Cromatografia liquida ad alta prestazionenova.disfarm.unimi.it/cms/downloads/corsi/quantitativa/08 -...
Transcript of Cromatografia liquida ad alta prestazionenova.disfarm.unimi.it/cms/downloads/corsi/quantitativa/08 -...
Cromatografia liquida
ad alta prestazione
La cromatografia liquida ad alta prestazione (high performance liquid chromatography,
HPLC) si sviluppò negli anni ‘60 al fine di analizzare molecole che non potevano essere
trattate dalla normale gas cromatografia.
L’HPLC è l’evoluzione strumentale ad alta efficienza della cromatografia liquida su colonna.
HPLC
Le principali caratteristiche dell’HPLC possono essere così riassunte:
diametro particelle impaccamento efficienza resistenza flusso percolazione
In conseguenza a ciò, è necessario aumentare la pressione per forzare il solvente attraverso
l’impaccamento costituito da particelle fini.
Effetto del diametro delle particelle
Diametro 10 µm Diametro 5 µm
Prestazioni in funzione del diametro delle particelle
Dimensioni delle
particelle dp (mm)
Tempo di
ritenzione (min)
Numero piatti
teorici (N)
Pressione
necessaria (bar)
5,0 30 25 000 19
3,0 18 42 000 87
1,5 9 83 000 700
1,0 6 125 000 2300
Schema di un cromatografo HPLC
Fase mobilePompe
Autocampionatore
Iniettore
Colonna
Detector
Computer
Cromatografo HPLC
Fase mobile
Pompe
Iniezione
Detector
Peso molecolare e metodica cromatografica
1° metodo di classificazione (basato sulle fasi mobile e stazionaria):
cromatografia normale o a fase diretta (fase stazionaria idrofila, fase mobile lipofila);
cromatografia a fase inversa (fase stazionaria lipofila, fase mobile idrofila).
Classificazione delle tecniche HPLC1
Interazione del naproxene con la superficie del gel di silice (sinistra) e del gel di silice ODS
(funzionalizzato con catene C18, destra).
2° metodo di classificazione (basato sul meccanismo di separazione):
cromatografia di adsorbimento liquido-solido;
cromatografia di ripartizione liquido-liquido;
cromatografia di esclusione;
cromatografia di scambio ionico;
cromatografia di affinità.
Classificazione delle tecniche HPLC2
Il supporto più comune per la fase stazionaria è costituito da particelle microporose
di silice di forma sferica:
La fase stazionaria1
Attenzione:
La silice non può essere usata per pH > 12 in quanto si scioglie. Infatti, per 8 < pH <
12 si usano matrici polimeriche come il polistirene.
gruppi silanolici liberi: mediamente acidi. A pH 2-3
sono completamente protonati; a pH > 3 si
dissociano a gruppi Si-O-;
gruppi silanolici geminiali: non acidi
gruppi silanolici vicinali: non acidi
La fase stazionaria2
Gruppi silanolici vicinali con legame d’idrogeno
Legami silossanici
Gruppi silanolici
geminali
Gruppi silanolici
isolati
Le particelle di gel di silice possono
costituire la fase stazionaria per la
cromatografia a fase normale di
adsorbimento oppure la base per le
fasi legate.
Funzionalizzazione della silice1
1) -Si-OH + R-OH -Si-O-R + H2O
2) -Si-OH + SOCl2 -Si-Cl + SO2 + HCl
-Si-Cl + R-NH2 -Si-NH-R + HCl
3) -Si-OH + Cl-Si(CH3)2-R -Si-O-Si(CH3)2-R + HCl
150-180° C
3-8 h
Ambiente
anidro
La silice esterificata (1) è suscettibile all’idrolisi e pertanto non si può usare per fasi
acquose o alcoli. Le fasi stazionarie più stabili sono quelle con formula Si-O-Si-R e
cioè con un legame silossanico (3).
Funzionalizzazione della silice2
4) -Si-OH + Cl – Si – Cl -Si-O – Si – Cl + HClAmbiente
anidro
R
|
|
R
R
|
|
R
-Si-O – Si – OH + HCl
R
|
|
R
H2O
-Si-O – Si – OH + Cl – Si – Cl -Si-O – Si – O – Si – O – H
R
|
|
R
R
|
|
R
R
|
|
R
R
|
|
R n
H2O
Dialchilsilil dicloruro
Funzionalizzazione della silice3
Gruppo Formula Gruppo Formula
Triacontil -(CH2)29CH3 Amino -NH2
Docosil -(CH2)21CH3 Nitro -NO2
Octadecil -(CH2)17CH3 Nitrile -CN
Octil -(CH2)7CH3 Ossipropionitrile -OCH2CH2CN
Exil -(CH2)5CH3 Diolo vicinale -CH(OH)CH2OH
Trimetil -Si(CH3)3 Fluoro alchile -(CF2)nCF3
Alchilcarbammato -COCONH-(CH2)n-CH3
Cicloesil -C6H11 Policaprolattame
(poliammide, nylon)-[NH(CH2)5C=O]n-
Fenil -C6H5
Difenil (-C6H5)2
Dimetilammino -N(CH3)2
La silice può essere funzionalizzata con
diversi gruppi adatti per cromatografia a
scambio ionico, ripartizione, ecc.
