epatite guasti 1 - Centro di formazione ASLTO4 guasti i parte.pdf · codifica una proteina che...
Transcript of epatite guasti 1 - Centro di formazione ASLTO4 guasti i parte.pdf · codifica una proteina che...
EPATITE B
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO
HBV-HCV-HIV
Epatite B
L’interesse scientifico per il virus dell’epatite B (HBV) e le sue manifestazioni cliniche negli ultimi anni è stato notevolmente alimentato dai significativi progressi intervenuti nella diagnosi e nella terapia.
VIRUS DELL’EPATITE B
Il virus dell’epatite B è l’unico Hepdnavirus di intesse medico, ed èspecifico per la specie umana.
La particella virale completa o particella di Dane è una particella sferica del diametro di 42 nm, composta da un involucro esterno Lipoproteico(envelope) che circonda un nucleocapside di 18nm di diametro.
HBVHBV
Il genoma di HBV contiene 4 sequenze codificatrici denominate Il genoma di HBV contiene 4 sequenze codificatrici denominate
C,P,S,XC,P,S,X
I primi tre geni C,P,S codificano, rispettivamente, la proteina capsidicadel “core” virale, l’enzima polimerasi e le glicoproteine di superfice“virus specifiche” (inserite nell’involucro pericapsidico del virione maturo)
-Il gene P codifica una proteina di (90 Kd) alla quale sono associate le attività enzimatiche virus specifiche, più un peptide che serve da segnale di inizio dell’attività polimerasica.
-Il gene C può codificare due proteine : C e C+preC.
La proteina C forma il capside virale (core) e l’antigene c virus specifico (HBcAg Hepatitis B core antigen)
La proteina C+preC, invece viene avviata verso l’apparato secretorio cellulare e, dopo alcuni tagli proteolitici, viene eliminata all’esterno della cellula, in forma di una proteina di 16 Kd che espone epitopi antigenici peculiari e viene indicata come antigene “e” HBeAg.
-Il gene S
codifica le proteine di superficie (peplos del virione) di cui esse rappresentano l’antigene specifico HBsAg. Il gene S presenta tre segnali di inizio della trascrizione e può codificare tre proteine di diverso peso molecolare: S di 24000 dalton o p24, S+preS1 (33Kd o p33) e S+preS1+preS2 di (39Kd o p39). Le tre proteine dopo glicosilazione sono indicate come gp27, gp36 e gp42.
-Gene x
codifica una proteina che attiva la trascrizione del genoma virale.
Come si vede dalla rappresentazione genomica schematizzata dell’HBV DNA il genoma è rappresentato da una molecola di DNA circolare parzialmente bicatenario con una catena più lunga L(-) della lunghezza di 3200 nucleotidi e una più corta S(+) di lunghezza variabile da 1700 a 2800 nt.
I quattro geni codificanti organizzati in ORF(open reading frame) si trovano nella catena L-
Mutazioni a livello della regione pre-
core
Mutazioni a livello del gene “s”
Mutazioni a livello del gene “pol”
HBV è assolutamente specifico per la specie umana , ai cui epatociti si lega attraverso i recettori, il DNA virale viene trasferito nel nucleo della cellula ospite dove, dopo il completamento della struttura bicatenaria del genoma , ad opera degli enzimi cellulari preposti alla “sintesi di riparo”, viene trascritto dalla polimerasi cellulare dando inizio al ciclo di replicazione virale.
I virioni una volta completati sono eliminati dalle cellule attraverso un processo di “esocitosi”, insieme ad una notevole quota di HBsAg, che viene prodotta in eccesso e si presenta in circolo assemblato sia in forma di particelle rotondeggianti sia in forma filamentosa.
Il virione completo presenta tre glicoproteine di superficie denominate LHBs, MHBs e SHBs. Negli aggregati filamentosi sono presenti tutte e tre le diverse glicoproteine, mentre negli aggregati rotondeggianti sono presenti le SHBs e una parte variabiledi MHBs.
