epatite guasti 1 - Centro di formazione ASLTO4 guasti i parte.pdf · codifica una proteina che...

EPATITE B

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO

HBV-HCV-HIV

Epatite B

L’interesse scientifico per il virus dell’epatite B (HBV) e le sue manifestazioni cliniche negli ultimi anni è stato notevolmente alimentato dai significativi progressi intervenuti nella diagnosi e nella terapia.

VIRUS DELL’EPATITE B

Il virus dell’epatite B è l’unico Hepdnavirus di intesse medico, ed èspecifico per la specie umana.

La particella virale completa o particella di Dane è una particella sferica del diametro di 42 nm, composta da un involucro esterno Lipoproteico(envelope) che circonda un nucleocapside di 18nm di diametro.

HBVHBV

Il genoma di HBV contiene 4 sequenze codificatrici denominate Il genoma di HBV contiene 4 sequenze codificatrici denominate

C,P,S,XC,P,S,X

I primi tre geni C,P,S codificano, rispettivamente, la proteina capsidicadel “core” virale, l’enzima polimerasi e le glicoproteine di superfice“virus specifiche” (inserite nell’involucro pericapsidico del virione maturo)

-Il gene P codifica una proteina di (90 Kd) alla quale sono associate le attività enzimatiche virus specifiche, più un peptide che serve da segnale di inizio dell’attività polimerasica.

-Il gene C può codificare due proteine : C e C+preC.

La proteina C forma il capside virale (core) e l’antigene c virus specifico (HBcAg Hepatitis B core antigen)

La proteina C+preC, invece viene avviata verso l’apparato secretorio cellulare e, dopo alcuni tagli proteolitici, viene eliminata all’esterno della cellula, in forma di una proteina di 16 Kd che espone epitopi antigenici peculiari e viene indicata come antigene “e” HBeAg.

-Il gene S

codifica le proteine di superficie (peplos del virione) di cui esse rappresentano l’antigene specifico HBsAg. Il gene S presenta tre segnali di inizio della trascrizione e può codificare tre proteine di diverso peso molecolare: S di 24000 dalton o p24, S+preS1 (33Kd o p33) e S+preS1+preS2 di (39Kd o p39). Le tre proteine dopo glicosilazione sono indicate come gp27, gp36 e gp42.

-Gene x

codifica una proteina che attiva la trascrizione del genoma virale.

Come si vede dalla rappresentazione genomica schematizzata dell’HBV DNA il genoma è rappresentato da una molecola di DNA circolare parzialmente bicatenario con una catena più lunga L(-) della lunghezza di 3200 nucleotidi e una più corta S(+) di lunghezza variabile da 1700 a 2800 nt.

I quattro geni codificanti organizzati in ORF(open reading frame) si trovano nella catena L-

Mutazioni a livello della regione pre-

Mutazioni a livello del gene “s”

Mutazioni a livello del gene “pol”

HBV è assolutamente specifico per la specie umana , ai cui epatociti si lega attraverso i recettori, il DNA virale viene trasferito nel nucleo della cellula ospite dove, dopo il completamento della struttura bicatenaria del genoma , ad opera degli enzimi cellulari preposti alla “sintesi di riparo”, viene trascritto dalla polimerasi cellulare dando inizio al ciclo di replicazione virale.

I virioni una volta completati sono eliminati dalle cellule attraverso un processo di “esocitosi”, insieme ad una notevole quota di HBsAg, che viene prodotta in eccesso e si presenta in circolo assemblato sia in forma di particelle rotondeggianti sia in forma filamentosa.

Il virione completo presenta tre glicoproteine di superficie denominate LHBs, MHBs e SHBs. Negli aggregati filamentosi sono presenti tutte e tre le diverse glicoproteine, mentre negli aggregati rotondeggianti sono presenti le SHBs e una parte variabiledi MHBs.