Fasi mobili acide (pH < 2) tendono ad idrolizzare i legami silossanici della fase
stazionaria:
R-Si-O-Si-R’ R-Si-OH + HO-Si-R’
Il problema si risolve inserendo sostituenti ingombranti come l’isobutile.
Fase stazionaria e pH
Idrolisi acida
Gruppi funzionali
ingombranti
La scelta della fase mobile dipende dalla fase stazionaria (fase mobile lipofila in
cromatografia normale e polare-mediamente polare in fase inversa). I requisiti
fondamentali che una fase mobile per HPLC deve avere sono:
La fase mobile1
bassa viscosità;
immiscibilità con la fase stazionaria;
capacità di solubilizzare il campione;
compatibilità con il rivelatore;
bassa corrosività;
bassa volatilità;
basso costo;
elevata purezza.
La forza (°) è il parametro
che definisce la forza di
eluizione del solvente
quando usato come fase
mobile sul gel di silice.
La viscosità deve essere
inferiore a 1.
La fase mobile2
SolventeForza
0
Viscosità
(mPa s)
Indice di
rifrattività
n20D
UV
cutoff
(nm)
Teb
(°C)
Dipolo
p
Acidità
a
Basicità
b
Fluoroalcano FC78 -0,19 0,4 1,267 210 50
n-Pentano 0,00 0,23 1,3575 195 36
n-Esano 0,00 0,33 1,3749 190 69
Isottano 0,01 0,50 1,3914 200 99
Cicloesano 0,03 1,00 1,4262 200 81
Ciclopentano 0,04 0,47 1,4064 200 49
Tetracloruro di carbonio 0,14 0,97 1,4652 265 77
p-Xilene 0,20 0,62 1,4958 290 138 0,81 0,00 0,19
Etere diisopropilico 0,22 0,37 1,3681 220 68 0,36 0,00 0,64
Toluene 0,22 0,59 1,4969 285 111 0,83 0,00 0,17
Clorobenzene 0,23 0,80 1,5248 290 132 0,91 0,00 0,09
Benzene 0,25 0,65 1,5011 280 80 0,86 0,00 0,14
Erere dietilico 0,29 0,24 1,3524 205 34,5 0,36 0,00 0,64
Diclorometano 0,30 0,44 1,4242 230 40 0,73 0,27 0,00
Cloroformio 0,31 0,57 1,4457 245 61 0,57 0,43 0,00
1,2-Dicloroetano 0,38 0,79 1,4448 230 83 1,00 0,00 0,00
La fase mobile3
SolventeForza
0
Viscosità
(mPa
s)
Indice di
rifrattività
n20D
UV
cutoff
(nm)
Teb
(°C)
Dipolo
p
Acidità
a
Basicità
b
Trietilammina 0,42 0,38 1,4010 230 89 0,16 0,00 0,84
Acetone 0,43 0,32 1,3587 330 56 0,56 0,06 0,38
Diossano 0,43 1,54 1,4224 220 101 0,60 0,00 0,40
Acetato di metile 0,46 0,37 1,3614 260 56 0,55 0,05 0,40
Tetraidrofurano 0,48 0,46 1,4072 220 66 0,51 0,00 0,49
t-butilmetil etere 0,48 0,35 1,3689 220 53 0,36 0,00 0,64
Acetato d’etile 0,48 0,45 1,3724 260 77 0,55 0,00 0,45
Dimetilsolfossido 0,48 2,24 1,4783 270 189 0,57 0,00 0,43
Nitrometano 0,49 0,67 1,3819 380 101 0,64 0,17 0,19
Acetonitrile 0,50 0,37 1,3441 190 82 0,60 0,15 0,25
Piridina 0,55 0,94 1,5102 305 115 0,58 0,00 0,42
Isopropanolo 0,60 2,3 1,3772 210 82 0,22 0,35 0,43
Etanolo 0,68 1,20 1,3614 210 78 0,25 0,39 0,36
Metanolo 0,73 0,60 1,3284 205 65 0,28 0,43 0,29
Acido acetico High 1,26 1,3719 260 118 0,31 0,54 0,15
Acqua Higher 1,00 1,3330 <190 100 0,39 0,43 0,18
Soluzioni saline, tamponi Highest
La fase mobile può essere costituita da un unico solvente o da una miscela di solventi e la
composizione può essere costante nel tempo (eluizione isocratica) o variabile (eluizione in
gradiente).
Fase mobile costituita da una miscela
Miscela di solventi
incompatibili
Eluizione con miscela di solventi1
Si supponga di aver effettuato
diverse analisi HPLC in condizioni
isocratiche con una fase mobile
composta da due solventi (A e B) in
differenti rapporti A/B: 10/90, 20/80,
30/70, 40/60, 50/50, 40/60, 30/70 e
35/65.
