Corso di

Tecniche diagnostiche in ematologia

• Struttura e funzione del sistema emopoietico

– Inquadramento fisiopatologico

– Tecniche di studio, cliniche e sperimentali

– Trapianto di cellule staminali

• Principali patologie ematologiche

– Inquadramento fisiopatologico

– Approccio diagnostico laboratoristico

– Approcci terapeutici innovatici

• Inquadramento anemie

• Neoplasie Mieloproliferative croniche

• Leucemia mieloide cronica

• Leucemie mieloidi acute

• Malattie linfoproliferative croniche

• Patologie delle piastrine

• Patologie congenite dei fattori della coagulazione

1

Libri di testo

• Non esiste alcun testo specifico consigliato, i seguenti

permettono di estrapolare agevolmente le necessarie

informazioni di fisiopatologia e diagnostica:

– Castoldi G, “Core Curriculum” Ematologia,

McGrawHill, 2009

– Castoldi - Liso, Malattie del sangue, McGrawHill,

2008

– Corradini P, Manuale di Ematologia, Minerva, 2009

2

Il materiale didattico verrà inserito nel sito

• http://www.ematologiafirenze.com

Sezione “DIDATTICA”

3

CELLULE CD34+

• 1-2% nel midollo

• 0.05% nel sangue periferico

• 0.3-0.5% nel sangue cordonale

• 0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato

• >> in condizioni patologiche (IM)

• LTR dopo terapia mieloablativa

• Proteina transmembrana

• Funzione non nota (adesione?)

• 105-120 kD

• Altamente glicosilata

• 3 epitopi diversi (mAb di tre classi)

• Varianti molecolari 4

VALUTAZIONE DEL SISTEMA EMOPOIETICO

La valutazione morfologica del sistema emopoietico

richiede i seguenti campioni:

SANGUE PERIFERICO

CITOASPIRATO MIDOLLARE

BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE

5

• video

6

7

BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE ASPIRATO MIDOLLARE

•Citomorfologia

•Reazioni citochimiche

•Reazione Perls

•Organismi intracellulari

•Tesaurociti

•Infiltrati linfocitari

•Infiltrati cellule non-emopoietiche

•Cellularità emopoietica

•Espressione delle diverse

filiere emopoietiche

•Organismi intracellulari-granulomi

•Tesaurismosi

•Infiltrati linfocitari

•Infiltrati cellule non-emopoietiche

•Stroma ed osso

8

9

10

11

Trapianto di

Cellule Staminali Ematopoietiche

Obbiettivo

- Ricostituzione di una normale

funzione ematopoietica alterata da: - Patologia a carico della cellula staminale

emopoietica

- Occupazione del tessuto osseo da parte di

malattia neoplastica

- Controllo della patologia: - Controllo della crescita neoplastica

- Immunoterapia 12

Modalità

Somministrazione di una chemio-radioterapia mieloablativa avente lo scopo di:

-Creare lo spazio midollare per l‟attecchimento del

trapianto (++++Allo; + Auto)

- determinare l‟immunosppressione necessaria per impedire il rigetto del trapianto (++++ Allo)

- Eradicare il clone neoplastico (++ Allo; ++++ Auto)

Infusione per via endovenosa delle CSE

Assistenza e terapia di supporto nel periodo successivo al trapianto

13

TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

• Autologo

• Singenico

• Allogenico • Da donatore familiare

• Da donatore non familiare volontario (MUD)

• Aploidentico

•Mieloablativo

•Non-mieloablativo; regimi ad intensità ridotta; “mini-allo”

14

“SORGENTI” DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

• Cellule midollari

• Cellule da sangue periferico [AUTO] – Reclutamento con ciclofosfamide + G-CSF

– Sullo sblocco di un ciclo chemioterapico “convenzionale/alte dosi sequenziali” +G-CSF

• Cellule da sangue periferico [ALLO] – Reclutamento con solo fattore di crescita (G-CSF)

• Cellule da sangue di cordone ombelicale

[cellule espanse ex-vivo] 15

DP

DQ

DR

B

A

E

C

COMPL

TNF-

HeatSP

CLASSE II

CLASSE III

CLASSE I

16

*

*= cromosoma 15 17

CARATTERISTICHE MHC I MHC II

Composizione

complesso MHC-

peptide

Catena polimorfica,

2-MG, peptide

Catene polimorfiche

e , peptide

Tipo di APC Tutte le cellule nucleate APC “professionali”

Cellule T responsive CD8+ (CTL) CD4+ (helper)

Origine dei peptidi Proteine del cytosol Proteine dagli

endosomi/ lisosomi (di

orgine extracellulare)

Sede di generazione

del peptide

proteasomi Endosomi / lisosomi

Meccanismi di

trasporto del peptide

TAP Non necessari

18

Indicazioni al trapianto di cellule staminali

emopoietiche

Auto Allo/MUD

“convenz”

“mini-allo” CB Aploiden.

