FERNANDA FUENTEALBAVALENTINA FUENTES

MACARENA LOBOCARLA MORA

ROMINA PULVERMÜLLERJONATHAN RIQUELME

FACULTAD DE MEDICINAESCUELA DE MEDICINABIOQUÍMICADOCENTES: Dr. REGINALDO DEL POZO

BQ. MIRNA MUÑOZMIÉRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010

TÉCNICAS

BIOQUÍMICAS:

• Método usado principalmente para laseparación de los componentes de unamuestra, en el cual los componentes sondistribuidos entre dos fases:

EstacionariaMóvil

• Las retenciones pueden tener su origen endos fenómenos de interacción entre las dosfases:

AdsorciónAbsorción

• Funciones:Separar los componentes de la

mezcla.Medir las proporciones de los

componentes.

• Tipos:Cromatografía planaCromatografía en columna

Método de separación que permite la separación demoléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica.

• Fase Estacionaria: Insoluble, lleva en la superficie cargaselectrostáticas fijas que retienen contraiones móviles quepueden intercambiarse por iones de la fase móvil.

• Fase Móvil: Disolución acuosa con cantidadesmoderadas de metanol u otro disolvente orgánicomiscible con agua que contiene especies iónicas enforma, generalmente de buffer. Los iones de la fase móvilcompiten con los analitos por los sitios activos de la faseestacionaria.

Principio: las moléculas cargadas se adhieren a losintercambiadores de forma reversible de modo que dichasmoléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando elambiente iónico.

La separación mediante intercambiadores iónicos se realizapor lo general, en dos fases:

1. Las sustancias a separar se unen al intercambiadorutilizando condiciones que originan una unión fuerte yestable.

2. Se eluye de la columna con tampones de diferentes pH odiferente fuerza iónica, compitiendo los componentesdel tampón con el material, por los sitios de unión.

Intercambiador Iónico: Polímero que tiene gruposcargados unidos.

Intercambiador Catiónico: Si un grupo está cargadonegativamente, podrá intercambiar iones positivos.

Un grupo típico que se utiliza en losintercambiadores de cationes es el grupo sulfónico,SO3

-. El grupo ácido sulfónico es un intercambiadorde cationes fuertemente acido. Otros grupos deutilización corriente son el carbonilo e hidroxilofenólico, dos intercambiadores catiónicos débilmenteácidos.

Intercambiador Aniónico: Si elgrupo cargado es positivo, es unintercambiador de aniones. Losintercambiadores aniónicosdébilmente básicos máscorrientes son grupos aminosalifáticos o aromáticos.

(1) Columna de vidrio(2) Matriz de intercambio

iónico (Resina) (3) Eluyente(4) Muestra a fraccionar (5) Colectores.

Equilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra asociada a ionescomplementarios (que pueden ser cloro o sodio).

Aplicación y Lavado: Aplicar la muestra la cual queremos filtrar através de la columna mediante un lavado específico. Se aplica unbuffer con el mismo pH y fuerza iónica que el buffer inicial para quetodas las proteínas cargadas se unan al intercambiador.

Elusión: Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídasdebido a cambios en la composición del buffer.

Regeneración: Remover las partículas que aún están asociadas alintercambiador. Se debe generar un cambio más drástico en el pH y laconcentración salina. La fase estacionaria puede volver a ser utilizada.

• ADSORCIÓN-La fuerza de adsorción aumentacon el aumento de carga neta.

• DESORCIÓN-Reducir la carga neta cambiando el pH-Agregar un ión que compita por lascargas del intercambiador.

(A) Resina de intercambio catiónico antes de añadir la muestra.(B) Se añade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys.(C) Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el aminoácido con menos carga

positiva eluye el primero.(D) Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser.(E) Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga positiva eluye

el último.

(A) (B) (C) (D) (E)

Ventajas: Alta capacidadAlta resoluciónPaso concentrador: Se puede sembrar un gran volumen para

luego eluirlo en un menor volumen.Con una misma columna se puede utilizar a diferentes pH y

obtener diversos perfiles de elución.

Desventajas:Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser aplicadas a

este tipo de cromatografía

• Tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna.

• Se basa en la atracción entre iones del soluto y la cargacomplementaria de la fase estacionaria. Los intercambiadoresiónicos favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior.Cuando la retención de los compuestos se ve afectada, se favorecela elusión de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones.

• Los intercambiadores iónicos se clasifican enácidos o básicos, fuertes o débiles.

• Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadasincluso en disoluciones muy ácidas, en cambiolas resinas ácidas débiles se protonan a un pHpróximo a 4 y pierden su capacidad deintercambio catiónico, reduciéndose así, eltiempo de retención.

• Los grupos muy básicos de amonio cuaternariosiguen siendo catiónicos a cualquier valor depH. Los básicos débiles de amonio terciario sedesprotonan en disoluciones moderadamentebásicas y pierden entonces su capacidad,reduciéndose también el tiempo de retención.

• La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de lacarga. La fuerza de retención es mayor y, por consiguiente la deelusión es menor, mientras más cargado se encuentre elcompuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes).

• Los iones polivalentes seunen con mayor fuerza a lafase estacionaria que losmonovalentes.

• Aumentando laconcentración de lafase móvil, los ionescompiten cada vezmás favorablementecon la muestra por lossitios activos cargadosde la faseestacionaria.