Eluizione con miscela di solventi2
Eluizione in gradiente
B = CH3CN - acetonitrile
Eluizione di composti neutri:
il tempo di eluizione di un composto neutro è determinato dal bilancio tra la sua polarità e la
sua lipofilia, mentre il pH della fase mobile non esercita alcun effetto. Nel caso della
cromatografia a fase inversa, quanto più il composto è lipofilo, tanto più è trattenuto dalla fase
stazionaria, mentre la situazione si inverte nel caso della cromatografia a fase diretta.
Fattori strumentali1
Eluizione di composti ionizzabili:
è necessaria una fase mobile tamponata per ottenere gli analiti nella forma completamente
indissociata (cromatografia di ripartizione) o dissociata (es. cromatografia scambio ionico). Nel
caso di analiti acidi, il pH deve essere almeno di due unità inferiori al pKa per avere l’analita in
forma completamente indissociata, mentre, nel caso di composti basici, il pH deve essere
maggiore di due unità rispetto alla pKa.
Fattori strumentali2
Scelta della modalità di separazione1
Massa molecolare < 2000
Solubile in solventi organici
Solubile in solventi
apolari o debolmente
polari
(da esano a CHCl3)
Solubile in solventi
moderatamente
polari
(da CHCl3 a CH3OH)
Cromatografia a
fase inversa legata
C18, C8, C4, C2, C1,
fenile, ciano
Solubile in
CHCl3
Cromatografia di
adsorbimento
Silice
Solubile in alcol,
acetonitrile o acetato
d’etile
Cromatografia in
fase inversa legata
Ciano, ammino,
diolo
Solubile in acqua
Composto non
ionico o coppia
ionica
Composto ionico
Cromatografia in
fase normale
Ciano, ammino
Cromatografia
ionica o a scambio
ionico
Scelta della modalità di separazione2
Massa molecolare > 2000
Solubile in solventi organici
Dimensione della
molecola < 30 nm
Dimensione della
molecola 30-400 nm
Cromatografia a
fase inversa legata
C18, C8, C4
Cromatografia per
esclusione
molecolare
Solubile in acqua
Composto non
ionico o coppia
ionica
Composto ionico
Cromatografia in
fase inversa legata
o per interazione
idrofobica
C18, C8, C4 o resina
polifenolica o
poliestere
Cromatografia
ionica o a scambio
ionico
Dimensione della
molecola < 30 nm
Dimensione della
molecola 30-400 nm
Cromatografia per
esclusione
molecolare
Valvola d’iniezione
Sistema di pompaggio (pompa alternativa)
La pompa è costituita da un pistone in zaffiro traslato avanti e indietro da un motore elettrico
connesso ad un manovellismo. Quando il pistone è traslato verso sinistra, la depressione fa
aprire la valvola a sfera inferiore consentendo l’aspirazione del solvente. Quando, invece, il
pistone è traslato verso destra, la sovrapressione fa chiudere la valvola inferiore ed aprire
quella superiore, spingendo il liquido in colonna. Lo smorzatore di impulsi compensa la
discontinuità del flusso e di pressione dovuto al movimento oscillante del pistone.
Sistema di smorzamento
Lo smorzatore di impulsi compensa la discontinuità del flusso e di pressione dovuto
al movimento oscillante del pistone. Può essere di diverso tipo:
Tempo
Pre
ssio
ne
Pulsazioni non smorzate
Pulsazioni smorzate
sistema spirale: ad ogni colpo del pistone la spirale aumenta il diametro
assorbendo l’energia della pulsazione;
smorzamento a membrana: una membrana separa la fase mobile da un liquido
parzialmente comprimibile.
Pompa alternativa a doppia testata
Nella pompa alternativa a doppia testata, i
due pistoni lavorano in opposizione,
ovverosia quando uno comprime, l’altro
aspira e viceversa. L’onda di pressione
risultante di una pompa è sfasata di 180
gradi rispetto all’altra. Come risultato, si
ha una pressione maggiormente costante.
Tempo
Pre
ssio
ne
Pompa A
Pompa B
Smorzato
Miscelazione dei solventi
Miscelazione ad alta pressione Miscelazione a bassa pressione
Tipologie di rivelatori
Rivelatore HPLCDisponibile in
commercio
LOD in massa
(tipico)
Intervallo
lineare (decadi)
Assorbanza Si 10 pg 3-4
Fluorescenza Si 10 fg 5
Elettrochimico Si 100 pg 4-5
Indice di rifrazione Si 1 ng 3
Conducibilità Si 100 pg-1 ng 5
Spettrometria di massa Si < l pg 5
FTIR Si 1µg 3
A dispersione di luce Si 1µg 5
Ad attività ottica No 1 ng 4
Selettivo per l'elemento No 1 ng 4-5
Fotoionizzazione No < 1 pg 4
Rivelatore UV
Analisi quantitativa
in HPLC
Metodo dello standard esterno.
Metodo dello standard interno.
Metodo delle aggiunte standard.
Normalizzazione.