Emopatie

neoplastiche + + + + +

Emopatie non

neoplastiche -* + - + -

Difetti congeniti

metabolismo -* + + + -/+

Neoplasie solide + -/+ + - -

M. autoimmuni + -/+ -/+ - -

* futuribile: terapia genica

19

-196 °C

20

21

22

- Agoaspirazioni multiple in anestesia generale a

partire dalla cresta iliaca anteriore (1/3) e

posteriore (2/3).

• - Raccogliere non meno di 200-300 milioni di

cellule nucleate/kg di peso corporeo

• - Filtrazione in sala operatoria per rimuovere

microaggregati e spicule ossee.

• - Trasferimento in laboratorio per la

manipolazione.

Raccolta

Trapianto Autologo di Cellule Staminali

Ematopoietiche di origine Midollare

23

Trapianto Autologo di Cellule Staminali

Ematopoietiche di origine Midollare

Manipolazione in Laboratorio • Deeritrocizzazione

• Deplasmazione

• Purging

• T-deplezione

• Selezione positiva e/o negativa

• Valutazione del contenuto in CD34+

• Prove di vitalità

• Prove di clonogenicità

Criopreservazione

24

Trapianto Autologo di Cellule Staminali

Ematopoietiche di origine Midollare

Criopreservazione

- Deeritrocizzazione e concentrazione fino a 200 milioni /ml. - Risospensione in una soluzione di plasma omologo contenete il 10% di Dimetilsulfossido (DMSO crioprotettore). - Congelamento automatico a caduta controllata fino a –120°C. - Stoccaggio delle cellule a temperature di –190°C - - La permanenza in queste condizioni può durare fino ad >>10 anni

25

Trapianto Autologo di Cellule Staminali

Ematopoietiche di origine Midollare

Reinfusione

• Le cellule vengono scongelate in bagnomaria a 37-38°C.

• Una volta scongelate devono essere reinfuse entro 30 minuti per evitare eccesso di mortalità cellulare.

• Prima dell‟infusione il paziente deve essere premedicato con cortisone perché il DMSO può indurre manifestazioni “allergiche”.

• L‟infusione avviene mediante filtro per evitare il passaggio di “clumps” formatisi per attivazione delle DNAasi derivante dalle cellule rotte.

• Durante l‟infusione è necessario monitorare attività cardiaca e respiratoria per scongiurare i rischi connessi con l‟infusione di DMSO soprattutto a dosi superiori ai 2 mg/kg.

26

Trapianto Autologo di

Cellule Staminali Ematopoietiche

di origine dal Sangue Periferico

Vantaggi

eliminazione del rischio anestesiologico

riduzione del rischio di contaminazione neoplastica

attecchimento rapido

Svantaggi

ipotetico rischio promuovente connesso alla somministrazione del G-CSF

rischi trombotici legati alla procedura alla somministrazione del G-CSF 27

Mediante procedura aferetica utilizzando separatori cellulari

dopo:

- Chemioterapia antiblastica:

I farmaci più “mobilizzanti sono la Ciclofosfamide e

l‟Etoposide.

- Chemioterapia + Fattori di Crescita Emopoietici:

Il G-CSF si è dimostrato il più efficace alla dose di 5-10

mcg/kg/di peso corporeo

- Fattori di Crescita Emopoietici (allogenico e autologo)

G-CSF alla dose di 10-16 mcg/kg/di peso corporeo

Trapianto Autologo di

Cellule Staminali Ematopoietiche

di origine dal Sangue Periferico

Modalità di raccolta

28

Trapianto Autologo di

Cellule Staminali Ematopoietiche

di origine dal Sangue Periferico

Modalità di raccolta

• Le raccolte iniziano quando nel sangue periferico sono

presenti almeno 20 cellule CD34+/mcl e ciò avviene

mediamente dopo:

– 10-14 giorni dall‟inizio della chemioterapia

– 5-7 giorni dall‟inizio della somministrazione del G-CSF 29

Trapianto Autologo di

Cellule Staminali Ematopoietiche

di origine dal Sangue Periferico

Modalità di raccolta

- Al momento della raccolta il donatore deve avere almeno 30

di Hct (10 gr di Hb/dL) e 30.000 Plt.

- Se il donatore pesa meno di 25 kg la procedura deve essere

innescata da una unità di GRC isogruppo irradiati e filtrati.