Replicazione virus HBV

HBV: HBV: marcatorimarcatori sierologicisierologici

�� HBsAgHBsAg

�� DefinisceDefinisce ll’’infezioneinfezione in in attoatto: la : la persistenzapersistenza per per pipiùù didi 6 6 mesimesiconsenteconsente didi stabilirestabilire la la presenzapresenza didi unauna infezioneinfezione cronicacronica

�� HBeAgHBeAg

�� IndicaIndica invariabilmenteinvariabilmente la la presenzapresenza didi replica / replica / infettivitinfettivitàà

�� AntiAnti--HBeHBe

�� La La sieroconversionesieroconversione dada HBeAgHBeAg a antia anti--HBeHBe indicaindica classicamenteclassicamentela la risoluzionerisoluzione, ma la , ma la positivitpositivitàà non non escludeesclude replica/replica/infettivitinfettivitàà

�� AntiAnti--HBsHBs

�� IndicaIndica immunitimmunitàà ((naturalenaturale o in o in seguitoseguito a a immunoprofilassiimmunoprofilassi))

�� AntiAnti--HBcHBc

�� PresentePresente in in tuttetutte le le fasifasi delldell’’infezioneinfezione: : puòpuò essereessere ll’’unicounicomarcatoremarcatore nellenelle infezioniinfezioni cronichecroniche

�� AntiAnti--HBcHBc IgMIgM

•• DifferenziaDifferenzia ll’’infezioneinfezione acuta/recenteacuta/recentedalldall’’infezioneinfezione non non recenterecente

Significato dei marcatori sierologici di HBVSignificato dei marcatori sierologici di HBV

AntiAnti--HBsHBsImmunitImmunitàà

IgMIgM AntiAnti--HBcHBcDanno virusDanno virus--

indottoindotto

HBVHBV--DNA, DNA, HBeAgHBeAgReplica viraleReplica virale

HBsAgHBsAg, , antianti--HBcHBc, , antianti--HBeHBeInfezioneInfezione

Sintomi

HBeAg anti-HBe

anti-HBc totale

IgM anti-HBc anti-HBsHBsAg

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100

HBV DNA

Settimane dopo l’esposizione

Infezione acuta da virus dell’epatite B con guarigione

Andamento sierologico tipico

1992 1999 2003

Femmine

Maschi

Variazioni dei livelli di anti-HBs nel tempo

ale co

<100 mUI/mL <1000 mUI/mL >10000 mUI/mL

Livelli di anti-HBs nel 1992

Livelli Livelli ““non protettivinon protettivi”” di di

antianti--HBsHBs dopo 11 anni in dopo 11 anni in

rapporto con i livelli inizialirapporto con i livelli iniziali

Gabbuti et al, AMCLI 2004

L’epatite B è un’affezione a lunga incubazione (fino a sei mesi) che si trasmette per via interumana (PERCUTANEA) attraverso l’inoculazione di sangue infetto (trasmissione per via parenterale INAPPARENTE o come infezione perinatale.

Nel periodo iniziale dell’infezione i virioni sono presenti in apprezzabile quantità, insieme ad un eccesso di particelle di HBsAg e di HBeAg.

In seguito alla risposta immune-umorale e cellulo mediata il virus viene bloccato nell’ambiente extracellulare e le cellule infette vengono eliminate e si ha la guarigione della malattia.

Circa il 90% dei soggetti infettati va incontro a un’infezione primaria asintomatica, mentre nel rimanente 10% dei casi, l’infezione primaria risulta sintomatica.

Circa 1% dei casi può sviluppare la forma fulminante, fatale nell’80% dei casi.

Circa il 90%dei casi di epatite acuta volge a guarigione, mentre il 10% delle infezioni primarie evolve verso la cronicizzazione.

Circa il 30% delle epatite croniche evolve verso la cirrosi .

Attività immunologica (fase acuta)

HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++

Immunotolleranza (periodo di incubazione)

HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-

Infezione risolta

HBsAg-

anti-HBs+, anti-HBc+

Infezione risolta

HBsAg-

Epatite cronica HBeAg+

HBeAg+, anti-HBe-,

HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+

HBeAg+, anti-HBe-,

StoriaStoria naturalenaturale delldell’’infezioneinfezione dada HBVHBV

Fattovich et.al (2003). Journal of Hepatology 39: S50-S58

Epatite cronica HBeAg-

HBeAg-, anti-HBe+,

Portatore inattivo di HBsAg

HBV DNA<105/ml, ALT-

HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

HBV DNA>106/ml, ALT+

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Mutazioni PreC/C

MutazioniPreC/C

Mutazioni PreC/C

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

Infezione risolta

HBsAg-

Infezione risolta

HBsAg-

HBeAg+, anti-HBe-,

HBeAg-, anti-HBe+,

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Mutazioni PreC/C

MutazioniPreC/C

Mutazioni PreC/C

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

Infezione risolta

HBsAg-

Infezione risolta

HBsAg-

HBeAg+, anti-HBe-,

HBeAg-, anti-HBe+,

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Mutazioni PreC/C

MutazioniPreC/C

Mutazioni PreC/C

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

Infezione risolta

HBsAg-

Infezione risolta

HBsAg-

HBeAg+, anti-HBe-,

HBeAg-, anti-HBe+,

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Mutazioni PreC/C

MutazioniPreC/C

Mutazioni PreC/C

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

Infezione risolta

HBsAg-

Infezione risolta

HBsAg-

HBeAg+, anti-HBe-,

HBeAg-, anti-HBe+,

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Infezione cronica

HBsAg+ > 6 mesi

Mutazioni PreC/C

MutazioniPreC/C

Mutazioni PreC/C

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

IInfezionenfezione occultaocculta dada HBVHBV

� 200 pazienti HBsAg- / HCV+

�147 ECA, 48 cirrosi, 5 "minimal changes"�102 anti-HBc+

� 50 epatopatie croniche HBsAg- / HCV-

� PCR per HBV DNA� 66 / 200 HBV DNA+ (33%)� 7 / 50 HBV DNA+ (14%)

�nessuna mutazione nel genoma HBV

Cacciola et al, NEJM 1999

EPATITE B OCCULTA

L’infezione occulta del virus epatico B è definita come la persistenza del genoma virale nel tessuto epatico, e in alcuni casi anche nel siero spesso in quantità non rilevabili, in individui HBsAg negativi.

Le basi molecolari dell’infezione occulta sono strettamente correlate al caratteristico ciclo vitale del virus HBV . La stabilità e la lunga permanenza delle molecole di cccDNA virale, associate alla lunga emivita degli epatociti fanno si che,una volta instauratisi, l’infezione continui per tutta la vita in maniera subclinica.

La ragione per cui i portatori dell’ infezione occulta sono HBsAg – èoggetto di studio. Alcuni riportano che alcuni casi sono infettati da varianti S che producono un HBsAg modificato non rilevabile alle normali tecniche di determinazione HBsAg

La più alta prevalenza di infezione occulta da HBV è stata riscontrata in pazienti con infezione da HCV, e recenti studi hanno dimostrato una potenziale inibizione della replicazione HBV da parte della proteina “core”dell’ HCV .

L’infezione occulta HBV è nell’80% dei casi accompagnata alla presenza di anticorpi anti-HBc+ e anti-HBs+ , mentre il rimanente 20% presenta negatività per tutti i markers sierici dell’infezione HBV.

INFEZIONE OCCULTA DA HBV

AntiAnti--HBcHBc isolato: frequenzaisolato: frequenza

� Nelle aree a endemia media o bassa il quadro di

“anti-core isolato” è presente nel:

� 10-20% degli infetti

� 1-4% di tutta la popolazione

� HBV-DNA positivo in circa il 10% dei casiViremia presente soprattutto in:

HCV+ (35%)HIV+ (80%)

Grob et al, JMV 2000; 62:450-455

HBsAg e anti-HBc isolato - italiani

2,6 3,11,7

<29 years 29-59 years >60 years

HBsAg+

Anti-HBc only+

Infezione da HBV in nuovi donatoriInfezione da HBV in nuovi donatori

31.190 (67,6%) ≥≥≥≥26 anni

46.147 nuovi donatori

28.495 (91,4%) HBV negativi

2.695 (8,6%) HBV positivi

102 (0,33%) HBsAg+/anti-HBc+

2.593 (8,3%) HBsAg-/anti-HBc+

C. Velati et al, ISBT 2005

2,9%10,4%

RisultatiRisultati––PatternsPatterns sierologici in soggetti sierologici in soggetti

HBsAgHBsAg--/anti/anti--HBc+HBc+86,7% anti-HBs+86,7% anti-HBs+

13,3% anti-HBs-13,3% anti-HBs-

anti-s+anti-e+

anti-s+anti-e-

anti-s-anti-e+

anti-s-anti-e-

Anti-HBc isolato

Velati C. et al, ISBT 2005

HBVHBV--DNA in donatori DNA in donatori HBsAgHBsAg negativinegativi

Romanò L. et al, ISBT 2006

�� I I mutantimutanti pipiùù comunicomuni delldell’’HBsAgHBsAg sisi

concentranoconcentrano intornointorno agliagli aaaa. 141 . 141 -- 145.145.