Metodi di analisi quantitativa in HPLC
I metodi di analisi quantitativa in HPLC possono essere così riassunti:
preparare le soluzioni di riferimento contenenti lo standard di analita (a purezza
certificata) mediante il metodo della diluizione progressiva;
analizzare le soluzioni standard separatamente dal campione;
riportare le aree relative ai picchi delle soluzioni di riferimento in un grafico
rispetto alle relative concentrazioni;
calcolare la retta di calibrazione col metodo dei minimi quadrati;
analizzare il campione e, dal valore di area del picco (valore y) e dall’equazione
della retta di calibrazione, determinare la concentrazione (valore di x).
Metodo dello standard esterno
Per utilizzare il metodo dello standard esterno si deve:
In alternativa, se è nota una risposta lineare in un determinato intervallo di
concentrazioni, si può eseguire una calibrazione ad un solo punto con una sola
soluzione standard.
nella provetta A, mettere 1 ml di
soluzione di partenza e aggiungere 9 ml
di solvente (diluizione 1:10);
nella provetta B, mettere 1 ml di
soluzione A e aggiungere 9 ml di
solvente (diluizione 1:10 rispetto ad A e
1:100 rispetto alla soluzione di partenza);
nella provetta C, mettere 1 ml di
soluzione B e aggiungere 9 ml di
solvente (diluizione 1:10 rispetto ad B e
1:1000 rispetto alla soluzione di
partenza);
ecc.
Diluizioni progressive
La diluizione progressiva o seriale è un procedimento ripetuto per ottenere una
diluizione geometrica o progressiva della soluzione originale.
Dal punto di vista pratico, nel caso di una diluizione seriale decimale, si parte da
una soluzione a concentrazione nota:
Si allestisce la curva di calibrazione utilizzando lo standard certificato dell’analita
A alle seguenti concentrazioni: 100, 150, 200 e 250 ng/ml. L’analisi HPLC
fornisce le seguenti aree riferite ai picchi cromatografici:
Esempio dell’uso del metodo dello std. esterno1
Si supponga di voler determinare il contenuto dell’analita A presumendo che la sua
concentrazione sia compresa in un intervallo fra 100 e 250 ng/ml.
Conc. sol. std.
(ng/ml)Area picco
100 110952
150 159143
200 221645
250 270045
Esempio dell’uso del metodo dello std. esterno2
Si calcola equazione della curva di calibrazione:
y = 1079,6x + 1522,9
R2 = 0,9972
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 50 100 150 200 250 300
Concentrazione (ng/ml)
Are
a d
el
pic
co
Il campione viene quindi analizzato nelle stesse condizioni della soluzione
standard e l’area del picco risulta di 175432.
Esempio dell’uso del metodo dello std. esterno3
La concentrazione del campione incognito si calcola sulla base dell’equazione
della retta:
y = 1080 x + 1523
sostituendo:
175432 = 1080 x + 1523
x = (175432 - 1523) / 1080= 161,0
La concentrazione del campione incognito risulta pertanto di 161 ng/ml.
Standard esterno con calibrazione ad un punto1
Una soluzione standard è preparata sciogliendo 103,5 mg di uno composto di
riferimento in 500 ml di solvente.
Un’aliquota pari a 25 µl è iniettata in una colonna HPLC e l’area del picco risulta
pari a 153885.
99,6 mg del campione da analizzare sono sciolti in 500 ml, 25 µl dei quali sono
stati iniettati nella colonna.
l’aera del picco risultante è stata di 147906.
La concentrazione incognita si determina dalla seguente proporzione:
As / Ar = Cs / Cr
dove: As e Cs sono l’area del picco e la concentrazione dello standard, mentre Ar e
Cr sono l’area del picco e la concentrazione dell’analita. Da cui deriva:
Cr = Cs . Ar / As
La concentrazione dello standard di riferimento è:
103,5 mg / 500 mg/ml = 0,21 mg/ml
La concentrazione di Cr è:
Cr = Cs . Ar / As = 0,21 x 147906 / 153885 = 0,19 mg/ml
La quantità del campione nella soluzione incognita risulta:
0,19 mg/ml . 500 ml = 95,0 mg
Purezza = 95 mg / 99,6 mg . 100 = 95,4 %
Standard esterno con calibrazione ad un punto2
Metodo dello standard interno
Il metodo dello standard interno permette di compensare gli errori analitici legati
alla preparazione del campione e all’analisi strumentale (es. variabili legate alla
quantità di campione iniettato).
Rispetto al metodo dello standard esterno, prevede l’aggiunta di un composto
chiamato standard interno a concentrazione nota, sia alle soluzioni di riferimento
(bianchi) per ottenere la curva di calibrazione, sia al campione da determinare.
Nell’allestimento della curva di calibrazione, si considera il rapporto delle aree tra
analita/standard interno.
Qualora non si utilizzi uno spettrometro di massa come analizzatore, lo standard
interno deve essere un analogo dell’analita e, in particolare, deve:
• essere separato dall’analita e dagli altri componenti il campione;
• avere proprietà chimico-fisiche analoghe al campione;
• avere una risposta al detector simile all’analita;
• essere presente in una concentrazione dello stesso ordine di grandezza
dell’analita incognito.
Esempio dell’uso del metodo dello std. interno1
Si supponga di voler determinare il contenuto dell’analita A, presupponendo che la
sua concentrazione sia in un intervallo fra 100 e 250 ng/ml.