• - Le raccolte procedono fino a quando non siano state

raccolte una quantità di cellule CD34+ sufficienti ad effettuare

il programma trapiantologico e cioè almeno:

2,5 milioni/kg di peso corporeo per ogni

procedura nell‟autologo 30

Vantaggi:

Più rapida disponibilità del donatore

Barriera immunologica immatura

Minor incidenza di GVHD acuta e cronica

Svantaggi:

Ritardo nell‟attecchimento

Ritardato recupero immunologico

Ridotta disponibilità assoluta di progenitori CSE che ne condiziona l‟impiego nell‟adulto

Trapianto Allogenico di Cellule Staminali

Ematopoietiche da sangue placentare

31

Le “fasi” del trapianto autologo

Regime di condizionamento

Infusione di

c. staminali

Aplasia

Recupero della

funzione

emopoietica

Recupero della

funzione

immunologica

-10/-7 0 +15 --- +40 +90 --- >+365

32

Le “fasi” del trapianto allogenico

Regime di condizionamento

Infusione di

c. staminali

Aplasia

Recupero della

funzione

emopoietica

Recupero della

funzione

immunologica

-10/-7 0 +15 --- +40 +180 --- >+365

GVHD acuta

< +100

GVHD cronica

> +100

“graft-failure”

33

Trapianto di

Cellule Staminali Ematopoietiche

Complicanze precoci

Danni indotti dalla chemioterapia

Complicanze infettive

- Batteriche

- Fungine

- Virali

- Protozoarie

Malattia veno-occlusiva epatica

aGVHD

Rigetto

Cistite emorragica

Complicanze polmonari 34

TOLLERANZA

• La tolleranza nel trapianto si definisce

come l‟accettazione di cellule allogeniche

nel contesto dell‟organismo ricevente, in

assenza di terapia immunoppressiva

continuativa

35

GVHD

• ACUTA

– Entro 100 gg dal TMO (..ma non sempre…)

• CRONICA

– Oltre il terzo mese

36

da J Ferrara et al.

37

GRADO CUTE FEGATO INTESTINO

+ Rash maculopapulare,

<25%

Bilirubina, 2-3

mg/dL

Diarrea 500-

1000 ml/die

oppure

Nausea

persistente

++ Rash maculopapulare,

25-50%

Bilirubina, 3-6

mg/dL

Diarrea, 1000-

1500 ml/die

+++ Eritroderma generalizzato Bilirubina, 6-15

mg/dL

Diarrea, >1500

ml/die

++++ Desquamazione e bolle Bilirubina, >15

mg/dL

Dolore

addominale e/o

ileo paralitico

GVHD acuta

38

GvHD ACUTA

CUTE

Clinica Eritema maculopapulare + prurito o

bruciore, con evoluzione in bolle

Istologia Vacuolizzazione cellule basali

Apoptosi dei cheratinociti

Bolle alla giunzione dermoepidermica

Distacco dell„epidermide

39

GvHD ACUTA

GASTROINTESTINALE

Clinica Nausea, vomito

Diarrea acquosa e mucosa

+ sangue, + dolore, fino all„ileo paralitico

Istologia Singole apoptosi nelle cripte

Distruzione di singole cripte

Ulcerazioni focali

Denudazione completa della mucosa

40

GvHD ACUTA

FEGATO

Clinica Colestasi ( bilirubina, ALP, GGT)

Citolisi ( Transaminasi)

VOD

Istologia Ingrandimento e pleomorfismo nucleare, picnosi

nucleare e perdita di nuclei; singole cellule

apoptotiche

. Dedriti cellulari nel lume dei dotti biliari

. Piccoli linfociti negli spazi portali e soprattutto

nell„epitelio dei dotti bilari

. Colestasi generalmente presente

41

GvHD CRONICA

Aspetti clinici

Immunodeficienza combinata umorale e cellulare (la causa + frequente di morte sono le infezioni).

Compromissione della qualità di vita.

Correlazione con GVL.

Istopatologia

Danno cellulare epiteliale

Infiltrato cellulare mononucleare

Fibrosi

Ipocellularità e atrofia del sistema linfoide

42

GvHD CRONICA

• Mucosa Orale: atrofia, eritema, lesioni lichenoidi, slerodermia,

contratture articolari.

• Occhio: cheratocongiuntivite sicca, congiuntivite emorragica, formazione di pseudomembrane, lagoftalmo.

• Polmone: malattia polmonare ostruttiva, dispnea, tosse cronica, bronchiolite obliterante.

• App.Gastrointestinale: disfagia, odinofagia, dismotilità esofagea, perdita di peso.

• Fegato: iperbilirubinemia, ipetrtensione portale, cirrosi, insufficienza epatica.

• App. Neuromuscolare: dolore neuropatico, crampi muscolari, polimiositi

• Miscellanee: m. autoimmuni ( S. Sjogren, SLE, cirrosi biliare primitiva, artrite reumatoide, lichen planus)

43

GvHD CRONICA

44

HOST

HVG --> rejection

GVHD

GVL

GRAFT

45

46

Tecniche per lo studio del

chimerismo

• Cariotipo

• VNTR

• STR

• SNP

47

CHIMERISMO FISH XY

48

CHIMERISMO

Patient

Donor

Mixed chimerism at +30 (PB)

Mixed chimerism at +30 (CD3+)

Full chimerism at +60 (PB)

Full chimerism at +60 (CD3+)

STR

49