�� Il Il mutantemutante riportatoriportato con con maggiormaggior

frequenzafrequenza èè la la sostituzionesostituzione GGlyly--AArgrg in in

posizioneposizione 145.145.

�� Le Le immaginiimmagini seguentiseguenti mostranomostrano le le

variazionivariazioni didi conformazioneconformazione nellnell’’epitopoepitopo

141141--145 in 145 in seguitoseguito aa questa mutazionequesta mutazione

�� ((modellomodello didi HBsAgHBsAg secondosecondo Chen et al., Chen et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 1997Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 1997--

2001).2001).

MutantiMutanti delldell’’HBsAgHBsAg

Mutante arg in pos.145Mutante arg in pos.145Wild-type gly in pos.145Wild-type gly in pos.145

HBsAg: “escape mutant”

principale

In In qualiquali circostanzecircostanze sonosono statistati trovatitrovati i i mutantimutanti

delldell’’HBsAgHBsAg??

�� SonoSono statistati trovatitrovati in in almenoalmeno tretre situazionisituazioni::

1) 1) insuccessoinsuccesso delladella vaccinazionevaccinazione in in neonatineonati dada madrimadriHBsAgHBsAg--positivepositive

2) 2) fallimentofallimento delladella immunoprofilassiimmunoprofilassi in in pazientipazientisottopostisottoposti a a trapiantotrapianto didi fegatofegato

3) 3) diagnosidiagnosi didi infezioneinfezione dada HBV in HBV in soggettisoggetti negativinegativi

per per HBsAgHBsAg

Riferimento: Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: Potential

Virological and Clinical Significance. Hepatology 27: 294 - 297.

MUTAZIONI

Mutazioni a livello del gene “S”

L’HBsAg è costituito da 226 aa; può essere presente sia in forma glicosilata(gp27) che in forma non glicosilata (p24).

La proteina contiene tre domini idrofobici transmembrana e due idrofilici. Si è osservata sperimentalmente che la maggior parte delle mutazioniavvengono nei due domini idrofilici poichè le due regioni sono esposte all’attacco degli anticorpi dell’ospite e di conseguenza le mutazioni rappresentano un escape alla pressione immunitaria

Mutazioni a livello della regione “pre-core”

La regione pre-c contiene una struttura secondaria detta epsilon necessaria per la sintesi del DNA virale all’interno dei capsidi immaturi. Mutazioni in questo dominio potrebbero influenzare il meccanismo di replicazione e la persistenza virale.

Mutazioni a livello del gene “p”

IL gene è costituito da almeno 4 domini; il dominio della polimerasi codifica per la DNA-polimerasi DNA e RNA dipendente, che determina la retrotrascrizione dell’RNA-pregenomico in DNA.

La presenza di mutazioni in questa sequenza è responsabile della comparsa di mutanti HBV resistenti al trattamento anti virale con analoghi nucleosidici inibitori della trascrittasi inversa.

121 124

138 139 147

145144

s-s--s-s-

--s--s-

198210

Loop 1 of ‘a’ determinant

Loop 2 of ‘a’ determinant

Carman, W. J Viral Hepatitis 1997 4: 11-20

Vaccine Escape Mutants:T126S T131NM133L K141ED144E G145R

TEST DI SCREENING: caratteristiche HBsAg

La pronta identificazione dei soggetti affetti da epatite B è essenziale per assicurare loro le cure necessarie per prevenire o ritardare l’evoluzione della malattia e prevenire la trasmissione del virus.