Si allestisce la curva di calibrazione utilizzando uno standard certificato
dell’analita A a concentrazioni di 100, 150, 200 e 250 ng/ml. A tali soluzioni si
aggiunge lo standard interno alla concentrazione di 150 ng/ml.
L’analisi HPLC fornisce le seguenti aree riferite ai picchi cromatografici dello
standard interno e dello standard dell’analita:
Conc. std
(ng/ml)Area std Area std interno Rapporto aree
100 110952 164302 0,675293
150 159143 163997 0,970402
200 221645 164204 1,34988
250 270045 164289 1,64371
Si calcola l’equazione della curva di calibrazione:
Esempio dell’uso del metodo dello std. interno2
y = 0,0066x + 0,0102
R2 = 0,9973
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 50 100 150 200 250 300
Concentrazione (ng/ml)
Rap
po
rto
are
e
Lo standard interno viene quindi aggiunto in quantità nota (150 ng/l) all’analita
dalla cui analisi è stata determinata l’area del picco sia dello standard interno
(164105) sia quella dell’analita (175432). Il cui rapporto delle aree è pari a
1,069023.
Esempio dell’uso del metodo dello std. interno3
La concentrazione del campione incognito si calcola sulla base dell’equazione
della retta:
y = 0,0066 x + 0,0102
sostituendo:
1,069023 = 0,0066 x + 0,0102
x = (1,069023 - 0,0102) / 0,0066 = 160,4
La concentrazione del campione incognito risulta pertanto di 160,4 ng/ml.
Metodo delle aggiunte standard
Il metodo delle aggiunte standard è utilizzato quando si vuole determinare la
concentrazione di un analita sciolto in una matrice che contiene sostanze che
possono interferire con la risposta dell’analita al detector.
Si aggiungono quantità note e crescenti di standard a volumi noti e costanti della
soluzione del campione incognito.
Esempio dell’uso del metodo delle aggiunte std.1
A volumi di 5 ml della soluzione incognita si aggiungono 0,25, 0,50 e 0,75 ml di
una soluzione di riferimento avente una concentrazione pari a 10 ng/ml. Il volume
di ogni soluzione è portato a un volume finale di 10 ml con il solvente.
Per ogni campione si determina l’area del picco, dovuta al campione incognito e
allo standard aggiunto:
SoluzioneConc. analita
(ng/ml)Area
S1 x 99151
S2 x + 0,25 149987
S3 x + 0,50 200132
S4 x + 0,75 249889
Esempio dell’uso del metodo delle aggiunte std.2
Si calcola l’equazione della curva di calibrazione:
y = 200944x + 99436
R2 = 1
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Concentrazione (ng/ml)
Are
a
Esempio dell’uso del metodo delle aggiunte std.3
La concentrazione del campione incognito (S1) si calcola sulla base
dell’equazione della retta:
y = 200944 x + 99436
ponendo y = 0:
0 = 200944 x + 99436
x = 99436 / 200944 = 0,495
Dato che S1 è diluito da 5 a 10 ml (diluizione 1:2), la concentrazione effettiva è
pari a:
x = 0,495 . 2 = 0,99
La concentrazione del campione incognito risulta pertanto di 0,99 ng/ml.
Metodo della normalizzazione
E’ un’analisi semiquantitativa che fornisce il contenuto % di un analita.
Si può applicare quando i componenti della miscela forniscono una risposta
simile al detector.
Il risultato quantitativo è espresso calcolando l’area del picco dell’analita rispetto
alla somme delle aree dei componenti la miscela:
dove A è l’area dell’analita A.
100Area
AreaA(%)
n
1i i
A
Applicazione del metodo della normalizzazione
Una miscela di 10 componenti è separata mediante analisi HPLC. La somma
delle aree dei 10 componenti è pari a 12533495 e l’area del picco A è pari a
957512. La % di A nella miscela risulta:
A(%) = (957512 / 12533495) x 100 = 7,64 %
Applicazioni dell’HPLC
Ampicillinum anhydricum
C16H19N3O4S
Mr 349.4
DEFINITION
Anhydrous ampicillin contains not less than 96.0 per cent and not more than the
equivalent of 100.5 per cent of (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-
3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid, calculated
with reference to the anhydrous substance.
ASSAY
Examine by liquid chromatography (2.2.29).
Test solution (a). Dissolve 27.0 mg of the substance to be examined in mobile
phase A and dilute to 50.0 ml with the same solvent.
Ampicillin, anhydrous1
Test solution (b). Dissolve 27.0 mg of the substance to be examined in mobile
phase A and dilute to 10.0 ml with the same solvent.
Reference solution (a). Dissolve 27.0 mg of anhydrous ampicillin CRS in mobile
phase A and dilute to 50.0 ml with the same solvent.
Reference solution (b). Dissolve 2.0 mg of cefradine CRS in mobile phase A and
dilute to 50 ml with the same solvent. To 5.0 ml of this solution add 5.0 ml of
reference solution (a).
Reference solution (c). Dilute 1.0 ml of reference solution (a) to 20.0 ml with mobile
phase A.