Replicazione virus HBV
HBV: HBV: marcatorimarcatori sierologicisierologici
�� HBsAgHBsAg
�� DefinisceDefinisce ll’’infezioneinfezione in in attoatto: la : la persistenzapersistenza per per pipiùù didi 6 6 mesimesiconsenteconsente didi stabilirestabilire la la presenzapresenza didi unauna infezioneinfezione cronicacronica
�� HBeAgHBeAg
�� IndicaIndica invariabilmenteinvariabilmente la la presenzapresenza didi replica / replica / infettivitinfettivitàà
�� AntiAnti--HBeHBe
�� La La sieroconversionesieroconversione dada HBeAgHBeAg a antia anti--HBeHBe indicaindica classicamenteclassicamentela la risoluzionerisoluzione, ma la , ma la positivitpositivitàà non non escludeesclude replica/replica/infettivitinfettivitàà
�� AntiAnti--HBsHBs
�� IndicaIndica immunitimmunitàà ((naturalenaturale o in o in seguitoseguito a a immunoprofilassiimmunoprofilassi))
�� AntiAnti--HBcHBc
�� PresentePresente in in tuttetutte le le fasifasi delldell’’infezioneinfezione: : puòpuò essereessere ll’’unicounicomarcatoremarcatore nellenelle infezioniinfezioni cronichecroniche
�� AntiAnti--HBcHBc IgMIgM
•• DifferenziaDifferenzia ll’’infezioneinfezione acuta/recenteacuta/recentedalldall’’infezioneinfezione non non recenterecente
Significato dei marcatori sierologici di HBVSignificato dei marcatori sierologici di HBV
AntiAnti--HBsHBsImmunitImmunitàà
IgMIgM AntiAnti--HBcHBcDanno virusDanno virus--
indottoindotto
HBVHBV--DNA, DNA, HBeAgHBeAgReplica viraleReplica virale
HBsAgHBsAg, , antianti--HBcHBc, , antianti--HBeHBeInfezioneInfezione
Sintomi
HBeAg anti-HBe
anti-HBc totale
IgM anti-HBc anti-HBsHBsAg
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100
HBV DNA
Settimane dopo l’esposizione
Infezione acuta da virus dell’epatite B con guarigione
Andamento sierologico tipico
-1,6
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
1992 1999 2003
Va
ria
zio
ne
(lo
g1
0 m
UI/m
L)
Femmine
Maschi
Variazioni dei livelli di anti-HBs nel tempo
75
35,4
2,6
0
20
40
60
80
100
Per
centu
ale co
n <
10 m
UI/m
L
<100 mUI/mL <1000 mUI/mL >10000 mUI/mL
Livelli di anti-HBs nel 1992
Livelli Livelli ““non protettivinon protettivi”” di di
antianti--HBsHBs dopo 11 anni in dopo 11 anni in
rapporto con i livelli inizialirapporto con i livelli iniziali
Gabbuti et al, AMCLI 2004
L’epatite B è un’affezione a lunga incubazione (fino a sei mesi) che si trasmette per via interumana (PERCUTANEA) attraverso l’inoculazione di sangue infetto (trasmissione per via parenterale INAPPARENTE o come infezione perinatale.
Nel periodo iniziale dell’infezione i virioni sono presenti in apprezzabile quantità, insieme ad un eccesso di particelle di HBsAg e di HBeAg.
In seguito alla risposta immune-umorale e cellulo mediata il virus viene bloccato nell’ambiente extracellulare e le cellule infette vengono eliminate e si ha la guarigione della malattia.
Circa il 90% dei soggetti infettati va incontro a un’infezione primaria asintomatica, mentre nel rimanente 10% dei casi, l’infezione primaria risulta sintomatica.
Circa 1% dei casi può sviluppare la forma fulminante, fatale nell’80% dei casi.
Circa il 90%dei casi di epatite acuta volge a guarigione, mentre il 10% delle infezioni primarie evolve verso la cronicizzazione.
Circa il 30% delle epatite croniche evolve verso la cirrosi .