Pertanto il test di screening deve essere:

SENSIBILITA’ ECCELLENTE. Per evitare falsi negativi

Per una diagnosi precoce

SPECIFICITA’ ELEVATA. Per evitare falsi positivi

CAPACITA’ DI RILEVARE MUTANTI HBsAg.

QUANTITATIVO. Curva di calibrazione compresa tra 0.05- 250 mUI/m

100000

Acute Convalescent Chronic

HBeAg+

Chronic

HBeAg-

Livelli di HBsAg nell’epatite B acuta e cronica

A. Rodella et al, J Clin Virol 2006; 37: 206-212

Inf. cronicaInf. cronica

Low Low levellevel

+/+/--+/+/--PosPosNegNegNegNegNegNegNegNegNegNeg

Vecchia inf. Vecchia inf.

risoltarisolta

Falso positivoFalso positivo

NormNorm..NegNegPosPosNegNegNegNegNegNegNegNegNegNeg

Inf. cronica Inf. cronica

mutante mutante PrePre CC

con con replicazreplicaz..

++++++++++++PosPosNegNegPosPosNegNegNegNegPosPos

Inf. cronica conInf. cronica con

replicazreplicaz..

+++/+++/--++++++PosPosNegNegNegNegPosPosNegNegPosPos

Inf. cronica Inf. cronica

senza senza replicazreplicaz..+/+/--NegNeg

+/+/--

PosPosNegNegPosPosNegNegNegNegPosPos

VaccinatoVaccinato

ResponderResponder

NormNorm..NegNegNegNegNegNegNegNegNegNegPosPosNegNeg

Inf. in risoluzioneInf. in risoluzione

ImmunitImmunitàà

NormNorm..NegNegPosPosNegNegPosPosNegNegPosPosNegNeg

Infezione acutaInfezione acuta++++++++++++NegNegPosPosNegNegPosPosNegNegPosPos

InterpretazioneInterpretazioneALTALTHBVHBV

DNADNA

HBcAbHBcAb

IgGIgG

HBcAbHBcAb

IgMIgM

HBeAbHBeAbHBeAgHBeAgHBsAbHBsAbHBsAgHBsAg

Interpretazione dei markers sierologici

PROFILO 1PROFILO 1

PPNNPPPPPP<10mU<10mUPP

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

HBcHBcAntiAnti--HBsHBsHBsAgHBsAg

INFEZIONE ACUTA O CRONICA CON REPLICA VIRALE

PROFILO 2PROFILO 2

N/PN/PNNNNPPPP<10mU<10mUNN

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

HBcHBcAntiAnti--

HBsHBsHBsAgHBsAg

“CORE WINDOW”

PROFILO 3PROFILO 3

NNNNNNNNPP<10mU<10mUNN

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

CORE ISOLATO

PROFILO 4PROFILO 4

<10<1044PPNNNNPP<10mU<10mUPP

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

HBcHBcAntiAnti--

HBsHBsHBsAgHBsAg

PORTATORE INATTIVO

PROFILO 5PROFILO 5

>10>1044PPNNPPPP<10mU<10mUPP

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

HBcHBcAntiAnti--

HBsHBsHBSAgHBSAg

EPATITE CRONICA CON REPLICA VIRALE (“e minus” variant)

PROFILO 6PROFILO 6

NNN/PN/PNNNNPP>10mU>10mUNN

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

IMMUNIZZAZIONE POST-INFEZIONE

PROFILO 7PROFILO 7

NNNNNNNNNN>10mU>10mUNN

HBVHBV--

DNADNAAntiAnti--

HBcHBc

IgMIgM

AntiAnti--

IMMUNIZZAZIONE POST-VACCINALE

EPATITE D HDV

Il virus dell’epatite Delta è il più piccolo virus ad RNA che infetta l’uomo.

E’ un virus difettivo.

Necessita della presenza del virus dell’epatite B nella cellula per infettarla.

L’infezione può avvenire contemporaneamente a quella dell’HBV (coinfezione) o successivamente (sovrainfezione)

UnaUna storiastoria lungalunga quindici quindici

annianni�� Prince A.M., Prince A.M., BrotmanBrotman B., Grady G.F. et B., Grady G.F. et

al: al: ““LongLong--incubation postincubation post--transfusion transfusion

hepatitis without serological evidence of hepatitis without serological evidence of

exposure to hepatitis B virusexposure to hepatitis B virus””.. Lancet II, Lancet II,

241241--244, 1974244, 1974

�� ChooChoo, Q.L. , , Q.L. , KuoKuo G., Weiner A.J. et al.G., Weiner A.J. et al.