Reference solution (d). Dilute 1.0 ml of reference solution (c) to 25.0 ml with mobile
phase A.
Ampicillin, anhydrous2
The chromatographic procedure may be carried out using:
— a column 0.25 m long and 4.6 mm in internal diameter packed with octadecylsilyl
silica gel for chromatography R (5 µm),
— as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min:
Mobile phase A. A mixture of 0.5 ml of dilute acetic acid R, 50 ml of 0.2 M potassium
dihydrogen phosphate R and 50 ml of acetonitrile R, diluted to 1000 ml with
water R,
Mobile phase B. A mixture of 0.5 ml of dilute acetic acid R, 50 ml of 0.2 M potassium
dihydrogen phosphate R and 400 ml of acetonitrile R, diluted to 1000 ml with
water R,
— as detector a spectrophotometer set at 254 nm,
— a 50 µl loop injector.
Ampicillin, anhydrous3
Equilibrate the column with a mobile phase with ratio A:B of 85:15. Inject reference
solution (b). The test is not valid unless the resolution between the two principal
peaks is at least 3.0. If necessary, adjust the ratio A:B of the mobile phase. The
mass distribution ratio for the first peak (ampicillin) is 2.0 to 2.5. Inject reference
solution (d). Adjust the system to obtain a peak with a signal-to-noise ratio of at
least 3. Inject reference solution (a) 6 times. The test is not valid unless the relative
standard deviation for the area of the principal peak is at most 1.0 per cent. Inject
alternately test solution (a) and reference solution (a).
Calculate the percentage content of ampicillin.
Ampicillin, anhydrous4
Related substances.
Examine by liquid chromatography (2.2.29) as described under Assay. Inject reference
solution (c) and elute isocratically. Inject freshly prepared test solution (b) and start the elution
isocratically. Immediately after elution of the ampicillin peak start the following linear gradient.
If the mobile phase composition has been adjusted to achieve the required resolution, the
adjusted composition will apply at time zero in the gradient.
Ampicillin, anhydrous5
Time
(min)
Mobile phase A
(per cent V/V)
Mobile phase B
(per cent V/V)
0 85 15
30 0 100
45 0 100
Equilibrate the column with the originally chosen mobile phase for 15 min. Inject mobile
phase A and use the same elution gradient to obtain a blank. In the chromatogram obtained
with test solution (b), the area of any peak, apart from the principal peak and any peak
observed in the blank chromatogram, is not greater than the area of the principal peak in the
chromatogram obtained with reference solution (c) (1.0 per cent).
Liquiritiae radix
DEFINITION
Liquorice root consists of the dried unpeeled or peeled, whole or cut root and stolons of
Glycyrrhiza glabra L. and/or of Glycyrrhiza inflata Bat. and/or Glycyrrhiza uralensis Fisch. It
contains not less than 4.0 per cent of glycyrrhizic acid (C42H62O16; Mr 823), calculated with
reference to the dried drug.
ASSAY
Examine by liquid chromatography (2.2.29).
Test solution. Place 1.000 g of the powdered drug (180) in a 150 ml ground glass conical flask.
Add 100.0 ml of an 8 g/l solution of ammonia R and treat in a ultrasonic bath for 30 min.
Centrifuge a part of the supernatant layer and dilute 1.0 ml to 5.0 ml with an 8 g/l solution of
ammonia R. Filter the solution through a filter (0.45 µm) and use the filtrate as the test
solution.
Solution A. Dissolve 0.130 g of monoammonium glycyrrhizate CRS in an 8 g/l solution of
ammonia R and dilute to 100.0 ml with the same solvent.
Reference solution (a). Dilute 5.0 ml of solution A to 100.0 ml with an 8 g/l solution of
ammonia R.
Reference solution (b). Dilute 10.0 ml of solution A to 100.0 ml with an 8 g/l solution of
ammonia R.
Reference solution (c). Dilute 15.0 ml of solution A to 100.0 ml with an 8 g/l solution of
ammonia R.
Liquorice root1
The chromatographic procedure may be carried out using:
— a stainless steel column 0.10 m long and 4 mm in internal diameter packed with
octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 µm),
— as mobile phase at a flow rate of 1.5 ml/min a mixture of 6 volumes of glacial
acetic acid R, 30 volumes of acetonitrile R and 64 volumes of water R,
— as detector a spectrophotometer set at 254 nm,
— a 10 µl loop injector.
Inject reference solution (c). Adjust the sensitivity of the system so that the height of
the peaks are at least 50 per cent of the full scale of the recorder. Inject each
reference solution and determine the peak areas.
Establish a calibration curve with the concentration of the reference solutions
(g/100 ml) as the abscissa and the corresponding areas as the ordinate.
Inject the test solution. Using the retention time and the peak area determined from
the chromatograms obtained with the reference solutions, locate and integrate the
peak due to glycyrrhizic acid in the chromatogram obtained with the test solution.