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
StoriaStoria naturalenaturale delldell’’infezioneinfezione dada HBVHBV
Fattovich et.al (2003). Journal of Hepatology 39: S50-S58
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Mutazioni PreC/C
MutazioniPreC/C
Mutazioni PreC/C
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
StoriaStoria naturalenaturale delldell’’infezioneinfezione dada HBVHBV
Fattovich et.al (2003). Journal of Hepatology 39: S50-S58
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Mutazioni PreC/C
MutazioniPreC/C
Mutazioni PreC/C
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
StoriaStoria naturalenaturale delldell’’infezioneinfezione dada HBVHBV
Fattovich et.al (2003). Journal of Hepatology 39: S50-S58
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Mutazioni PreC/C
MutazioniPreC/C
Mutazioni PreC/C
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
StoriaStoria naturalenaturale delldell’’infezioneinfezione dada HBVHBV
Fattovich et.al (2003). Journal of Hepatology 39: S50-S58
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Mutazioni PreC/C
MutazioniPreC/C
Mutazioni PreC/C
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Attività immunologica (fase acuta)
HBV DNA+, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT+++
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Immunotolleranza (periodo di incubazione)
HBV DNA+++, HBsAg+++, HBeAg+++, ALT-
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Infezione risolta
HBsAg-
anti-HBs+, anti-HBc+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg+
HBeAg+, anti-HBe-,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
StoriaStoria naturalenaturale delldell’’infezioneinfezione dada HBVHBV
Fattovich et.al (2003). Journal of Hepatology 39: S50-S58
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Epatite cronica HBeAg-
HBeAg-, anti-HBe+,
HBsAg+, HBV DNA>106/ml, ALT+
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Portatore inattivo di HBsAg
HBV DNA<105/ml, ALT-
HBsAg+, HBeAg-, anti-HBe+,
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Infezione cronica
HBsAg+ > 6 mesi
HBV DNA>106/ml, ALT+
Mutazioni PreC/C
MutazioniPreC/C
Mutazioni PreC/C
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
IInfezionenfezione occultaocculta dada HBVHBV
� 200 pazienti HBsAg- / HCV+
�147 ECA, 48 cirrosi, 5 "minimal changes"�102 anti-HBc+
� 50 epatopatie croniche HBsAg- / HCV-
� PCR per HBV DNA� 66 / 200 HBV DNA+ (33%)� 7 / 50 HBV DNA+ (14%)
�nessuna mutazione nel genoma HBV
Cacciola et al, NEJM 1999
EPATITE B OCCULTA
L’infezione occulta del virus epatico B è definita come la persistenza del genoma virale nel tessuto epatico, e in alcuni casi anche nel siero spesso in quantità non rilevabili, in individui HBsAg negativi.
Le basi molecolari dell’infezione occulta sono strettamente correlate al caratteristico ciclo vitale del virus HBV . La stabilità e la lunga permanenza delle molecole di cccDNA virale, associate alla lunga emivita degli epatociti fanno si che,una volta instauratisi, l’infezione continui per tutta la vita in maniera subclinica.
La ragione per cui i portatori dell’ infezione occulta sono HBsAg – èoggetto di studio. Alcuni riportano che alcuni casi sono infettati da varianti S che producono un HBsAg modificato non rilevabile alle normali tecniche di determinazione HBsAg
La più alta prevalenza di infezione occulta da HBV è stata riscontrata in pazienti con infezione da HCV, e recenti studi hanno dimostrato una potenziale inibizione della replicazione HBV da parte della proteina “core”dell’ HCV .
L’infezione occulta HBV è nell’80% dei casi accompagnata alla presenza di anticorpi anti-HBc+ e anti-HBs+ , mentre il rimanente 20% presenta negatività per tutti i markers sierici dell’infezione HBV.
INFEZIONE OCCULTA DA HBV
AntiAnti--HBcHBc isolato: frequenzaisolato: frequenza
� Nelle aree a endemia media o bassa il quadro di
“anti-core isolato” è presente nel:
� 10-20% degli infetti
� 1-4% di tutta la popolazione
� HBV-DNA positivo in circa il 10% dei casiViremia presente soprattutto in:
HCV+ (35%)HIV+ (80%)
Grob et al, JMV 2000; 62:450-455
HBsAg e anti-HBc isolato - italiani
2,6 3,11,7
0,3
46,1
0
10
20
30
<29 years 29-59 years >60 years
Fre
qu
en
cy
%
HBsAg+
Anti-HBc only+
Infezione da HBV in nuovi donatoriInfezione da HBV in nuovi donatori
31.190 (67,6%) ≥≥≥≥26 anni
46.147 nuovi donatori
28.495 (91,4%) HBV negativi
2.695 (8,6%) HBV positivi
102 (0,33%) HBsAg+/anti-HBc+
2.593 (8,3%) HBsAg-/anti-HBc+
C. Velati et al, ISBT 2005
39,4%
47,3%
2,9%10,4%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
RisultatiRisultati––PatternsPatterns sierologici in soggetti sierologici in soggetti
HBsAgHBsAg--/anti/anti--HBc+HBc+86,7% anti-HBs+86,7% anti-HBs+
13,3% anti-HBs-13,3% anti-HBs-
anti-s+anti-e+
anti-s+anti-e-
anti-s-anti-e+
anti-s-anti-e-
Anti-HBc isolato
Velati C. et al, ISBT 2005
HBVHBV--DNA in donatori DNA in donatori HBsAgHBsAg negativinegativi
Romanò L. et al, ISBT 2006
�� I I mutantimutanti pipiùù comunicomuni delldell’’HBsAgHBsAg sisi
concentranoconcentrano intornointorno agliagli aaaa. 141 . 141 -- 145.145.