• En membranas cuyo tamaño de poro es pequeño no hay espaciosuficiente para unir el ión dentro de dichos poros por lo que lacantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor.

• En membranas con tamaño de poro mayor, se puede unir elcompuesto móvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementala cantidad de intercambiador por unidad de superficie. Laporosidad busca una mayor superficie de intercambio.

poro pequeño (menor

de 600Å) poro grande (mayor de 600Å)

• La conductividad de la fase móvil sehace muy elevada debido a la altaconcentración iónica necesaria para eluira la mayoría de los iones; esto hace muydifícil la detección de pequeñasconcentraciones de analito.

• Este problema se resolvió mediante unsistema supresor de conductibilidadcolocado a la salida de la columnacromatográfica.

• Los primeros supresores fueroncolumnas de intercambio iónico queconvierten los iones del disolvente enespecies moleculares poco ionizadas ypor lo tanto poco conductoras.

• El cromatograma es el resultadográfico de la cromatografía. En elcaso de separación óptima, losdiferentes picos o manchas delcromatograma se corresponden alos componentes de la mezclaseparada.

• La posición de los máximos nosindica el ión presente (carácterCualitativo) y su área nos indica lacantidad existente de dicho ión(carácter Cuantitativo).

•Una vez separada, la muestra pasaa través del detector donde seregistra la señal obtenida respectoal tiempo de retención.

• Registran los cromatogramas.

• Se emplean en la determinaciónde fluoruros, cloruros, nitritos,nitratos, bromuros fosfatos ysulfatos.

• MEDICIÓN DE LA

HEMOGLOBINA

GLICOSILADA.

• DETERMINACIÓN DE

PBG Y ALA EN LA

ORINA.

• El porcentaje de proteína unida a la glucosaes lo que se denomina hemoglobinaglicosilada (HbA1). Cuanto mayor es lacantidad de glucosa en la sangre, más se unea las proteínas y su porcentaje de uniónindica cual ha sido la cantidad media deglucosa circulante durante el tiempo de vidade la hemoglobina.

• Como los eritrocitos son fácilmentepermeables a la glucosa, el nivel de la HbA1en una muestra de sangre facilita la historiaglicémica de los 120 días anteriores, quecorresponde a la vida media de estas células.

HbA1c (%) Promedio de

Glicemias (mg/dl)

Calificación

5-6 80-120 Excelente

6-7 120-150 Muy Bueno

7-8 150-180 Bueno

8-9 180-210 Regular

9-10 210-240 Problemático

10-11 240-270 Malo

11-12 270-300 Muy Malo

• El método de cromatografía de intercambio iónico se basaen la elusión diferencial de la hemoglobina glicosilada por elcambio de carga que se produce en la molécula debido a laglicación del grupo amino terminal de la cadena. Para realizarel procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).

• Porfirias: grupo de enfermedades de origengenético o adquirido. Existe alteración en laactividad de una o varias enzimas de la víametabólica del grupo HEM, lo que ocasionaniveles anormalmente elevados de porfirinaso sus precursores (ácido delta-aminolevulínico[ALA] y porfobilinógeno [PBG]).

• Estos se acumulan en los tejidos y seexcretan en la orina y las heces. Lasmanifestaciones patológicas son producidascasi en su totalidad por los efectos sobre elsistema nervioso y la piel.

• La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es un desordenautosómico dominante, que causa deficiencia parcial de laactividad de la porfobilinógeno desaminasa (PBGD), terceraenzima de la ruta de síntesis del grupo HEM.

• Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis aguda,disminuye la actividad de la PBGD y, como consecuencia losniveles de BPG y/o ALA en la orina se incrementansignificativamente.

• Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de 20 a 200mg/día, cuyos valores de referencia son de 0-4 mg/día, y laexcreción de ALA se eleva aproximadamente a la mitad, 10-100mg/día, cuando sus valores de referencia son 0-7mg/día.

• El método de Mauzerall-Granick es el más usados para la cuantificaciónde estos dos precursores. Se basa en la técnica de cromatografía deintercambio iónico, en la cual se utilizan columnas con resinas aniónicas ycatiónicas.

• El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en la catiónica. En lacolumna con PBG, se utiliza ácido acético 1M para que éste eluya y puedaser cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1Mpara que éste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada columnareacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un producto rojo intenso.Este reactivo está conformado por 4-dimetilbenceno diluido en ácidoacético y ácido perclórico.

• El producto es medido espectrofotométricamente a 553 nm, y a partir deesta medición se puede calcular la concentración de estos intermediarios.

•Extracción y purificación de ácidos nucleicos•Purificación de agua•Purificación del fibrinógeno de la leche•Determinación de anticonvulsantes en el suero despuésde la extracción de la fase sólida.•Análisis de antibióticos de poliéter•Determinación de pesticidas.•Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.•Detección de derivación-fluorescencia post-columna paraanálisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .•Determinación de metabolitos de Triptofan en el sueroumbilical.

•Extracción y purificación de ácidos nucleicos•Purificación de agua•Purificación del fibrinógeno de la leche•Determinación de anticonvulsantes en el suero despuésde la extracción de la fase sólida.•Análisis de antibióticos de poliéter•Determinación de pesticidas.•Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.•Detección de derivación-fluorescencia post-columna paraanálisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .•Determinación de metabolitos de Triptofan en el sueroumbilical.