Liquorice root2
Calculate the percentage content of glycyrrhizic acid from the following expression:
Liquorice root3
840
822B
m
5AConc
A = concentration of monoammonium glycyrrhizate in the test solution
determined from the calibration curve, in g/100 ml;
B = declared percentage content of monoammonium glycyrrhizate CRS;
m = mass of the drug, in grams;
822 = molecular weight of glycyrrhizic acid;
840 = molecular weight of the monoammonium glycyrrhizate (without any water
of crystallisation).
Fluoxetini hydrochloridum
C17H19CIF3NO
Mr 345.8
DEFINITION
Fluoxetine hydrochloride contains not less than 98.0 per cent and not more than the
equivalent of 102.0 per cent of (3RS)-N-methyl-3-phenyl-3-[4-
trifluoromethyl)phenoxy]propan-1-amine hydrochloride, calculated with reference to
the anhydrous, acetonitrile-free substance.
Fluoxetine hydrochloride1
ASSAY
Examine by liquid chromatography (2.2.29).
Test solution. Dissolve 55.0 mg of the substance to be examined in the mobile phase and
dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Dilute 10.0 ml of the solution to 100.0 ml with the
mobile phase.
Reference solution. Dissolve 55.0 mg of fluoxetine hydrochloride CRS in the mobile phase and
dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Dilute 10.0 ml of the solution to 100.0 ml with the
mobile phase.
The chromatographic procedure may be carried out using:
— a stainless steel column 0.25 m long and 4.6 mm in internal diameter packed with octylsilyl
silica gel for chromatography R (5 µm),
— as mobile phase at a flow rate at 1 ml/min a mixture of 8 volumes of methanol R,
30 volumes of tetrahydrofuran R and 62 volumes of a solution of triethylamine R prepared as
follows: to 10 ml of triethylamine R, add 980 ml of water R, mix and adjust to pH 6.0 with
phosphoric acid R (about 4.5 ml) and dilute to 1000 ml with water R,
— as detector a spectrophotometer set at 227 nm.
Fluoxetine hydrochloride2
When using a recorder, adjust the sensitivity of the system so that the height of the
principal peak in the chromatogram obtained with reference solution is at least
50 per cent of the full scale of the recorder.
Adjust the volumes of methanol and the solution of triethylamine in the mobile
phase so that the retention time of fluoxetine is between 10 min and 18 min.
The assay is not valid unless the symmetry factor calculated at 10 per cent of the
height of the peak due to fluoxetine is at most 2.0.
Inject 10 µl of the test solution and 10 µl of the reference solution.
Calculate the content of fluoxetine hydrochloride (C17H19CIF3NO) from the area of
the peaks in the chromatograms obtained with the test solution and the reference
solution using the stated content of C17H19CIF3NO in fluoxetine hydrochloride CRS
and correcting for the content of water and of acetonitrile in the substance to be
examined.
Fluoxetine hydrochloride3
Antazolina e nafazolina soluzione oftalmica
Il collirio di antazolina e nafazolina soddisfa anche ai requisiti definiti nella
monografia Preparazioni oftalmiche (1163).
DEFINIZIONE
Il collirio di antazolina e nafazolina ha la seguente composizione:
Antazolina solfato 0,50 g
Nafazolina nitrato 0,025 g
Sodio cloruro 0,80 g
Benzalconio cloruro 0,010 g
Acqua depurata q.b. a 100 ml
Contenuto di antazolina solfato ((C17H19N3)2.H2SO4): non meno del 90,0 per cento e
non più del 110,0 per cento della quantità indicata in etichetta.
Contenuto di nafazolina nitrato (C14H14N2.HNO3): non meno del 90,0 per cento e
non più del 110,0 per cento della quantità indicata in etichetta.
Antazolina e nafazolina collirio soluzione1
DETERMINAZIONE QUANTITATIVA
Esaminare mediante cromatografia liquida (2.229).
Soluzione in esame. Diluire un volume di preparazione in esame, esattamente
misurato e corrispondente a circa 0,25 mg di nafazolina nitrato, a 20,0 ml con la
fase mobile.
Soluzione di riferimento. Disciogliere 0,5 g di antazolina solfato SCR e 25 mg di
nafazolina nitrato SCR nella fase mobile e diluire a 100 ml con la fase mobile.
Prelevare 1 ml e diluire a 20 ml sempre con la fase mobile.
Il procedimento cromatografico può essere eseguito usando:
- una colonna di acciaio inossidabile lunga 0,30 m e con diametro interno di 3,9 mm
impaccata con gel di silice ottadecilsililato per cromatografia R (10 mm),
- come fase mobile, ad una velocità di flusso di 1,0 ml per minuto, una miscela di 45
volumi di metanolo R e 55 volumi di una soluzione allo 0,3 per cento di ammonio
fosfato dibasico R (aggiustata a pH 4,0 con acido fosforico R),
Antazolina e nafazolina collirio soluzione2
- come rivelatore uno spettrofotometro regolato a 280 nm,
- un iniettore a volume fisso.
