM leads to an increase in the fluorescence of YFP (see figure, part Bb). The Ca2+-induced interaction between CaM and the binding peptide M13 of pericam leads to changes in the fluorescence characteristics of circularly permuted (cp)YFP (see figure, part Bc). A similar probe with circularly permuted enhanced green fluorescent protein (cpEGFP) has also been developed (not shown).

Sensitivity to pH is a bigger problem with GFP-based indicators than with synthetic dyes. With the synthetic dyes, pH has an effect on fluorescence and Ca2+ affinity only below about pH 6.5, whereas with most GFP-based probes, even pH changes around neutral can lead to marked changes in fluorescence. Finally, it is worth pointing out that the loss of signal (owing to photobleaching and/or photoisomerization) with protein dyes is more significant than with synthetic dyes, and that some GFPs have absorption spectra that are not suitable for standard confocal microscope laser lines.

Fig. 4. Targeting of GFP-based calcium sensors. CYT, cytoplasm; ER, endoplasmic reticulum; MT, mitochondria; NUC, nucleus; PM, plasma membrane; SGs, secretory granules.

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is a quantum mechanical phenomenon that occurs between a fluorescence donor and a fluorescence acceptor that are in molecular proximity of each other if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. Under these conditions, energy (E) is transferred non-radiatively from the donor to the acceptor with an efficiency defined by the equation, where r is the distance between the two fluorophores and R0 (Förster distance) is the distance at which 50% energy transfer takes place (typically 20–60 Å).

R0 is dependent on the extent of spectral overlap between the donor and acceptor, the quantum yield of the donor and the relative orientation of the donor and acceptor.

Excitation of a donor fluorophore in a FRET pair leads to quenching of the donor emission and to an increased, sensitized, acceptor emission. Intensity-based FRET detection methods include monitoring the donor intensity with or without acceptor photobleaching, the sensitized acceptor emission or the ratio between the donor and acceptor intensity. Methods that are based on fluorescence-decay-kinetics include determining the rate of donor photobleaching, the decrease of donor fluorescence lifetime or the appearance of new components in the acceptor decay kinetics.

DAR-4M AM • indicatore per NO eccitato nel visibile (568 nm, sorgente laser Argon).

• emissione a 585 nm• non è raziometrico

(Figura successiva) Schematic depiction of the structure and response mechanism of Cyclic AMP Fluorosensor (FlCRhR). Fluorescence resonance energy transfer from the fluorescein-labeled (Fl) catalytic subunit to the rhodamine-labeled (Rh) regulatory subunit is eliminated upon cAMP-dependent dissociation of the holoenzyme. The resulting increase of the 488 nm light–excited fluorescein (520 nm) to rhodamine (580 nm) emission ratio can be used to measure intracellular cAMP.