““Isolation of a DNA clone derived from Isolation of a DNA clone derived from

bloodblood--borne nonborne non--A/nonA/non--B viral hepatitis B viral hepatitis

genomegenome””.. Science 224: 359Science 224: 359--362, 1989362, 1989

VIRUS DELL’EPATITE C (HCV)

La scoperta del virus dell’epatite C, nel 1989 è stata possibile grazie a tecniche di biologia molecolare che hanno consentito di dimostrare, nel sangue di uno scimpanzé infettato con materiale di provenienza umana un antigene virus specifico, e di produrlo come proteina ricombinante, con la conseguente ed immediata introduzione in commercio di un test per la ricerca degli anticorpi specifici,prima ancora che il virus stesso fosse stato identificato.

CARATTERI GENERALI:

-Identificato nel 1989

-Responsabile di una forma di epatite che era stata definita “non-a, non-B”

-Famiglia FLAVIVIRIDAE

-Genere HEPACIVIRUS

-Virus a RNA lineare ad elica singola a polarità positiva

.Presenza di mantello

-Diametro di 30-60nm

-Genoma (9.100) nucleotidi

Codifica per la sintesi di 10 proteine suddivise in

PROTEINE STRUTTURALI

una proteina del nucleocapside (gene C)

due proteine del rivestimento esterno (E1 e E2)

PROTEINE NON STRUTTURALI (importanti per la replicazione virale)

una proteasi

una elicasi

una RNA polimerasi RNA dipendente

NS1,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B

GENOMA DI HCV e poliproteina prodotta dalla sua traduzione.

La poliproteina tradotta viene successivamente maturata da proteasi virali e cellulari in un minimo di 10 prodotti.

La caratteristica più importante dell’HCV è l’ipervariabilità genomica.

Proprio sulla base di questa eterogeneità genetica, gli isolati virali che maggiormente differiscono nella sequenza genomica sono stati suddivisi in “tipi”, o “GENOTIPI”.

All’interno di ogni genotipo sono stati successivamente raggruppati i virus isolati che, pur tra loro differenti nella sequenza genomica, non lo erano in grado tale da suggerire l’opportunità di una classificazione in un genotipo ulteriore; essi sono stati raggruppati in numerosi “sottotipi”.

La distribuzione geografica dei diversi genotipi dell’HCV è ampiamente variabile. In Italia e in Europa vi è una netta prevalenza del genotipo 1b.

I genotipi hanno un diverso significato clinico;per es i genotipi 1a, 1b, e 4 sono meno responsivi alla terapia.

La conseguenza dell’eterogeneità genica dell’HCV e della sua capacità di mutazione genetica sono alla base:

a) Della frequente cronicizzazione dell’infezione

( il virus sfugge al sistema immunitario dell’ospite)

b) Della possibile reinfezione anche con ceppi virali di diverso genotipo

c) Della non soddisfacente efficacia della terapia con IFN

d) Della difficoltà di allestire un vaccino

InfezioneInfezione dada HCV: HCV: esitiesiti

Infezioneda HCV

Nessunainfezione

Esposizione

1 – 2 sett.

Infezioneacuta

sintomatica

Infezioneacuta

asintomatica

~84%~16%

Infezionepersistente>80%

Cirrosi

epatica

15% – 20%Risoluzionespontanea<20%

Riferimenti: 1. Orland, et al., Hepatology, 20012. www.medscape.com/viewarticle/416562_3

1 – 2 sett.

