DOPPIA COLORAZIONE DOPPIA COLORAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA IMMUNOCITOCHIMICA

AUTOMATIZZATAAUTOMATIZZATA

M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani, M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani, e G.Zambonie G.Zamboni

Servizio di Anatomia Patologica, Ospedale S.Cuore – Don Calabria di Negrar (VR)

INTRODUZIONEL’ESAME CITOLOGICO è una metodica di ampio utilizzo.

Il suo potenziale diagnostico è affinato dall’ applicazione di procedure immunocitochimiche (ICC).

PROBLEMA: limitato numero di preparati disponibili.

SOLUZIONE: - divisione del preparato in più aree

- doppia colorazione ICC

INTRODUZIONE

RISULTATO: visualizzazione di due anticorpi diversi sulle medesime cellule.

La DOPPIA COLORAZIONE ICC utilizza due anticorpi sulle stesse cellule contemporaneamente.

La STANDARDIZZAZIONE della metodica con l’utilizzo di un IMMUNOCOLORATORE la rende eseguibile in 3.5 ore.

MATERIALE

LA DOPPIA COLORAZIONE ICC É APPLICABILE A:

• materiale citologico in fase liquida

• citocentrifugato di liquido endocavitario o endocistico

• materiale citologico strisciato ottenuto per agoaspirazione

Fissazione immediata del materiale dopo l’allestimento in alcool etilico 95° per almeno 15 minuti.

METODI

VARIABILI nella STANDARDIZZAZIONE AUTOMATIZZATA della metodica:

• materiale e fissazione

• recupero antigenico combinato per i due anticorpi

• denaturazione di eventuali legami aspecifici

• scelta degli anticorpi da abbinare

2. Incubazione del primo anticorpo

METODIPROTOCOLLO DI ESECUZIONE

3. Rivelazione con multimero coniugato con perossidasi

7. Rivelazione con multimero coniugato con fosfatasi

1. Eventuale recupero antigenico

5. Denaturazione a 90°C per 4 minuti

6. Incubazione del secondo anticorpo

8. Sviluppo con cromogeno FAST RED.

4. Sviluppo con cromogeno DAB.

METODI

- Anticorpi diretti contro antigeni presenti sulla stessa cellula ma con localizzazione differente (nucleare, citoplasmatica, di membrana).

- Anticorpi diretti contro antigeni presenti su cellule di diversa origine e mutuamente esclusivi.

ANTICORPI UTILIZZABILI CONTEMPORANEAMENTE:

APPLICAZIONI- Metastasi (linfonodale, epatica, polmonare) di origine sconosciuta combinando: CD45-Pan Citocheratina;antiEpatocitario-CK7; TTF1-CK20; CDX2-ER.

CD45 PAN CK

Metastasi linfonodale di carcinoma a piccole cellule

APPLICAZIONI- Metastasi (linfonodale, epatica, polmonare) di origine sconosciuta combinando: CD45-Pan Citocheratina;antiEpatocitario-CK7; TTF1-CK20; CDX2-ER.

Metastasi epatica di adenocarcinoma del polmone

antiEpatocyte CK7

APPLICAZIONI- Tipizzazione di carcinomi primitivi del polmone con:TTF1-CK7; P63-Sinaptofisina.

Adenocarcinoma primitivo del polmone

TTF-1 CK7

APPLICAZIONI- Diagnosi di processi linfoproliferativi con: CD3-CD20;Ciclina D1-CD5 e BCL6-CD23.

B-CLL (evidente infiltrato linfoide B)

CD3 CD20

APPLICAZIONI- Diagnosi di processi linfoproliferativi con: CD3-CD20;Ciclina D1-CD5 e BCL6-CD23.

B-CLL (evidente infiltrato linfoide B CD5+)

CD5 CD5+CD3

APPLICAZIONI- Discriminazione tra cellule epiteliali e mesoteliali in liquidi pleurici/peritoneali con: BerEP4(ESA)- Calretinina.

Liquido pleurico da metastasi di carcinoma mammario

BerEp4 Calretinina

CONCLUSIONE

La STANDARIZZAZIONE AUTOMATIZZATA della

DOPPIA COLORAZIONE ICC ha reso la metodica ancora

più facile e meno dispendiosa in termini di:

- tempo

- personale

- materiale cellulare impiegato