Iniettare, per 6 volte, 20 ml della soluzione di riferimento e registrare il
cromatogramma. La determinazione quantitativa è valida solo se la deviazione
standard relativa delle aree ottenute per l'antazolina solfato è al massimo dell'1,5
per cento e se la risoluzione fra i picchi della antazolina solfato e nafazolina nitrato
è almeno 7,0; se necessario aggiustare le concenrazioni dei componenti della fase
mobile in modo da ottenere la risoluzione richiesta. Iniettare 20 ml della soluzione di
riferimento e registrare il cromatogramma. Iniettare 20 ml della soluzione in esame e
registrare il cromatogramma alla stessa maniera. Calcolare il contenuto di
(C17H19N3)2.H2SO4 e C14H14N2.HNO3 dalle aree dei picchi ottenuti con la soluzione
in esame e la soluzione di riferimento.
Antazolina e nafazolina collirio soluzione3
Iodio-iodurato unguento
L’unguento di iodio soddisfa anche i requisiti definiti nella monografia Preparazioni
semisolide per applicazione cutanea (0132).
Potassio ioduro. Esaminare mediante cromatografia liquida (2.2.29) a scambio
ionico.
Soluzione in esame. Trasferire 0,100 g di preparazione, esattamente pesati, in un
becher da 150 ml. Aggiungere 100,0 ml di acqua R, scaldare alcuni minuti a b.m.
agitando efficacemente sino a dispersione completa dell'unguento nella fase
acquosa, raffreddare e filtrare. Utilizzare la soluzione ottenuta.
Soluzione di riferimento. Disciogliere 100 mg di potassio ioduro R in acqua R, diluire
a 100,0 ml con lo stesso solvente e mescolare. Diluire 10,0 ml della soluzione
ottenuta a 100,0 ml con acqua R.
Il procedimento cromatografico può essere eseguito usando:
- una colonna di acciaio inossidabile lunga 3 cm e con diametro interno di 4,6 mm,
impaccata con base metacrilato ed ammina quaternaria alcanolica (7 mm);
Iodio unguento1
usare una precolonna lunga 7,5 mm e con diametro interno di 4,6 mm impaccata
con Io stesso riempimento della colonna non soppressore di anioni,
- come fase mobile una miscela di una soluzione (142,8 g/I) di sodio bicarbonato R
e una soluzione (190,8 g/1) di sodio carbonato R ad una velocità di flusso di 0,50
ml/min,
- come rivelatore un conduttimetro regolato a una sensibilità di 10 mS, con una
temperatura di cella fissata a 35°C e con polarità positiva.
Equilibrare la colonna non la fase mobile per almeno 1 h. Iniettare 20 ml della
soluzione di riferimento e della soluzione in esame. Determinare la quantità di
potassio ioduro nella soluzione in esame in base alle aree dei picchi ottenuti
rispettivame e per la soluzione di riferimento e per la soluzione in esame.
Iodio unguento2
Matricariae extractum hydroalcoolicum siccum, normatum
DEFINIZIONE
L'estratto secco idroalcoolico di camomilla si ottiene dalla Camomilla comune fiore (0404).
Contiene non meno dell’1,2 per cento di apigenina totale derivante dalla somma di apigenina
libera e apigenina contenuta nell'apigenina-7-glucoside e nell'apigenina-7-(6acetil)-glucoside.
DETERMINAZIONE QUANTITATIVA
Esaminare mediante cromatografia liquida (2.2.29).
Soluzione in esame. Disciogliere 250 mg in 25 ml di alcool al 30 per cento V/V R.
Soluzione di riferimento (a). Disciogliere 10,0 mg di apigenina R in 100 ml di una miscela di 1
volume di acqua R, 1 volume di metanolo R e 1 volume di diossano R.
Soluzione di riferimento (b). Disciogliere 2 mg di apigenina-7-glucoside R, 2 mg di apigenina-
7-(6-acetil)glucoside R e 2 mg di apigenina R in 100 ml di una miscela di 1 volume di acqua R,
1 volume di metanolo R e 1 volume di diossano R.
Il procedimento cromatografico può essere eseguito usando:
- una colonna A acciaio inossidabile lunga 0,22 m e con diametro interno di 4,6 mm
impaccata con gel di silice ottilsililato per cromatagrafia R o con gel di silice ottadecilsililato
per cromatagrafia R (5-10 mm).
Camomilla estratto idroalcoolico secco titolato1
- come fase mobilie acetonitrile R in percentuale variante, con gradiente lineare dal
10 per cento al 50 per cento in tampone citrato-fosfato soluzione a pH 2,4 R con
tempo di programmazione uguale a 100 min,
- come rivelatore uno spettrofotometro regolato a 335 nm,
- un registratore integratore avente la possibilità di programmare nel tempo le
funzioni di integrazione,
- un sistema di pompaggio idoneo ad assicurare un flusso di 1,0 ml per minuto.
Iniettare 10 ml di ciascuna soluzione. Preparare almeno 2 soluzioni di riferimento ed
analizzare per almeno 3 volte. Preparare almeno 3 soluzioni in esame ed analizzare
per almeno 3 volte.
Calcolare il contenuto di apigenina totale come somma di apigenina, apigenina-7-
glucoside e apigenina-7-(6-acetil)glucoside, tutti espressi come apigenina tenendo
conto dei rispettivi pesi molecolari.
Camomilla estratto idroalcoolico secco titolato2