~84%~16%

15% – 20%

SieroreversioneSieroreversione antianti--HCVHCV

�� KondiliKondili etet al, GUT 2002al, GUT 2002�� studio di popolazione in Italia centralestudio di popolazione in Italia centrale

�� prevalenza: 2,5%prevalenza: 2,5%

�� incidenza: 28/100.000/annoincidenza: 28/100.000/anno

�� negativizzazionenegativizzazione: 19,4% in 5: 19,4% in 5--12 anni12 anni

�� MazzeoMazzeo etet al, GUT 2003al, GUT 2003�� studio di popolazione in Italia settentrionalestudio di popolazione in Italia settentrionale

�� prevalenza: 3,5%prevalenza: 3,5%

�� incidenza: 50/100.000/annoincidenza: 50/100.000/anno

�� negativizzazionenegativizzazione: 17% in 10 anni: 17% in 10 anni

DIAGNOSI DI LABORATORIO PER INFEZIONE DA HCV

Test di screening:

Il test di screening prevede la rivelazione degli anticorpi specifici del virus dell’epatite C (anti HCV)

I metodi attualmente in commercio utilizzano sia antigeni ricombinantidelle zone non strutturali (NS3 e NS4) che antigeni strutturali della regione core di HCV.

Successivamente ,sono stati introdotti i test cosiddetti di “terza generazione”, nei quali è presente un antigene della regione NS5 ? Vedi studio della Regione toscana.

TEST DI CONFERMA

La sensibilità e la specificità di questi test è molto elevata, ma la probabilitàdi ottenere falsi positivi è elevata ; pertanto è opportuno verificare i test positivi con un metodo di conferma.

NS5UTR

NS4NS3NS2E2/

NS1E1C

UTR5’

Regione strutturale Regione non strutturale

Proteasi/

elicasi

RNA polimerasi RNA-

dipendente

Capside/core Glicoproteine

envelope

92 81 55 65 57 70 65 66 26

% di omologia nucleotidica tra genotipi diversi

C100-3

C200C22-3

C22-3 C33-C C100-3 NS5

1a gen.

2a gen.

3a gen.?

Virus dell’epatite C (HCV): organizzazione

funzionale del genoma e antigeni ricombinanti

RIBA HCV (test di conferma)

E’ un immunoblot su strisce di nitrocellulosa, che utilizza sia antigeniricombinanti sia peptidi sintetici da proteine strutturali e non strutturali del virus.

La presenza di anticorpi di tipo IgG contro antigeni virali si evidenzia in forma di bande distinte che consentono di identificarli in base alla loro reattività antigenica.

RISULTATI

a) Positivo: almeno 2 bande

b) Negativo: nessuna banda

c) Indeterminato: 1 sola banda

Secondo le linee guida di (CDC- Atlanta USA 2003)

Un test sierologico anti HCV è ritenuto :

1) POSITIVO se:

Screening + e RIBA o NAAT sono positivi

oppure screening + NAAT – e RIBA +

2) NEGATIVO se:

Screening –

Screening + e RIBA –

Screening + , RIBA – e NAAT –

3) Indeterminato se:

screening + e RIBA indeterminato (status immunologico nei confronti di HCV non definito)

LIMITAZIONI della metodica immunoassay di screening

Il test immunoassay anti HCV diventa positivo dopo 6-8 settimane dal contagio; indica una infezione attiva o pregressa , ma non è in grado di distinguere tra forma ACUTA, CRONICA o RISOLTA. Di solito segue un test di conferma.

Anti-HCV (+)

Falsi positivi

HCV-RNA (+) o

HCV Core Ag (+)

Portatore di HCV(Persistenza dopo

epatite acuta C)

HCV Ag: importanza dell’infezione attiva

Infezione pregressa da HCV(guarigione dopo

epatite acuta C o eliminazionedopo infezione persistente)

Da: S. Iino, Kiyokawa Hospital, & H.Yoshizawa, Hiroshima University, Japan

QuadriQuadri sierologicisierologici nellnell‘‘infezioneinfezione da da

HCVHCV

AssenzaAssenza di di infezioneinfezioneNegativoNegativoNegativoNegativo

InfezioneInfezione risoltarisolta ((guarigioneguarigione))

InfezioneInfezione cronicacronica con con viremiaviremia bassabassa o o

intermittenteintermittente

Falsa Falsa positivitpositivitàà per per antianti--HCVHCV

AnticorpiAnticorpi „„passivipassivi““

NegativoNegativoPositivoPositivo

InfezioneInfezione recenterecente

InfezioneInfezione cronicacronica in in pazientipazienti

immunocompromessiimmunocompromessi

PositivoPositivoNegativoNegativo

InfezioneInfezione attivaattiva ((acutaacuta o o cronicacronica))PositivoPositivoPositivoPositivo

