GENERALITA’ GENERALITA’ SULLA SULLA SULLA SULLA

CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIAMarcello BaroniMarcello Baroni

COSA SONO LE TECNICHECROMATOGRAFICHE?

La cromatografia consiste nello sfruttare la diversa attitudine di ogni molecola o ione nel distribuirsi fra 2 fasi differenti.

Una fase viene immobilizzata su di un supporto (es. colonna) ed è perciò detta fase stazionaria, l’altra viene fatta scorrere sulla prima continuamente: fase mobile.prima continuamente: fase mobile.

processo dinamico

Fase mobile

Fase stazionaria

MolecolaMolecola

CM CSCM

CSK =

Ogni componente della miscela sarà in equilibrio fra le 2 fasi.

K = coefficiente didistribuzione

(diverso per ogni componente)

TECNICHE CROMATOGRAFICHE

Miscela F. mobile

La miscela, messa a

F. Staz.

Tappoporoso

F. mobile Proteine separate

La miscela, messa a contatto con le 2 fasi, si separerà sulla base delle diverse affinità di ciascun componente per tali fasi.

AA

A

A

B

B

CROMATOGRAFIA PER FILTRAZIONE SU GEL

Proprietà sfruttata:

DIMENSIONE delle molecole.

Log PM

t (s)

Ordine di uscita dei campioni opposto rispetto all’SDS-PAGE.

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

+ NaCl+ -

+

--

++-

++-- -

-+

+1a fase: legame

++-

-- --

2a fase: eluizione

Proprietà sfruttata: CARICA NETTA delle molecole.

ESEMPIO DI CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

Scambiatore di anioni forte:ammine quaternarie

TRIS 50 mMNaCl 100 mMEDTA 5 mMBenzamidina 10 mM

EQUILIBRAZIONERESINA

pH 7.5

TRIS 50 mMNaCl 500 mMEDTA 5 mMBenzamidina 10 mM

ELUIZIONE

pH 7.5

Benzamidina 10 mM pH 7.5

TRIS 50 mMEDTA 5 mMBenzamidina 10 mM

FISSAZIONE ALLA RESINApH 7.5

STREPTAVIDINA E BIOTINA

La STREPTAVIDINA è una proteina (MW 60

Kd) isolata dal batterio Streptomyces avidinii.

La BIOTINA è una vitamina idrosolubile.

STREPTAVIDINA E BIOTINA

La streptavidina possiede 4 siti di legame ad alta affinità per la biotina.

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’

Miscela campioneMiscela campione

assieme alla FM

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’

Recupero della molecola di interesse per alterazione delle alterazione delle condizioni di legame.

(pH, T, forza ionica….)

MolecoleMolecolecheche non non sisileganolegano

CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’Concanavalina A

Proprietà sfruttata: AFFINITA’ PER

ALCUNI GRUPPI CHIMICI.

- Legare covalentemente un composto ad un supporto solido.

- Addizionare la miscela.- Lavare con tampone.- Eluire la molecola desiderata con una elevata

concentrazione di composto in forma solubile.

Vengono utilizzati

ANTICORPISPECIFICI

CROMATOGRAFIA PER IMMUNOAFFINITA’

Colonnacromatografica

Molecola di interesse

Anticorpoanti-proteina

Eluente

Altre molecole

CONFRONTO FRA TECNICHE DI SEPARAZIONECampione di partenza: la cellula.Distruggendo la membrana cellulare si ottiene l’omogenato.

SDS-PAGESDS-PAGEOgni pozzetto è

stato caricato con 50 ug di campione.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTE PRESTAZIONI

Evoluzione strumentale della cromatografia in fase liquida su colonna classica.

Separazioni efficienti in tiroglobulina

ribonucleasi

Ris

post

a de

l riv

elat

ore

colonna

iniettore--campione

solvente

rilevatore

scarto

cromatogramma

Separazioni efficienti in tempi ridotti e di effettuare analisi qualitative e/o quantitative.

In HPLC il flusso di fase mobile è garantito da un sistema di pompe.

Tempo o volume

Ris

post

a de

l riv

elat

ore

Isolamento di molecole e celluleIsolamento di molecole e celluleBiglie magneticheBiglie magnetiche

Isolamento di molecoleIsolamento di molecole

Campione Campione

DynabeadsDynabeads®®

Biglie magnetiche con differenti Biglie magnetiche con differenti gruppi chimici sulla superficie, gruppi chimici sulla superficie, adatti per legarvi diverse molecoleadatti per legarvi diverse molecole.Riutilizzabili.Riutilizzabili.

Isolamento di molecoleIsolamento di molecole

-- Separazione estremamenteSeparazione estremamente gentile gentile che che previene la denaturazione del campione previene la denaturazione del campione proteico.proteico.

-- Permette di separare Permette di separare -- Permette di separare Permette di separare Anche Anche complessicomplessi integri.integri.

-- Usata per Usata per deplezionedeplezione didiun composto da un campione.un composto da un campione.

Isolamento di molecoleIsolamento di molecole

Automatizzabile!Automatizzabile!