�� Il Il mutantemutante riportatoriportato con con maggiormaggior
frequenzafrequenza èè la la sostituzionesostituzione GGlyly--AArgrg in in
posizioneposizione 145.145.
�� Le Le immaginiimmagini seguentiseguenti mostranomostrano le le
variazionivariazioni didi conformazioneconformazione nellnell’’epitopoepitopo
141141--145 in 145 in seguitoseguito aa questa mutazionequesta mutazione
�� ((modellomodello didi HBsAgHBsAg secondosecondo Chen et al., Chen et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 1997Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 1997--
2001).2001).
MutantiMutanti delldell’’HBsAgHBsAg
Mutante arg in pos.145Mutante arg in pos.145Wild-type gly in pos.145Wild-type gly in pos.145
HBsAg: “escape mutant”
principale
In In qualiquali circostanzecircostanze sonosono statistati trovatitrovati i i mutantimutanti
delldell’’HBsAgHBsAg??
�� SonoSono statistati trovatitrovati in in almenoalmeno tretre situazionisituazioni::
1) 1) insuccessoinsuccesso delladella vaccinazionevaccinazione in in neonatineonati dada madrimadriHBsAgHBsAg--positivepositive
2) 2) fallimentofallimento delladella immunoprofilassiimmunoprofilassi in in pazientipazientisottopostisottoposti a a trapiantotrapianto didi fegatofegato
3) 3) diagnosidiagnosi didi infezioneinfezione dada HBV in HBV in soggettisoggetti negativinegativi
per per HBsAgHBsAg
Riferimento: Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: Potential
Virological and Clinical Significance. Hepatology 27: 294 - 297.
MUTAZIONI
Mutazioni a livello del gene “S”
L’HBsAg è costituito da 226 aa; può essere presente sia in forma glicosilata(gp27) che in forma non glicosilata (p24).
La proteina contiene tre domini idrofobici transmembrana e due idrofilici. Si è osservata sperimentalmente che la maggior parte delle mutazioniavvengono nei due domini idrofilici poichè le due regioni sono esposte all’attacco degli anticorpi dell’ospite e di conseguenza le mutazioni rappresentano un escape alla pressione immunitaria
Mutazioni a livello della regione “pre-core”
La regione pre-c contiene una struttura secondaria detta epsilon necessaria per la sintesi del DNA virale all’interno dei capsidi immaturi. Mutazioni in questo dominio potrebbero influenzare il meccanismo di replicazione e la persistenza virale.
Mutazioni a livello del gene “p”
IL gene è costituito da almeno 4 domini; il dominio della polimerasi codifica per la DNA-polimerasi DNA e RNA dipendente, che determina la retrotrascrizione dell’RNA-pregenomico in DNA.
La presenza di mutazioni in questa sequenza è responsabile della comparsa di mutanti HBV resistenti al trattamento anti virale con analoghi nucleosidici inibitori della trascrittasi inversa.
121 124
107
137
138 139 147
149
GD
ED164
R
E
145144
F
Y158
s-s-
s-s--s-s-
--s--s-
MI
195
SW
M
I
196
198210
Loop 1 of ‘a’ determinant
Loop 2 of ‘a’ determinant
Carman, W. J Viral Hepatitis 1997 4: 11-20
Vaccine Escape Mutants:T126S T131NM133L K141ED144E G145R
126
141
131
133
TEST DI SCREENING: caratteristiche HBsAg
La pronta identificazione dei soggetti affetti da epatite B è essenziale per assicurare loro le cure necessarie per prevenire o ritardare l’evoluzione della malattia e prevenire la trasmissione del virus.