InterpretazioneInterpretazioneHCV RNA/ HCV RNA/

HCV AgHCV AgAntiAnti--HCVHCV

100000000

30-mar-09 15-mag-09 3-giu-09 30-giu-09 12-ott-09

HCV-RNA IU/mL

10.000

HCV Ag fmol/L

HCV-RNA

Anti-HCV+

Start of

treatment

InfezioneInfezione acutaacuta dada HCVHCV

M.C. Medici et al, J Clin Virol 2011; 51: 260-265

1.1. DiagnosiDiagnosi: : utilizzoutilizzo combinatocombinato deidei test per antitest per anti--HCV e HCV e del test del test hshs--HCV Core AgHCV Core Ag per per identificareidentificare le le fasifasiprecociprecoci didi infezioneinfezione acutaacuta

2.2. DiscrimineDiscrimine: : ilil test per HCV Ag test per HCV Ag puòpuò distingueredistinguere i i portatoriportatori didi HCV (con HCV (con possibilepossibile evoluzioneevoluzione in in cirrosicirrosiepaticaepatica o carcinoma o carcinoma epatocellulareepatocellulare) ) dalledalle infezioniinfezionipregressepregresse e e daidai pazientipazienti guaritiguariti

3.3. PopolazioniPopolazioni ad alto ad alto rischiorischio: : identificazioneidentificazione delledelleinfezioniinfezioni in in soggettisoggetti ((ancoraancora o o persistentementepersistentemente) ) negativinegativi per antiper anti--HCVHCV

UtilitUtilitàà clinicaclinica didi un test un test sensibilesensibile per HCV Core Agper HCV Core Ag

AlgoritmoAlgoritmo suggeritosuggerito per la per la diagnosidiagnosi didi infezioneinfezione dada

HCV in HCV in asintomaticiasintomatici

Test Test didi screening per antiscreening per anti--HCVHCV

Negativo

Positivo

RIBA per AntiRIBA per Anti--HCVHCV NAT per HCV RNANegativo

STOPUlterioriUlteriori test test didi laboratoriolaboratorio

((eses. PCR, ALT). PCR, ALT)

Negativo PositivoIndeterminato

ValutazioneValutazione

clinicaclinica

Positivo

PCR negativoALT normali

PCR positivo, ALT elevate

Da: MMWR 1998;47 (No. RR 19)

anti-HCV (Immunoassay)

Non reattivo (negativo)Reattivo

HCV Core Ag NO infezione da HCV?

Positivo Negativo

Infezioneda HCV

Infezione pregressa o falso positivo anti-HCV

HCV RNA

Positivo Negative

Infezioneda HCV

HCV: algoritmo potenziale (Prof. Roggendorf)

Alternativa: 2°test EIA o Immunoblot

Sierologia HCV Sierologia HCV -- considerazioniconsiderazioni

�� La positivitLa positivitàà anticorpaleanticorpale non persiste indefinitamente non persiste indefinitamente

dopo guarigionedopo guarigione

�� La frequenza di cronicizzazione La frequenza di cronicizzazione èè probabilmente probabilmente

inferiore a quanto attualmente considerato (80%)inferiore a quanto attualmente considerato (80%)

�� Gli studi trasversali sottostimano la diffusione Gli studi trasversali sottostimano la diffusione

delldell’’infezioneinfezione

�� I risultati I risultati ““borderlineborderline”” o negativi alti con i test di o negativi alti con i test di

screening, spesso discordanti e/o indeterminati ai test screening, spesso discordanti e/o indeterminati ai test

supplementari, indicano prevalentemente delle supplementari, indicano prevalentemente delle ““codecode””

di reattivitdi reattivitàà in via di risoluzionein via di risoluzione

HCV in Italia (popolazione aperta): alcuni studi

Guadagnino

(1997)

Maio (2000) Coppola

(2000)

Di Stefano

(2002)

Kondili

(2002)

Mazzeo

(2003)

Pendino

(2005)

Cozzolongo

(2009)

Zani (2011)

Anti-HCV+

HCV-RNA+

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