Post on 23-Jan-2021
GENERALITA’ GENERALITA’ SULLA SULLA SULLA SULLA
CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIAMarcello BaroniMarcello Baroni
COSA SONO LE TECNICHECROMATOGRAFICHE?
La cromatografia consiste nello sfruttare la diversa attitudine di ogni molecola o ione nel distribuirsi fra 2 fasi differenti.
Una fase viene immobilizzata su di un supporto (es. colonna) ed è perciò detta fase stazionaria, l’altra viene fatta scorrere sulla prima continuamente: fase mobile.prima continuamente: fase mobile.
processo dinamico
Fase mobile
Fase stazionaria
MolecolaMolecola
CM CSCM
CSK =
Ogni componente della miscela sarà in equilibrio fra le 2 fasi.
K = coefficiente didistribuzione
(diverso per ogni componente)
TECNICHE CROMATOGRAFICHE
Miscela F. mobile
La miscela, messa a
F. Staz.
Tappoporoso
F. mobile Proteine separate
La miscela, messa a contatto con le 2 fasi, si separerà sulla base delle diverse affinità di ciascun componente per tali fasi.
AA
A
A
B
B
CROMATOGRAFIA PER FILTRAZIONE SU GEL
Proprietà sfruttata:
DIMENSIONE delle molecole.
Log PM
t (s)
Ordine di uscita dei campioni opposto rispetto all’SDS-PAGE.
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
+ NaCl+ -
+
--
++-
++-- -
-+
+1a fase: legame
++-
-- --
2a fase: eluizione
Proprietà sfruttata: CARICA NETTA delle molecole.
ESEMPIO DI CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
Scambiatore di anioni forte:ammine quaternarie
TRIS 50 mMNaCl 100 mMEDTA 5 mMBenzamidina 10 mM
EQUILIBRAZIONERESINA
pH 7.5
TRIS 50 mMNaCl 500 mMEDTA 5 mMBenzamidina 10 mM
ELUIZIONE
pH 7.5
Benzamidina 10 mM pH 7.5
TRIS 50 mMEDTA 5 mMBenzamidina 10 mM
FISSAZIONE ALLA RESINApH 7.5
STREPTAVIDINA E BIOTINA
La STREPTAVIDINA è una proteina (MW 60
Kd) isolata dal batterio Streptomyces avidinii.
La BIOTINA è una vitamina idrosolubile.
STREPTAVIDINA E BIOTINA
La streptavidina possiede 4 siti di legame ad alta affinità per la biotina.
CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’
Miscela campioneMiscela campione
assieme alla FM
CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’
Recupero della molecola di interesse per alterazione delle alterazione delle condizioni di legame.
(pH, T, forza ionica….)
MolecoleMolecolecheche non non sisileganolegano
CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’Concanavalina A
Proprietà sfruttata: AFFINITA’ PER
ALCUNI GRUPPI CHIMICI.
- Legare covalentemente un composto ad un supporto solido.
- Addizionare la miscela.- Lavare con tampone.- Eluire la molecola desiderata con una elevata
concentrazione di composto in forma solubile.
Vengono utilizzati
ANTICORPISPECIFICI
CROMATOGRAFIA PER IMMUNOAFFINITA’
Colonnacromatografica
Molecola di interesse
Anticorpoanti-proteina
Eluente
Altre molecole
CONFRONTO FRA TECNICHE DI SEPARAZIONECampione di partenza: la cellula.Distruggendo la membrana cellulare si ottiene l’omogenato.
SDS-PAGESDS-PAGEOgni pozzetto è
stato caricato con 50 ug di campione.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTE PRESTAZIONI
Evoluzione strumentale della cromatografia in fase liquida su colonna classica.
Separazioni efficienti in tiroglobulina
ribonucleasi
Ris
post
a de
l riv
elat
ore
colonna
iniettore--campione
solvente
rilevatore
scarto
cromatogramma
Separazioni efficienti in tempi ridotti e di effettuare analisi qualitative e/o quantitative.
In HPLC il flusso di fase mobile è garantito da un sistema di pompe.
Tempo o volume
Ris
post
a de
l riv
elat
ore
Isolamento di molecole e celluleIsolamento di molecole e celluleBiglie magneticheBiglie magnetiche
Isolamento di molecoleIsolamento di molecole
Campione Campione
DynabeadsDynabeads®®
Biglie magnetiche con differenti Biglie magnetiche con differenti gruppi chimici sulla superficie, gruppi chimici sulla superficie, adatti per legarvi diverse molecoleadatti per legarvi diverse molecole.Riutilizzabili.Riutilizzabili.
Isolamento di molecoleIsolamento di molecole
-- Separazione estremamenteSeparazione estremamente gentile gentile che che previene la denaturazione del campione previene la denaturazione del campione proteico.proteico.
-- Permette di separare Permette di separare -- Permette di separare Permette di separare Anche Anche complessicomplessi integri.integri.
-- Usata per Usata per deplezionedeplezione didiun composto da un campione.un composto da un campione.
Isolamento di molecoleIsolamento di molecole
Automatizzabile!Automatizzabile!