Pertanto il test di screening deve essere:
SENSIBILITA’ ECCELLENTE. Per evitare falsi negativi
Per una diagnosi precoce
SPECIFICITA’ ELEVATA. Per evitare falsi positivi
CAPACITA’ DI RILEVARE MUTANTI HBsAg.
QUANTITATIVO. Curva di calibrazione compresa tra 0.05- 250 mUI/m
0,1
10
1000
100000
Acute Convalescent Chronic
HBeAg+
Chronic
HBeAg-
HB
sAg
IU
/mL
Livelli di HBsAg nell’epatite B acuta e cronica
A. Rodella et al, J Clin Virol 2006; 37: 206-212
Inf. cronicaInf. cronica
Low Low levellevel
+/+/--+/+/--PosPosNegNegNegNegNegNegNegNegNegNeg
Vecchia inf. Vecchia inf.
risoltarisolta
Falso positivoFalso positivo
NormNorm..NegNegPosPosNegNegNegNegNegNegNegNegNegNeg
Inf. cronica Inf. cronica
mutante mutante PrePre CC
con con replicazreplicaz..
++++++++++++PosPosNegNegPosPosNegNegNegNegPosPos
Inf. cronica conInf. cronica con
replicazreplicaz..
+++/+++/--++++++PosPosNegNegNegNegPosPosNegNegPosPos
Inf. cronica Inf. cronica
senza senza replicazreplicaz..+/+/--NegNeg
+/+/--
PosPosNegNegPosPosNegNegNegNegPosPos
VaccinatoVaccinato
ResponderResponder
NormNorm..NegNegNegNegNegNegNegNegNegNegPosPosNegNeg
Inf. in risoluzioneInf. in risoluzione
ImmunitImmunitàà
NormNorm..NegNegPosPosNegNegPosPosNegNegPosPosNegNeg
Infezione acutaInfezione acuta++++++++++++NegNegPosPosNegNegPosPosNegNegPosPos
InterpretazioneInterpretazioneALTALTHBVHBV
DNADNA
HBcAbHBcAb
IgGIgG
HBcAbHBcAb
IgMIgM
HBeAbHBeAbHBeAgHBeAgHBsAbHBsAbHBsAgHBsAg
Interpretazione dei markers sierologici
PROFILO 1PROFILO 1
PPNNPPPPPP<10mU<10mUPP
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--HBsHBsHBsAgHBsAg
INFEZIONE ACUTA O CRONICA CON REPLICA VIRALE
PROFILO 2PROFILO 2
N/PN/PNNNNPPPP<10mU<10mUNN
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--
HBsHBsHBsAgHBsAg
“CORE WINDOW”
PROFILO 3PROFILO 3
NNNNNNNNPP<10mU<10mUNN
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--HBsHBsHBsAgHBsAg
CORE ISOLATO
PROFILO 4PROFILO 4
<10<1044PPNNNNPP<10mU<10mUPP
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--
HBsHBsHBsAgHBsAg
PORTATORE INATTIVO
PROFILO 5PROFILO 5
>10>1044PPNNPPPP<10mU<10mUPP
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--
HBsHBsHBSAgHBSAg
EPATITE CRONICA CON REPLICA VIRALE (“e minus” variant)
PROFILO 6PROFILO 6
NNN/PN/PNNNNPP>10mU>10mUNN
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--HBsHBsHBsAgHBsAg
IMMUNIZZAZIONE POST-INFEZIONE
PROFILO 7PROFILO 7
NNNNNNNNNN>10mU>10mUNN
HBVHBV--
DNADNAAntiAnti--
HBeHBeHBeAgHBeAgAntiAnti--
HBcHBc
IgMIgM
AntiAnti--
HBcHBcAntiAnti--HBsHBsHBsAgHBsAg
IMMUNIZZAZIONE POST-VACCINALE
EPATITE D HDV
Il virus dell’epatite Delta è il più piccolo virus ad RNA che infetta l’uomo.
E’ un virus difettivo.
Necessita della presenza del virus dell’epatite B nella cellula per infettarla.
L’infezione può avvenire contemporaneamente a quella dell’HBV (coinfezione) o successivamente (sovrainfezione)
UnaUna storiastoria lungalunga quindici quindici
annianni�� Prince A.M., Prince A.M., BrotmanBrotman B., Grady G.F. et B., Grady G.F. et
al: al: ““LongLong--incubation postincubation post--transfusion transfusion
hepatitis without serological evidence of hepatitis without serological evidence of
exposure to hepatitis B virusexposure to hepatitis B virus””.. Lancet II, Lancet II,
241241--244, 1974244, 1974
�� ChooChoo, Q.L. , , Q.L. , KuoKuo G., Weiner A.J. et al.G., Weiner A.J. et al.
““Isolation of a DNA clone derived from Isolation of a DNA clone derived from
bloodblood--borne nonborne non--A/nonA/non--B viral hepatitis B viral hepatitis
genomegenome””.. Science 224: 359Science 224: 359--362, 1989362, 1989
VIRUS DELL’EPATITE C (HCV)
La scoperta del virus dell’epatite C, nel 1989 è stata possibile grazie a tecniche di biologia molecolare che hanno consentito di dimostrare, nel sangue di uno scimpanzé infettato con materiale di provenienza umana un antigene virus specifico, e di produrlo come proteina ricombinante, con la conseguente ed immediata introduzione in commercio di un test per la ricerca degli anticorpi specifici,prima ancora che il virus stesso fosse stato identificato.
CARATTERI GENERALI:
-Identificato nel 1989
-Responsabile di una forma di epatite che era stata definita “non-a, non-B”
-Famiglia FLAVIVIRIDAE
-Genere HEPACIVIRUS
-Virus a RNA lineare ad elica singola a polarità positiva
.Presenza di mantello
-Diametro di 30-60nm
-Genoma (9.100) nucleotidi
Codifica per la sintesi di 10 proteine suddivise in
PROTEINE STRUTTURALI
una proteina del nucleocapside (gene C)
due proteine del rivestimento esterno (E1 e E2)
PROTEINE NON STRUTTURALI (importanti per la replicazione virale)
una proteasi
una elicasi
una RNA polimerasi RNA dipendente
NS1,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B
GENOMA DI HCV e poliproteina prodotta dalla sua traduzione.
La poliproteina tradotta viene successivamente maturata da proteasi virali e cellulari in un minimo di 10 prodotti.
La caratteristica più importante dell’HCV è l’ipervariabilità genomica.
Proprio sulla base di questa eterogeneità genetica, gli isolati virali che maggiormente differiscono nella sequenza genomica sono stati suddivisi in “tipi”, o “GENOTIPI”.
All’interno di ogni genotipo sono stati successivamente raggruppati i virus isolati che, pur tra loro differenti nella sequenza genomica, non lo erano in grado tale da suggerire l’opportunità di una classificazione in un genotipo ulteriore; essi sono stati raggruppati in numerosi “sottotipi”.
La distribuzione geografica dei diversi genotipi dell’HCV è ampiamente variabile. In Italia e in Europa vi è una netta prevalenza del genotipo 1b.
I genotipi hanno un diverso significato clinico;per es i genotipi 1a, 1b, e 4 sono meno responsivi alla terapia.
La conseguenza dell’eterogeneità genica dell’HCV e della sua capacità di mutazione genetica sono alla base:
a) Della frequente cronicizzazione dell’infezione
( il virus sfugge al sistema immunitario dell’ospite)
b) Della possibile reinfezione anche con ceppi virali di diverso genotipo
c) Della non soddisfacente efficacia della terapia con IFN
d) Della difficoltà di allestire un vaccino
InfezioneInfezione dada HCV: HCV: esitiesiti
Infezioneda HCV
Nessunainfezione
Esposizione
1 – 2 sett.
Infezioneacuta
sintomatica
Infezioneacuta
asintomatica
~84%~16%
Infezionepersistente>80%
Cirrosi
epatica
15% – 20%Risoluzionespontanea<20%
?
Riferimenti: 1. Orland, et al., Hepatology, 20012. www.medscape.com/viewarticle/416562_3
1 – 2 sett.
1
~84%~16%
?
15% – 20%
SieroreversioneSieroreversione antianti--HCVHCV
�� KondiliKondili etet al, GUT 2002al, GUT 2002�� studio di popolazione in Italia centralestudio di popolazione in Italia centrale
�� prevalenza: 2,5%prevalenza: 2,5%
�� incidenza: 28/100.000/annoincidenza: 28/100.000/anno
�� negativizzazionenegativizzazione: 19,4% in 5: 19,4% in 5--12 anni12 anni
�� MazzeoMazzeo etet al, GUT 2003al, GUT 2003�� studio di popolazione in Italia settentrionalestudio di popolazione in Italia settentrionale
�� prevalenza: 3,5%prevalenza: 3,5%
�� incidenza: 50/100.000/annoincidenza: 50/100.000/anno
�� negativizzazionenegativizzazione: 17% in 10 anni: 17% in 10 anni
DIAGNOSI DI LABORATORIO PER INFEZIONE DA HCV
Test di screening:
Il test di screening prevede la rivelazione degli anticorpi specifici del virus dell’epatite C (anti HCV)
I metodi attualmente in commercio utilizzano sia antigeni ricombinantidelle zone non strutturali (NS3 e NS4) che antigeni strutturali della regione core di HCV.
Successivamente ,sono stati introdotti i test cosiddetti di “terza generazione”, nei quali è presente un antigene della regione NS5 ? Vedi studio della Regione toscana.
TEST DI CONFERMA
La sensibilità e la specificità di questi test è molto elevata, ma la probabilitàdi ottenere falsi positivi è elevata ; pertanto è opportuno verificare i test positivi con un metodo di conferma.
NS5UTR
NS4NS3NS2E2/
NS1E1C
UTR5’
Regione strutturale Regione non strutturale
Proteasi/
elicasi
RNA polimerasi RNA-
dipendente
Capside/core Glicoproteine
envelope
92 81 55 65 57 70 65 66 26
% di omologia nucleotidica tra genotipi diversi
C100-3
C200C22-3
C22-3 C33-C C100-3 NS5
1a gen.
2a gen.
3a gen.?
3’
Virus dell’epatite C (HCV): organizzazione
funzionale del genoma e antigeni ricombinanti
RIBA HCV (test di conferma)
E’ un immunoblot su strisce di nitrocellulosa, che utilizza sia antigeniricombinanti sia peptidi sintetici da proteine strutturali e non strutturali del virus.
La presenza di anticorpi di tipo IgG contro antigeni virali si evidenzia in forma di bande distinte che consentono di identificarli in base alla loro reattività antigenica.
RISULTATI
a) Positivo: almeno 2 bande
b) Negativo: nessuna banda
c) Indeterminato: 1 sola banda
Secondo le linee guida di (CDC- Atlanta USA 2003)
Un test sierologico anti HCV è ritenuto :
1) POSITIVO se:
Screening + e RIBA o NAAT sono positivi
oppure screening + NAAT – e RIBA +
2) NEGATIVO se:
Screening –
Screening + e RIBA –
Screening + , RIBA – e NAAT –
3) Indeterminato se:
screening + e RIBA indeterminato (status immunologico nei confronti di HCV non definito)
LIMITAZIONI della metodica immunoassay di screening
Il test immunoassay anti HCV diventa positivo dopo 6-8 settimane dal contagio; indica una infezione attiva o pregressa , ma non è in grado di distinguere tra forma ACUTA, CRONICA o RISOLTA. Di solito segue un test di conferma.
Anti-HCV (+)
Falsi positivi
HCV-RNA (+) o
HCV Core Ag (+)
Portatore di HCV(Persistenza dopo
epatite acuta C)
HCV Ag: importanza dell’infezione attiva
Infezione pregressa da HCV(guarigione dopo
epatite acuta C o eliminazionedopo infezione persistente)
Da: S. Iino, Kiyokawa Hospital, & H.Yoshizawa, Hiroshima University, Japan
QuadriQuadri sierologicisierologici nellnell‘‘infezioneinfezione da da
HCVHCV
AssenzaAssenza di di infezioneinfezioneNegativoNegativoNegativoNegativo
InfezioneInfezione risoltarisolta ((guarigioneguarigione))
InfezioneInfezione cronicacronica con con viremiaviremia bassabassa o o
intermittenteintermittente
Falsa Falsa positivitpositivitàà per per antianti--HCVHCV
AnticorpiAnticorpi „„passivipassivi““
NegativoNegativoPositivoPositivo
InfezioneInfezione recenterecente
InfezioneInfezione cronicacronica in in pazientipazienti
immunocompromessiimmunocompromessi
PositivoPositivoNegativoNegativo
InfezioneInfezione attivaattiva ((acutaacuta o o cronicacronica))PositivoPositivoPositivoPositivo
InterpretazioneInterpretazioneHCV RNA/ HCV RNA/
HCV AgHCV AgAntiAnti--HCVHCV
1
10000
100000000
30-mar-09 15-mag-09 3-giu-09 30-giu-09 12-ott-09
HCV-RNA IU/mL
1
100
10.000
HCV Ag fmol/L
HCV-RNA
HCVAg
Anti-HCV+
Start of
treatment
InfezioneInfezione acutaacuta dada HCVHCV
M.C. Medici et al, J Clin Virol 2011; 51: 260-265
1.1. DiagnosiDiagnosi: : utilizzoutilizzo combinatocombinato deidei test per antitest per anti--HCV e HCV e del test del test hshs--HCV Core AgHCV Core Ag per per identificareidentificare le le fasifasiprecociprecoci didi infezioneinfezione acutaacuta
2.2. DiscrimineDiscrimine: : ilil test per HCV Ag test per HCV Ag puòpuò distingueredistinguere i i portatoriportatori didi HCV (con HCV (con possibilepossibile evoluzioneevoluzione in in cirrosicirrosiepaticaepatica o carcinoma o carcinoma epatocellulareepatocellulare) ) dalledalle infezioniinfezionipregressepregresse e e daidai pazientipazienti guaritiguariti
3.3. PopolazioniPopolazioni ad alto ad alto rischiorischio: : identificazioneidentificazione delledelleinfezioniinfezioni in in soggettisoggetti ((ancoraancora o o persistentementepersistentemente) ) negativinegativi per antiper anti--HCVHCV
UtilitUtilitàà clinicaclinica didi un test un test sensibilesensibile per HCV Core Agper HCV Core Ag
AlgoritmoAlgoritmo suggeritosuggerito per la per la diagnosidiagnosi didi infezioneinfezione dada
HCV in HCV in asintomaticiasintomatici
Test Test didi screening per antiscreening per anti--HCVHCV
Negativo
STOP
Positivo
O
RIBA per AntiRIBA per Anti--HCVHCV NAT per HCV RNANegativo
STOPUlterioriUlteriori test test didi laboratoriolaboratorio
((eses. PCR, ALT). PCR, ALT)
Negativo PositivoIndeterminato
ValutazioneValutazione
clinicaclinica
Positivo
PCR negativoALT normali
PCR positivo, ALT elevate
Da: MMWR 1998;47 (No. RR 19)
anti-HCV (Immunoassay)
Non reattivo (negativo)Reattivo
HCV Core Ag NO infezione da HCV?
Positivo Negativo
Infezioneda HCV
Infezione pregressa o falso positivo anti-HCV
HCV RNA
Positivo Negative
Infezioneda HCV
HCV: algoritmo potenziale (Prof. Roggendorf)
Alternativa: 2°test EIA o Immunoblot
Sierologia HCV Sierologia HCV -- considerazioniconsiderazioni
�� La positivitLa positivitàà anticorpaleanticorpale non persiste indefinitamente non persiste indefinitamente
dopo guarigionedopo guarigione
�� La frequenza di cronicizzazione La frequenza di cronicizzazione èè probabilmente probabilmente
inferiore a quanto attualmente considerato (80%)inferiore a quanto attualmente considerato (80%)
�� Gli studi trasversali sottostimano la diffusione Gli studi trasversali sottostimano la diffusione
delldell’’infezioneinfezione
�� I risultati I risultati ““borderlineborderline”” o negativi alti con i test di o negativi alti con i test di
screening, spesso discordanti e/o indeterminati ai test screening, spesso discordanti e/o indeterminati ai test
supplementari, indicano prevalentemente delle supplementari, indicano prevalentemente delle ““codecode””
di reattivitdi reattivitàà in via di risoluzionein via di risoluzione
HCV in Italia (popolazione aperta): alcuni studi
12,6
75,9
16,7
54,4
2,7
63,2
10,4
66,7
2,4
64,4
3,5
84,1
6,5
75,7
2,6
53,5
3,2
64,7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% p
os
itiv
ità
Guadagnino
(1997)
Maio (2000) Coppola
(2000)
Di Stefano
(2002)
Kondili
(2002)
Mazzeo
(2003)
Pendino
(2005)
Cozzolongo
(2009)
Zani (2011)
Anti-HCV+
HCV-RNA+